본 연구는 돼지고기 원산지 식별에 활용될 수 있는 최적의 SNPmarker set을 개발 및 확립하기 위해 수행되었다. 선발된 51개의 SNP marker들의 효율성, 다형성 및 독립성 검증을 실시하였으며 51개의 SNP marker set은 MassARRAY method에 의해서 Multiplex-PCR panel 4개로 디자인 되었으며, 농장별, 생산조합별, 모돈별, 웅돈별로 효과적으로 고유 유전자형 지문분석이 가능하게 제작되었고, 다른형태의 SNP 유전자형 분석 플랫폼에 적용될 수 있는 적절한 마커 갯수이다. 또한 51개의 SNP marker set을 적용하여 모의 실험 및 친자감별확율을 계산하였을 때 무작위 교배 집단(PI), 반형매 교배집단($PI_{half-sib}$)과 전형매 교배집단($PI_{sibs}$)을 통해 모의 실험을 한 결과 $5.63{\times}10^{-33}$, $4.35{\times}10^{-15}$ 그리고 $1.32{\times}10^{-15}$로 분석되었으며 친자확인률에서도 모두 100%에 가까운 확률값을 나타내었다. 따라서 본 연구에서 개발된 SNP marker set을 이용하여 돈육제품의 원산지를 추적에 이용한다면 개별돼지의 고유한 DNA 지문 정보를 생성할 뿐만 아니라, 이를 통하여 모돈과 웅돈을 식별하여 농장원산지를 확인이 가능 할 수 있을 것으로 사료된다. 따라서 국내산 돼지의 생산에서부터 돈육제품으로의 소비까지 이력추적이 가능한 도구로 제공 될 것이다.
본 연구는 돼지고기 원산지 식별에 활용될 수 있는 최적의 SNP marker set을 개발 및 확립하기 위해 수행되었다. 선발된 51개의 SNP marker들의 효율성, 다형성 및 독립성 검증을 실시하였으며 51개의 SNP marker set은 MassARRAY method에 의해서 Multiplex-PCR panel 4개로 디자인 되었으며, 농장별, 생산조합별, 모돈별, 웅돈별로 효과적으로 고유 유전자형 지문분석이 가능하게 제작되었고, 다른형태의 SNP 유전자형 분석 플랫폼에 적용될 수 있는 적절한 마커 갯수이다. 또한 51개의 SNP marker set을 적용하여 모의 실험 및 친자감별확율을 계산하였을 때 무작위 교배 집단(PI), 반형매 교배집단($PI_{half-sib}$)과 전형매 교배집단($PI_{sibs}$)을 통해 모의 실험을 한 결과 $5.63{\times}10^{-33}$, $4.35{\times}10^{-15}$ 그리고 $1.32{\times}10^{-15}$로 분석되었으며 친자확인률에서도 모두 100%에 가까운 확률값을 나타내었다. 따라서 본 연구에서 개발된 SNP marker set을 이용하여 돈육제품의 원산지를 추적에 이용한다면 개별돼지의 고유한 DNA 지문 정보를 생성할 뿐만 아니라, 이를 통하여 모돈과 웅돈을 식별하여 농장원산지를 확인이 가능 할 수 있을 것으로 사료된다. 따라서 국내산 돼지의 생산에서부터 돈육제품으로의 소비까지 이력추적이 가능한 도구로 제공 될 것이다.
The purpose of the study was to develop an optimum SNP marker set to be utilized for domestic pork traceability. The study tested 51 SNP markers analyzed for origin of farm to be determined from genotypes of offspring and parents in pigs. With the simulation data through random mating population (PI...
The purpose of the study was to develop an optimum SNP marker set to be utilized for domestic pork traceability. The study tested 51 SNP markers analyzed for origin of farm to be determined from genotypes of offspring and parents in pigs. With the simulation data through random mating population (PI), half sib mating population ($PI_{half-sib}$) and full sib mating population ($PI_{sibs}$), probability of identical genotypes were analyzed as $5.63{\times}10^{-33}$, $4.35{\times}10^{-15}$ and $1.32{\times}10^{-15}$, respectively. The 51 SNP markers also had 100% accuracy for parental determination. These results suggest that if the pig breeding stock is genotyped with the 51 SNP markers, the genotype information of individual offspring can be checked for farm origins by tracing parental sow and sire. Therefore, these SNP markers will be useful to trace the pork from production to consumption in pigs.
The purpose of the study was to develop an optimum SNP marker set to be utilized for domestic pork traceability. The study tested 51 SNP markers analyzed for origin of farm to be determined from genotypes of offspring and parents in pigs. With the simulation data through random mating population (PI), half sib mating population ($PI_{half-sib}$) and full sib mating population ($PI_{sibs}$), probability of identical genotypes were analyzed as $5.63{\times}10^{-33}$, $4.35{\times}10^{-15}$ and $1.32{\times}10^{-15}$, respectively. The 51 SNP markers also had 100% accuracy for parental determination. These results suggest that if the pig breeding stock is genotyped with the 51 SNP markers, the genotype information of individual offspring can be checked for farm origins by tracing parental sow and sire. Therefore, these SNP markers will be useful to trace the pork from production to consumption in pigs.
* AI 자동 식별 결과로 적합하지 않은 문장이 있을 수 있으니, 이용에 유의하시기 바랍니다.
문제 정의
35)을 이용하여 친자감별력을 모의 실험한 결과 50개의 SNP 마커 조합일 때 거의 100%의 감별력을 수행할 수 있음을 보고 하였다. 따라서 본 연구는 국내산 돼지고기의 원산지 검증에 활용될 수 있는 SNP 마커들의 조건을 확립하고자 수행하였다.
본 연구는 국내산 돼지고기 원산지 검증의 수단으로 DNA 검사 방법에 활용 가능한 SNP Marker의 선발과 marker set의 구축을 위해 수행되었다. Li 등(2008)은 NCBI 돼지 SNP 데이터베이스 (http://www.
제안 방법
, Ltd, USA) 를 이용하여 genomic DNA를 분리하여 이용하였다. DNA 정량 분석은 spectrophotometer (Pharmacia Biotech, England)를 이용하여 260 nm~280 nm에서 흡광도를 측정하여 DNA의 농도와 순도를 확인하였다.
세 번째, iPLEX 반응을 하기 위해 10 × iPLEX buffer 0.755㎕, iPLEX termination mix 0.200㎕, extension primer 7uM, iPLEX enzyme 0.0041㎕와 Nanopure H2O를 사용하여 반응액은 2㎕로 하였다.
SAP treatment 반응액 조성은 10 × SAP buffer 0.170㎕, SAP enzyme 0.4U와 Nanopure H2O를 사용하여 총 반응액 2 ㎕ 로 하였다.
MassARRAY Design Software (Sequenom Inc, San Diego, USA)를 이용하여 51개의 SNP들의 분석을 위한 Multiplex PCR primer들과 4개의 SNP genotyping panel 고안하였다. PCR Primer를 이용하여 Multiplex PCR을 수행하여 증폭한 후 4개 panel들의 extension primer를 이용하여 MassARRAY method로 유전자형 분석을 하였다(Storm 등, 2003; Tang 등, 2003)
첫 번째, multiplex-PCR 반응액 조성은 PCR reaction buffer 10 mM (Tris-HCl, pH8.3, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2)와 2.5mM dNTPs, 10 pmol first and second primer pairs, 10ng의 template DNA, 0.5 U h-Taq DNA polymerase (Bioneer Co., Ltd)와 Nanopure H2O를 사용하여 총 반응액은 10㎕로 하였다. PCR 반응에는 ABI GeneAmp PCR System 9700(PerkinElmer Co.
, Ltd)와 Nanopure H2O를 사용하여 총 반응액은 10㎕로 하였다. PCR 반응에는 ABI GeneAmp PCR System 9700(PerkinElmer Co., USA)를 사용하였고, PCR 조건은 95℃에서 15분간 pre denaturation 한 후 95℃에서 20초간 denatruation, 56℃에서 30초간 annealing, 그리고 72℃에서 1분간 extention을 45 cycles 수행한 후 마지막으로 72℃에서 3분간 최종 extention 과정을 수행하였다. PCR 증폭 산물은 증폭된 단편의 크기가 예상된 allele size 범위 내에 존재하는지, PCR 조건의 적정성 여부를 확인하기 위하여 EtBr (ethidium bromide)이 포함된 2% agarose gel에 전기영동하고 UV상에서 관찰하였다.
, USA)를 사용하였고, PCR 조건은 95℃에서 15분간 pre denaturation 한 후 95℃에서 20초간 denatruation, 56℃에서 30초간 annealing, 그리고 72℃에서 1분간 extention을 45 cycles 수행한 후 마지막으로 72℃에서 3분간 최종 extention 과정을 수행하였다. PCR 증폭 산물은 증폭된 단편의 크기가 예상된 allele size 범위 내에 존재하는지, PCR 조건의 적정성 여부를 확인하기 위하여 EtBr (ethidium bromide)이 포함된 2% agarose gel에 전기영동하고 UV상에서 관찰하였다.
두 번째, dNTP를 제거하기 위해 SAP treatment 과정을 실시하였다. SAP treatment 반응액 조성은 10 × SAP buffer 0.
0041㎕와 Nanopure H2O를 사용하여 반응액은 2㎕로 하였다. iPLEX 반응조건은 95℃에서 30초간, 95℃에서 5초간, 52℃에서 5초간, 80℃에서 5초간 수행한 후, 세 번째 step에서 5 cycle 수행, 그리고 두 번째 step 에서 다시 40 cycle 수행한 후 72℃에서 3분간 처리하였다. 384 well에서 SpectroCHIP (Sequenom SpectroCHIP®)으로 sample 이동 후 MALDI-TOF mass spectrometry (Sequenom Compact System)를 이용하여 유전자형을 관찰하였으며, 유전자형은 Sequenom의 SNP 분석 프로그램인 Typer 4.
gov/projects/SNP/)에 등재되어 있는 5450개의 염기서열을 재분석 하였으며, 이를 통해 확인된 총 1787개의 SNP들을 보고하였다. 그 중 염색체 별로 돼지개체식별을 위한 SNP 유전자형 분석을 실시하였으며, 돼지품종식별과 유전능력에 지표가 될 수 있는 SNP 마커(data not shown)를 고려하면서, 높은 다형성 지수 및 독립성을 검증하여 최종 51개의 SNP들을 선발 하였다(Table 1). CERVUS version 3.
대상 데이터
충북 청원군에 소재한 농장에서 사육중인 모돈(n=180)으로부터 생산된 비육돈(n=400)의 이표정보와 교배정보를 본 실험에 이용하였다. 비육돈 생산에 이용된 총 F0, F1과 F2 총 437두의 조직 300g으로부터 DNeasy Tissue kit (QIAGEN.
충북 청원군에 소재한 농장에서 사육중인 모돈(n=180)으로부터 생산된 비육돈(n=400)의 이표정보와 교배정보를 본 실험에 이용하였다. 비육돈 생산에 이용된 총 F0, F1과 F2 총 437두의 조직 300g으로부터 DNeasy Tissue kit (QIAGEN. Co., Ltd, USA) 를 이용하여 genomic DNA를 분리하여 이용하였다. DNA 정량 분석은 spectrophotometer (Pharmacia Biotech, England)를 이용하여 260 nm~280 nm에서 흡광도를 측정하여 DNA의 농도와 순도를 확인하였다.
본 실험에 사용된 SNP marker는 Li 등(2008)의 보고에 의해 확인된 총 1787 개의 SNP중 162개를 기초로 하여, 상염색체상의 위치와 다형성 정보가 높은 51개의 SNP 마커들을 선정하여 이용하였다(Table 1).
데이터처리
384 well에서 SpectroCHIP (Sequenom SpectroCHIP®)으로 sample 이동 후 MALDI-TOF mass spectrometry (Sequenom Compact System)를 이용하여 유전자형을 관찰하였으며, 유전자형은 Sequenom의 SNP 분석 프로그램인 Typer 4.0 (또는 3.0)을 이용하여 결과 확인 및 오류 분석을 수행하였고, 마이크로소프트 Excel 프로그램을 이용하여 최종 데이터를 정리하였다.
51개의 SNP 마커들의 농장원산지 식별력을 추정하기 위한 모의실험을 실시하였는데 추정된 통계량을 이용하여 무작위교배집단, 반형매 교배집단 그리고 전형매 교배집단으로 가정하여, 동일한 SNP 유전자형의 출현확률(probability that two randomly chosen individuals have identical genotypes; PI, probability of identify from half sib; PIhaif-sibs, and probability of identity from sibs; PIsib)과 부돈과 모돈의 친자감정률(exclusion probability: first parent; NE-1P and exclusion probability: second parent; PE)을 CERVUS version 3.0을 이용하여 분석하였으며, 그 결과는 Table 3에 정리하였다. 51개의 SNP marker set 을 이용하여 친자를 추정한 결과 무작위 교배집단의 PI는 5.
이론/모형
또한 독립성 검증 분석을 위해 Stephens method 적용하여 계산된 D’ 및 r 2 값을 이용하였다(Stephens와 Donnelly, 2003).
MassARRAY Design Software (Sequenom Inc, San Diego, USA)를 이용하여 51개의 SNP들의 분석을 위한 Multiplex PCR primer들과 4개의 SNP genotyping panel 고안하였다. PCR Primer를 이용하여 Multiplex PCR을 수행하여 증폭한 후 4개 panel들의 extension primer를 이용하여 MassARRAY method로 유전자형 분석을 하였다(Storm 등, 2003; Tang 등, 2003)
가축의 원산지(부모) 추정에 이용할 효율적인 DNA 마커를 선택하기 위한 마커들 간의 다형성 정보 분석을 위해 Barrett 등 (2005)의 Likelihood method 적용하였고, Stephens과 Donnelly (2003)의 마커들 간의 독립성을 측정하는 방법을 이용하였다. 유전자형 정보를 이용하여 원산지 추정은 친자감별 프로그램인 CERVUS version 3.
가축의 원산지(부모) 추정에 이용할 효율적인 DNA 마커를 선택하기 위한 마커들 간의 다형성 정보 분석을 위해 Barrett 등 (2005)의 Likelihood method 적용하였고, Stephens과 Donnelly (2003)의 마커들 간의 독립성을 측정하는 방법을 이용하였다. 유전자형 정보를 이용하여 원산지 추정은 친자감별 프로그램인 CERVUS version 3.0 프로그램(www. fieldgenetics.com)를 이용하였는데, 친자감별시 확률적인 표현은 John 등(2005)의 방법을 이용하여 paternity index (PI) 및 probability of paternity (PP)를 사용하였고 계산방법은 다음과 같다.
성능/효과
0 프로그램을 이용하여 분석된 SNP marker 별 기대 이형접합성(expected heterozygosity), 관측 이형접합성(observed heterozygosity)와 마커다형정보 지수(PIC: Polymorphism Information Content) 등의 추정치는 Table 1에 나타내었다. 총 51개의 SNP 마커들의 평균 기대 이형 접합성은 0.476으로 나타났으며, 평균 관측 이형접합성은 0.435로 나타났다. 또한 선발된 51개의 SNP 마커들의 평균 Minor allele frequency는 0.
435로 나타났다. 또한 선발된 51개의 SNP 마커들의 평균 Minor allele frequency는 0.344로 나타났으며 또한 모두 하디와인버그 평형의 조건을 만족하였다. 또한 독립성 검증 분석을 위해 Stephens method 적용하여 계산된 D’ 및 r 2 값을 이용하였다(Stephens와 Donnelly, 2003).
51개의 SNP marker set 을 이용하여 친자를 추정한 결과 무작위 교배집단의 PI는 5.63×10－33으로 나타났으며, 반형매 교배집단의 PIhalf-sib 값은 4.35×10－15로 관찰되었고, 나머지 전형매 교배집단 PIsibs는 1.32×10－15으로 분석되었다.
본 연구에서 확립한 51개 SNP 마커의 조합으로 나온 결과는 최근 60개의 SNP marker set 을 이용하여 보고된 미국의 듀록, 햄 프셔, 랜드레이스와 요크셔 4 품종의 순수 웅돈으로부터 교배되어 생산된 자돈을 이용하여 모의실험 결과 4.6×10－23 보다 높은 품종 식별 및 개체식별력으로 나타났다(Rohere 등, 2007).
또한 부돈이나 모돈중 하나의 부모만 모를 경우 부돈을 찾을 확율은 0.99997780으로 나타났고, 모돈을 찾을 확률은 >0.99999999으로 모두 100%에 가까운 친자확인 확률값을 나타냈다.
061로 매우 낮게 나타났다. 이러한 결과는 51개의 SNP 마커들의 조합은 독립적이며 연관성이 전혀 없음을 의미한다 (Table 2). MassARRAY 방법은 실험적인 에러율이 낮으며 정확한 유전자형 분석방법으로 보고되고 있다(Rohrer 등, 2007; Hill 등, 2008),
후속연구
이러한 결과는 사용된 분석집단의 차이뿐만 아니라 사용되어진 SNP 마커의 다형성과 마커간의 연관성의 차이에 따른 것으로 사료된다. 이상의 결과를 국내산 돈육의 원산지 식별에 적용되기 위해서는 다양한 농장의 규모 및 부돈과 모돈의 교배기록을 이용하여 추가적인 연구를 수행하여야 하지만, 본 연구에서 개발한 SNP panel별로 생성된 유전자형 지문정보를 이용할 경우 국내에서 생산된 돼지개체의 농장원산지 식별 할 수 있는 수단이 될 수 있을 것으로 사료 된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
WTO 출범 이후 돼지고기의 수입량과 수입산 돼지고기 유통량은 어떻게 변했는가?
WTO 출범 이후 국제무역 환경 속에서 돼지고기의 수입량은 매년 늘어나고 국내시장의 수입산 돼지고기 유통량이 나날이 증가하고 있지만, 유통과정에서 원산지를 검증하기 어렵기 때문에 외국산 돼지고기를 국내산으로 판매하여 소비자 및 생산농가들에게 모두 피해를 발생하고 있다. 또한 원산지 표시 실태 및 단속현황 조사결과 돼지고기가 가장 위반건수가 높은 품목으로 조사되었다(농림수산식품부, 2008).
돼지고기의 수입의 문제점은 무엇인가?
WTO 출범 이후 국제무역 환경 속에서 돼지고기의 수입량은 매년 늘어나고 국내시장의 수입산 돼지고기 유통량이 나날이 증가하고 있지만, 유통과정에서 원산지를 검증하기 어렵기 때문에 외국산 돼지고기를 국내산으로 판매하여 소비자 및 생산농가들에게 모두 피해를 발생하고 있다. 또한 원산지 표시 실태 및 단속현황 조사결과 돼지고기가 가장 위반건수가 높은 품목으로 조사되었다(농림수산식품부, 2008).
돼지의 혈통 정보를 확인하거나 생산이력추적을 하기 위한 DNA marker 개발이 활발해진 이유는 무엇인가?
또한 원산지 표시 실태 및 단속현황 조사결과 돼지고기가 가장 위반건수가 높은 품목으로 조사되었다(농림수산식품부, 2008). 현재 돼지고기의 원산지를 판별 할 수 있는 방법은 관능적인 판별방법을 이용하고 있으나, 정확하게 원산지를 판별할 수 있는 체계적이고 과학적인 방법은 현재 미흡한 상황이다. 국내산 돼지고기들의 유통과정 검증은 국내산과 수입산의 원산지를 판별 할 수 있는 강력한 수단으로 활용할 수 있으며, 또한 종돈개량 및 양돈산업의 경쟁력 강화를 위하여 중요한 정보로 활용될 수 있다. 따라서 가계(혈통) 정보를 확인하거나 생산이력추적을 하기 위한 DNA marker에 대한 연구들이 활발히 이루어지고 왔다 (Heaton 등, 2002; Werner 등, 2004; Dodds 등, 2005; Eenen- naam 등, 2007; Gomez‐Raya 등, 2008).
참고문헌 (21)
Anderson, E. C. and Garza., J. C. 2006. The power of singlenucleotide polymorphisms for large-scale parentage inference. Genetics 172:2567-2582.
Eenennaam, A. L. V., Weaber, R. L., Drake, D. J., Penedo, M. C. T., Quaas, R. L., Garrick, D. J. and Pollak, E. J. 2007. DNA-based paternity analysis and genetic evaluation in a large, commercial cattle ranch setting. J. Anim. Sci. 85:3159-3169.
Gomez-Raya, L., Priest, K., Rauw, W. M., Okomo-Adhiambo, M., Thain, D., Bruce, B., Rink, A., Torell, R., Grellman, L., Narayanan, R. and Beattie, C. W. 2008. The value of DNA paternity identification in beef cattle: Examples from Nevada's free-range ranches. J. Anim. Sci. 86:17-24.
Heaton, M. P., Harhay, G. P., Bennett, G. L., Stone, R. T., Grosse, W. M., Casas, E., Keele, J. W., Smith, T. P. L., Chitko- McKown, C. G. and Laegreid, W. W.. 2002. Selection and use of SNP markers for animal identification and paternity analysis in US beef cattle. Mamm. Genome 13:272-281.
Hill, W. G., Salisbury, B. A. and Webb, A. J. 2008. Parentage identification using SNP genotypes: application to product tracing. J. Anim. Sci. 86:2508-2517.
Honda, T., Katsuta, T. and Mukai, F. 2009. Simulation Study on Parentage Analysis with SNPs in the Japanese Black Cattle Population. Asian-Aust. J. Anim. Sci. 10:1351-1358.
Jones, A. G. 2005. GERUD2.0: A computer program for the reconstruction of parental genotypes from half-sib progeny arrays with known or unknown parents. Mol. Ecol. Notes. 5:708.
Kaul, R., Singh, A., Vijh, R. K., Tantia, M. S. and Behl, R. 2001. Evaluation of the genetic variability of 13 microsatellite markers in native Indian pigs. J. Genet. 80:149-153.
Li, X. P., Hu, Z. L., Moon, S. J., Do, K. T., Ha, Y. K., Kim, H., Byun, M. J., Choi, B. H., Rothschild, M. F., Reecy, J. M. and Kim, K. S. 2008. Development of an in silico coding gene SNP map in pigs. Anim. Genet. 10:1365-2052.
Lim, H. T., Seo, B. Y., Jung, E. J., Yoo, C. K., Zhong T., Cho, I. C., Yoon, D. H., Lee, J. G. and Jeon, J. T. 2009. Establishment of a microsatellite marker set for individual, pork brand and product origin identification in pigs. K. J. Anim Sci & Tech. 3:201-206.
Rohrer, G. A., Freking, B. A. and Nonneman, D. 2007. Single nucleotide polymorphisms for pig identification and parentage exclusion. Anim. Genet. 38:253-258.
Stephens, M. and Donnelly, P. 2003. A comparison of Bayesian methods for haplotype reconstruction from population genotype data. Am. J. Hum. Genet. 73:1162-1169.
Thompson, C. L., Baechle, D., Lu, Q., Mathew, G., Song, Y., Iyengar, S. K., Gray-McGuire, C. and Goddard, K. A. 2005. Effect of genotyping error in model-free linkage analysis using microsatellite or single-nucleotide polymorphism marker maps. BMC. Genet. 6:S153.
Ulgen, A. and Li, W. 2005. Comparing single-nucleotide polymorphism marker-based and microsatellite marker-based linkage analyses. BMC. Genet. 10:1471-2156.
Werner, F. A. O., Durstewitz, G., Habermann, F. A., Thaller, G., Kramer, W., Kollers, S., Buitkamp, J., Georges, M., Brem, G., Mosner, J. and Fries, R. 2004. Detection and characterization of SNPs useful for identity control and parentage testing in major European dairy breeds. Anim. Genet. 35:44-49.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.