[논문]일엽추 추출물이 RANKL 유도 RAW264.7 Cell의 유전자 발현에 미치는 영향

이효근; 황귀서

[국내논문] 일엽추 추출물이 RANKL 유도 RAW264.7 Cell의 유전자 발현에 미치는 영향
Effects of Securinega suffructicosa(SS) Extract on Osteoclastogenesis and Gene Expression in RANKL-induced RAW Cell 원문보기

대한예방한의학회지 = Journal of Society of Preventive Korean Medicine, v.14 no.3, 2010년, pp.13 - 26

이효근 (경원대학교 한의과대학 예방의학교실) , 황귀서 (경원대학교 한의과대학 예방의학교실)

Abstract ▼ AI-Helper

Objectives : This study was performed to evaluate the effect of Securinega suffructicosa Rehder (SS) on osteoclast differentiation and gene expression. Methods : The osteoclastogenesis and gene expression were determined in RANKL-stimulated RAW 264.7. The results were summarized as followes. Results : SS decreased the number of TRAP positive cell in RANKL-stimulated RAW264.7 cell. SS decreased the expression of RANK, TNF${\alpha}$, and IL-6 in RANKL-stimulated RAW264.7 cell. SS decreased the expression of iNOS and COX-2 in RANKL-stimulated RAW264.7 cell. SS decreased the expression of Cathepsin K in RANKL-stimulated RAW264.7 cell. Conclusions : It is concluded that SS might decrease the bone resorption resulted from decrease of osteoclast differentiation and it's related gene expression.

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AI 본문요약
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문제 정의

본 연구에서는 골 흡수억제를 통해 골다공증에 효과적인 것을 밝히기 위하여 파골세포의 분화와 기능 활성화에 관여하는 인자들에 대한 효과를 평가하고자 하였다. 이를 위하여 RANKL로 자극한 RAW264.
7 cell에 RANKL과 TGFβ를 첨가한 배지로 배양한 경우 다수의 TRAP-positive 다핵세포가 형성되는 것이 관찰되었다. 이 세포를 파골세포로 하여 SS 추출물이 파골세포 생성에 미치는 영향을 평가하였다. 측정 결과, TRAP-positive 다핵세포 숫자는 50㎍/㎖의 농도를 가진 group은 Control에 비해 약 28% 감소하였고, 100㎍/㎖인 group은 Control에 비해 약 39% 감소하였다.
RANK는 RANKL의 수용체로서 RANK/RANKL 복합체는 파골세포 분화 및 활성화에 중요한 역할을 한다. 본 연구에서는 SS가 파골세포 기능에 관여하는 유전자들에 미치는 영향을 평가하는 일환으로 RANK의 발현에 미치는 영향을 RTPCR 및 real time PCR system을 이용하여 평가하였다. Fig.
본 연구에서는 SS가 유전자 발현을 조절하는 인자에 미치는 영향을 평가하는 일환으로 TNFα의 발현에 미치는 영향을 평가하였다.
PKA는 cAMP 의존적 protein kinase로 파골세포 기능 활성화와 인산화와 활성 증가를 유발한다. 본 연구에서는 SS가 세포성을 조절하는 인자에 미치는 영향을 평가하는 일환으로 IL-6의 발현에 미치는 영향을 평가하였다. 실험결과, SS는 200 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖ 농도에서는 억제 효과를 나타내었다(Fig.
이러한 증가된 NO는 파골세포형성과 골흡수를 억제한다. 본 연구에서는 SS가 유전자 발현을 조절하는 인자에 미치는 영향을 평가하는 일환으로 iNOS의 발현에 미치는 영향을 평가하였다. 실험 결과, Fig.
본 연구에서는 골흡수를 억제하여 골다공증에 효과적인 약재를 찾아내기 위하여, 일엽추 추출물(SS)이 RANKL 유도 RAW 264.7의 TRAP 양성세포 생성을 억제하는지를 검색하였다. RANKL 유도 RAW 264.
7세포는 많은 연구에서 osteoclastogenesis을 측정하는 모델 세포로 이용되고 있다(17). 또한, SS가 파골세포의 단백질 합성에 미치는 구체적인 작용기전 밝히기 위하여, 유전자 발현에 대한 검색을 실시하였다. TRAP은 성숙한 파골세포에서 발현하는 것으로 TRAP 양성세포는 파골세포로 분화 여부를 판단하는 기준으로 이용될 수 있다.
1). 이를 바탕으로 파골세포 기능에 관련되는 단백질을 합성하는 유전자 발현을 측정하여 구체적인 기전을 밝히고자 하였다. RANK(receptor activator of nuclear factot kappa B)는 파골세포 표면에 존재하는 TNF receptor family 단백질로 알려져 있다.
PKA의 활성 증가는 파골세포 기능 활성화와 인산화와 활성 증가를 유발한다.²²⁾ 본 연구에서는 SS가 세포성을 조절하는 인자에 미치는 영향을 평가하는 일환으로 IL-6의 발현에 미치는 영향을 평가하였다. 실험결과, SS는 억제 효과를 나타내었다(Fig.
이러한 증가된 NO는 파골세포 형성과 골흡수를 억제한다.^26-27) 본 연구에서는 SS가 유전자 발현을 조절하는 인자에 미치는 영향을 평가하는 일환으로 iNOS의 발현에 미치는 영향을 평가하였다. 실험 결과, Fig.
²⁸⁾ 따라서, 파골세포의 활성화로 인한 재흡수과정은 세포에서 발현되는 Cathepsin K는 MMP-9, TRAP의 mRNA를 지표로 사용하여 측정할 수 있다. 본 연구에서는 SS가 파골세포 기능에 관여하는 유전자들에 미치는 영향을 평가하는 일환으로 Cathepsin K의 발현에 미치는 영향을 RT-PCR 및 real time PCR system을 이용하여 평가하였다. 실험 결과, Fig.
이 연구에서는, 일엽추 추출물(SS)이 파골세포 분화 및 활성을 억제하여 골의 재흡수를 억제하는지를 평가하기 위하여, RANKL 유도 RAW 264.7 cell의 TRAP-positive 세포 형성에 미치는 영향을 측정하였으며, 골 흡수관련 인자들의 유전자 발현에 미치는 영향을 측정하여 다음과 같은 결과를 얻었다.

제안 방법

이를 위하여 RANKL로 자극한 RAW264.7 cell에서의 TRAP 생성능을 측정하였으며, 관련 유전자인 TRAP, OPG, RANK, Cathepsin K, COX-2, iNOS, TNFα 등의 발현을 측정하였다.
광대싸리 100g을 분말로 만들어 플라스크에 넣은 후, EtOH 500㎖를 가하고 6시간 이상 가열하여 환류 추출하였다. 여과지를 이용하여 여과한 다음, 여액을 Evaporator (EYELA, Japan)을 이용하여 감압 농축한 다음 농축액을 동결건조하여 실험 시까지 냉동보관 하였다. 실험 시에는 한약재 추출물(이하 SS라 함)을 DMSO를 이용하여 배지에 녹인 후, pore size 0.
실험군은 (1) RANKL 유도 대조군(C), (2) 50㎍/㎖의 한약재 추출물을 투여한 군(SS50), (3) 100㎍/㎖의 한약재 추출물을 투여한 군(SS100), (4) 200 ㎍/㎖의 한약재 추출물을 투여한 군(SS2100)으로 하였다.
RANKL로 RAW 264.7 cell을 파골세포로 유도한 후, 성숙한 파골세포의 발현 marker로 알려진 TRAP를 염색하여 TRAP-positive 세포를 확인하였다. 분화시킨 세포를 PBS로 세포를 2회 세척하고, 3.
7% formaldehyde-citrateacetone 용액으로 10분 고정시키고 증류수로 2회 세척하였다. 2% TRAP fast garnet GBC base 용액과 NaNO₃ 용액을 같은 비율로 섞어 만든 용액과 5% naphtha AS-BI phosphoric acid, 4% acetic acid, 2% tartaric acid를 포함한 용액을 고정시킨 세포에 처리하고 상온에 30분 이상 방치하였다. 광학현미경으로 관찰하여 핵이 3개 이상인 TRAP-positive한 다핵세포(TRAP(+) MNCs)를 계수하여 파골세포의 생성지표로 하였다.
2% TRAP fast garnet GBC base 용액과 NaNO₃ 용액을 같은 비율로 섞어 만든 용액과 5% naphtha AS-BI phosphoric acid, 4% acetic acid, 2% tartaric acid를 포함한 용액을 고정시킨 세포에 처리하고 상온에 30분 이상 방치하였다. 광학현미경으로 관찰하여 핵이 3개 이상인 TRAP-positive한 다핵세포(TRAP(+) MNCs)를 계수하여 파골세포의 생성지표로 하였다.
침전물을 75% EtOH로 2회 washing한 다음 건조시켰다. 유전자 발현에 필요한 RNA양을 대조군과 시험군에서 mRNA양이 같도록 조정한 다음, 전기영동으로 확인하여 사용하였다.
primer가 annealing 하도록 실온에서 약 10분간 방치한 후 4℃로 유지하며 다음 시약을 가하였다. 5 x cyscript buffer 4㎕, 0.1M DTT 2㎕, dUTP nucleotide mix 1㎕, dUTP Cydye-labelled nucleotide 0.l㎕, Cyscript reverse transcriptase 1㎕, H₂O 0.9㎕을 첨가하여 20㎕로 한 후, 아주 조심스럽게 손으로 tipping 혼합하였다. 이 후, 42℃에서 90분간 incubation 한 후, 얼음 상에 방치하였다.
oligo (dT)12-18 (Promega, USA), reaction buffer(50 mM Tris-HCl, 75 mM KCl, 3 mMMgCl2, 10 mM DTT, pH 8.3), 1 mM dNTP(Biotools, Spain)과 200 unit M-MLV-RT (Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase, Promega)를 분리한 RNA에 처리하여 역전사를 수행함으로써 cDNA를 합성하였다. PCR은 total volume 15㎕에 10X PCR buffer, 0.
3), 1 mM dNTP(Biotools, Spain)과 200 unit M-MLV-RT (Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase, Promega)를 분리한 RNA에 처리하여 역전사를 수행함으로써 cDNA를 합성하였다. PCR은 total volume 15㎕에 10X PCR buffer, 0.2 mM dNTPs, 2 pmole의 sense 및 antisense primer를 넣은 혼합액에 cDNA와 1.25 unit의 Taq polymerase (Biotools, Spain)을 넣어 PCR을 시행하였다.
Control로는 GAPDH를 사용하였으며 sense primer는 CAGC CTC GTC CCG TAG ACA AA이었으며, antisense는 CAC GAC ATA CTC AGC ACC GGC이었다. PCR 조건은 94℃ 4분, 30 cycles의 [94℃(30초), 59℃(30초), 72℃(45초)], 72℃ 10분이었다(Perkin Elmer, USA) 증폭된 PCR 산물을 2% agarose gel에 전기영동한다.
우선 시험관에 정량한 RNA 5㎍, 50 ng/㎕의 random hexamer 3㎕, 10mM dNTP 1㎕를 넣고 DEPC H₂O를 가하여 10㎕의 RNA/primer mixture를 만들었다. 실험용 sample을 65℃에서 5분간 incubation 시킨 후 1분 이상 얼음에 방치하였다.
iNOS의 sense primer는 AAT GGC AAC ATC AGG TCG GCC ATC ACT, antisense는 GCT GTG TGT CAC AGA AGT CTC GAA CTC를 사용하였으며, COX-2의 sense primer는 GGA GAG ACT ATC AAG ATA GT, antisense는 ATG GTC AGT AGA CTT TTA CA, TNFα의 sense primer는 ATG AGC ACA GAA AGC ATG ATC, antisense는 TAC AGG CTT GTC ACT CGA ATT을 사용하였다.
RNase 1㎕를 가하고 다시 37℃에서 20분간 incubation 시킨 다음, 사용시까지 -20℃에 보관하였다. 각각의 optical tube에 2배의 SYBR Green Mix 12.5㎕, cDNA 0.2㎕, 5 pmol/㎕ primer pair mix 1㎕, 11.3㎕ H₂O를 넣고, 50℃ 2분 1 cycle, 95℃ 10 min 1 cycle, 95℃ 15sec, 60℃ 30sec, 72℃ 30sec 40 cycles, 72℃ 10 min 1 cycle로 증폭시켰다. PCR을 마친 후 tube를 꺼낸 다음, 반응액 5 ul를 사용하여 3% agarose gel에서 PCR specificity를 측정했다.
PCR을 마친 후 tube를 꺼낸 다음, 반응액 5 ul를 사용하여 3% agarose gel에서 PCR specificity를 측정했다. SDS 7000 software를 사용하여 real time PCR 결과를 분석하였다.

대상 데이터

여과지를 이용하여 여과한 다음, 여액을 Evaporator (EYELA, Japan)을 이용하여 감압 농축한 다음 농축액을 동결건조하여 실험 시까지 냉동보관 하였다. 실험 시에는 한약재 추출물(이하 SS라 함)을 DMSO를 이용하여 배지에 녹인 후, pore size 0.45 um의 여과지를 통과시킨 후 사용하였다.
실험에 사용된 파골세포 전구세포는 mouse myeloid 세포주인 RAW 264.7 세포에 RANKL를 처리하여 유도된 세포 모델을 사용하였다. 사용된 RAW 264.
7 세포에 RANKL를 처리하여 유도된 세포 모델을 사용하였다. 사용된 RAW 264.7은 한국세포주은행에서 구입하였다.
5 M NaOH을 2㎕ 씩 가한 후 37℃에서 15분간 incubation하였으며, 2 M HEPES buffer(free acid)를 10㎕ 가하여 중화시켰다. 각각의 시약은 Amersham Bioscience에서 구입하였다.
RANK의 sense primer는 GCA AAC CTT GGA CCA ACT GCA C이었으며, antisense는 AAT CCA CCG TGC TTT CAG TCC C을 사용하였다. TRAP의 sense primer는 AGC AGC CAA GGA GGA CTA CGT T, antisense는 TCG TTG ATG TCG CAC AGA GG을 사용하였으며, Cathepsin K의 sense primer는 TTA ATT TGG GAG AAA AAC CT, antisense는 AGC CGC CTC CAC AGC CAT AAT를 사용하였다.
RANK의 sense primer는 GCA AAC CTT GGA CCA ACT GCA C이었으며, antisense는 AAT CCA CCG TGC TTT CAG TCC C을 사용하였다. TRAP의 sense primer는 AGC AGC CAA GGA GGA CTA CGT T, antisense는 TCG TTG ATG TCG CAC AGA GG을 사용하였으며, Cathepsin K의 sense primer는 TTA ATT TGG GAG AAA AAC CT, antisense는 AGC CGC CTC CAC AGC CAT AAT를 사용하였다. iNOS의 sense primer는 AAT GGC AAC ATC AGG TCG GCC ATC ACT, antisense는 GCT GTG TGT CAC AGA AGT CTC GAA CTC를 사용하였으며, COX-2의 sense primer는 GGA GAG ACT ATC AAG ATA GT, antisense는 ATG GTC AGT AGA CTT TTA CA, TNFα의 sense primer는 ATG AGC ACA GAA AGC ATG ATC, antisense는 TAC AGG CTT GTC ACT CGA ATT을 사용하였다.
RANK의 sense primer는 GCA AAC CTT GGA CCA ACT GCA C이었으며, antisense는 AAT CCA CCG TGC TTT CAG TCC C을 사용하였다. TRAP의 sense primer는 AGC AGC CAA GGA GGA CTA CGT T, antisense는 TCG TTG ATG TCG CAC AGA GG을 사용하였으며, Cathepsin K의 sense primer는 TTA ATT TGG GAG AAA AAC CT, antisense는 AGC CGC CTC CAC AGC CAT AAT를 사용하였다. iNOS의 sense primer는 AAT GGC AAC ATC AGG TCG GCC ATC ACT, antisense는 GCT GTG TGT CAC AGA AGT CTC GAA CTC를 사용하였으며, COX-2의 sense primer는 GGA GAG ACT ATC AAG ATA GT, antisense는 ATG GTC AGT AGA CTT TTA CA, TNFα의 sense primer는 ATG AGC ACA GAA AGC ATG ATC, antisense는 TAC AGG CTT GTC ACT CGA ATT을 사용하였다.

데이터처리

PCR 조건은 94℃ 4분, 30 cycles의 [94℃(30초), 59℃(30초), 72℃(45초)], 72℃ 10분이었다(Perkin Elmer, USA) 증폭된 PCR 산물을 2% agarose gel에 전기영동한다. 전기영동 결과 나온 band를 density 분석 프로그램인 Gel-Pro analyzer 3.1(Media Cybernetics. USA)을 이용하여 구했다.
각 결과에 대한 유의성 검증은 student’s t-test를 이용하였다.

성능/효과

이 세포를 파골세포로 하여 SS 추출물이 파골세포 생성에 미치는 영향을 평가하였다. 측정 결과, TRAP-positive 다핵세포 숫자는 50㎍/㎖의 농도를 가진 group은 Control에 비해 약 28% 감소하였고, 100㎍/㎖인 group은 Control에 비해 약 39% 감소하였다. 또한, 200㎍/㎖인 group도 Control에 비해 약 82% 감소하였다.
본 연구에서는 SS가 유전자 발현을 조절하는 인자에 미치는 영향을 평가하는 일환으로 TNFα의 발현에 미치는 영향을 평가하였다. 실험 결과, Fig. 6과 같이 SS는 200 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖ 농도에서 TNFa 유전자 발현을 억제하였다.
본 연구에서는 SS가 세포성을 조절하는 인자에 미치는 영향을 평가하는 일환으로 IL-6의 발현에 미치는 영향을 평가하였다. 실험결과, SS는 200 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖ 농도에서는 억제 효과를 나타내었다(Fig. 4).
또한, G-protein에 연계된 Adenylate Cyclase를 활성화시켜 cAMP-dependent PKA의 활성을 증가시키며, cAMP에 의존적인 RANKL과 OPG-osteoprotogerin의 작용을 거쳐 collagen을 분해하는 MMP의 유전 발현을 촉진하여 골의 재흡수에 관여한다. 실험결과, SS는 파골세포에서 COX-2 유전자 발현을 억제하였다(Fig. 5).
본 연구에서는 SS가 유전자 발현을 조절하는 인자에 미치는 영향을 평가하는 일환으로 iNOS의 발현에 미치는 영향을 평가하였다. 실험 결과, Fig. 6과 같이 SS는 200 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖ 농도에서 iNOS 유전자 발현을 억제시켰다.
따라서, 파골세포의 활성화로 인한 재흡수과정은 세포에서 발현되는 Cathepsin K 난 MMP-9, TRAP의 mRNA를 지표로 사용하여 측정할 수 있다. 실험 결과, Fig. 7과 같이 SS는 200㎍/㎖, 100㎍/㎖, 50 ㎍/㎖ 농도에서 Cathepsin K 발현을 억제하였다.
TRAP은 성숙한 파골세포에서 발현하는 것으로 TRAP 양성세포는 파골세포로 분화 여부를 판단하는 기준으로 이용될 수 있다. 실험 결과, 일엽추 추출물(SS)은 파골세포의 TRAP 양성 세포 형성을 억제시켰다(Fig. 1). 이를 바탕으로 파골세포 기능에 관련되는 단백질을 합성하는 유전자 발현을 측정하여 구체적인 기전을 밝히고자 하였다.
RANKL이 RANK와 결합하면 TRAF(tumor necrosis factor associated factor)가 활성화, transcription factor의 활성화 (NFκB, AP-1, NFATc1)와 MAPK의 pathway 활성화(ERK, JNK, p38), Src, Akt 이 활성화되어 파골세포의 기능이 활성화 된다(20). 실험결과, SS는 RANK 발현을 억제하였다(Fig 2).
본 연구에서는 SS가 유전자 발현을 조절하는 인자에 미치는 영향을 평가하는 일환으로 TNFα의 발현에 미치는 영향을 평가하였다. 실험 결과, Fig. 3과 같이 SS는 TNFa 유전자 발현을 억제하였다.
²²⁾ 본 연구에서는 SS가 세포성을 조절하는 인자에 미치는 영향을 평가하는 일환으로 IL-6의 발현에 미치는 영향을 평가하였다. 실험결과, SS는 억제 효과를 나타내었다(Fig. 4).
(2) SS는 RANKL 유도 RAW 264.7 세포에서 RANK, TNFα, IL-6의 발현을 억제하였다.
본 연구에서는 SS가 파골세포 기능에 관여하는 유전자들에 미치는 영향을 평가하는 일환으로 Cathepsin K의 발현에 미치는 영향을 RT-PCR 및 real time PCR system을 이용하여 평가하였다. 실험 결과, Fig. 7과 같이 SS는 Cathepsin K 발현을 억제하였다.
이상의 결과, 일엽추 추출물(SS)는 파골세포의 분화 및 기능을 증가억제 할 수 있는 것으로 평가되었으며, 이는 파골세포(OC)의 분화와 기능을 활성화시키는 유전자의 발현을 억제하여 나타나는 것으로 사료되었다.
(1) SS는 RANKL 유도 RAW 264.7의 TRAPpositive 세포의 형성을 억제하였다.
(3) SS는 RANKL 유도 RAW 264.7 세포에서 iNOS 및 COX-2의 발현을 억제하였다.
(4) SS는 RANKL 유도 RAW 264.7 세포에서 Cathepsin K의 발현을 억제하였다.
이상의 연구결과, 일엽추 추출물(SS)은 RANKL 유도 RAW 264.7 세포에서 파골세포로의 분화를 억제하였으며, 파골세포 분화 및 기능 활성화에 관련된 유전자 발현을 억제하였다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	골다공증의 유발 요인은 무엇인가?	그러나, 조골세포 활성이 저하되거나 파골세포 활성이 증가되면 골밀도가 감소하여 골다공증이 유발될 수 있다. 골다공증의 유발 요인으로는 여성의 폐경, 갑상선 기능항진, 당뇨병, 스트레스, 흡연 및 운동 부족, 신체적 노화와 glucocorticoid 계열 약물의 복용 등이 알려져 있다.1-3)
	일엽추는 어떤 과에 속하는 관목인가?	일엽추(一葉萩, Securinega suffructicosa Rehder)는 대극과에 속하는 관목인 광대싸리의 다른 이름이며, 엽하주(葉下珠), 화소조(花掃條), 서수라목(西水羅木), 구럭싸리라고도 부른다. 뿌리는 독성이 있어 주로 잎을 약용으로 사용한다.
	일엽추의 주성분은 무엇인가?	실제로 임상에서는 風濕腰痛, 四肢痲痺, 半身不遂, 陽萎, 顔面神經痲痺 등의 치료에 사용되고 있다.10) 주성분은 securinine, dihydrosecurinine이며,11) 그 밖에 corilagin, helioscopinin B, geraniin, bergenin, norbergenin, 11-O-galloyl norbergenin, gallocatechin, rutin 등이 알려져 있다.12) 주성분인 securinine은 CNS stimulant 작용과 GABA 저해 작용을 나타내며,13, 14) dihydrosecurinine은 acetylcholinesterase 활성을 저해하는 것으로 보고되었다.

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Zheng H, Yu X, Collin-Osdoby P, Osdoby P. RANKL stimulates inducible nitric-oxide synthase expression and nitric oxide production in developing osteoclasts. An autocrine negative feedback mechanism triggered by RANKL-induced interferon-beta via NF-kappaB that restrains osteoclastogenesis and bone resorption. J Biol Chem. 2006 ; 281(23) : 15809-20.

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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