[논문]Xenopus oocyte에서 애기장대 AtPIP2-1 활성측정을 위한 발현 최적화 조건 규명

김현미; 황현식; 이석찬; 조수현; 김범기

doi:10.3839/jabc.2010.034

Xenopus oocyte에서 애기장대 AtPIP2-1 활성측정을 위한 발현 최적화 조건 규명
The Optimization for Functional Expression of Arabidopsis Thaliana AtPIP2-1 in Xenopus laevis Oocyte 원문보기

Journal of applied biological chemistry, v.53 no.4, 2010년, pp.189 - 194

김현미 (농촌진흥청 국립농업과학원 농업생명자원부 신작물개발과) , 황현식 (농촌진흥청 국립농업과학원 농업생명자원부 신작물개발과) , 이석찬 (성균관대학교 유전공학과) , 조수현 (강원대학교 의학전문대학원 생리학교실) , 김범기 (농촌진흥청 국립농업과학원 농업생명자원부 신작물개발과)

초록
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Xenopus oocyte을 이용하여 식물 aquaporin 단백질의 물 흡수 활성을 측정하기 위한 최적의 조건을 확립하기 위하여 애기장대의 AtPIP2-1유전자를 클로닝하여 cRNA 제작용 vector, buffer osmolarity, hypoosmotic shock 처리시간, 발현 단백질의 localization등을 검토한 결과, Xenopus ${\beta}$-globin 유전자의 5'과 3' UTR(untranlation region)'염기서열을 갖고 있는 pGEMHE vector가 단백질 생산에 더욱 효과적이며, 이 vector를 시용하였을 경우 hypoosomotic stress는 1/2ND buffer에서 6분간 처리시 가장 큰 차이를 볼 수 있었으며, 애기장대 AtPIP2-1단백질과 GFP를 결합시켜 발현시킬 경우 GFP가 plasmamembrane에 위치하는 것을 보아 올바른 subcelluar localization이 이루어지는 것을 확인할 수 있었다.

Abstract ▼ AI-Helper

We confirmed the hypo-osmotic shock strengths and duration, different type of vectors, and subcelluar localization to identify the optimum analysis condition of plant aquaporin activity in Xenopus ooctye using Arabidopsis thaliana AtPIP2-1 gene. Six minutes and 1/5ND buffer hypoosmotic shock treatment was the best condition to show the maximum swelling of Xenopus oocytes where AtPIP2-1 was expressed using pcDNA3.1 vector. AtPIP2-1 protein was expressed more efficiently in pGEMHE vector which has 5' and 3' UTR (untranslation region) of Xenopus ${\beta}$-GLOBIN gene in multiple cloning site than in pcDNA3.1 vector. Also green fluorescence of GFP fused to AtPIP2-1 was detected onto oocyte plasmamembrane where is the proper subcellular localization target of AtPIP2-1.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

이로 인한 부피 변화를 측정하여 aquaporin 활성을 측정하게 된다. 동일한 PIP2-1 단백질을 발현시킨 다 하여도 Xenopus oocyte의 swelling assay는 외부완충 용액의 hypoosmotic 조건에 따라 크게 변화하게 되므로 본 실험에서는 PIP2-1의 활성 측정을 위한 최적의 hypoosmotic 조건을 규명하고자 실험을 실시하였다. Fig.
계산하는 방법이다[Preston 등, 1992]. 저자들은 Xenopus oocyte을 이용하여 식물체의 PIP2-1 단백질의 water channel 활성을 측정하기 위한 최적의 조건을 확립하는 실험들을 수행하여 식물체의 water channel 연구를 위한 기본적인 정보를 제공하고자 한다.

가설 설정

(A) Swelling assay was performed inl/2ND96 butler condition. (B )SweIling assay was perfonned in 1/5ND96 buffer condition. Data were given as the mean±SE (n>5).

제안 방법

3주간 배양된 어린 애기장대를 액체질소 와 막자 사발을 이용하여 완전히 마쇄 한 후 RNeasy extraction kit (Quiagen, Maiyland, USA)를 사용하여 RNA< 추출하였다. Total RNA는 1.
2% 포름알데하이드 아가로즈 겔을 통하여 확인 하였다. RNA로부터 SuperScript Ⅲ First-strand Synthesis System For RT-PCR kit(Invitrogen, Carlsbad, California, USA) 를 사용하여 cDNA를 합성하였다. Xenopus oocyte 발현용 운반체로서는 pcDNA3.
합성. Xenopus oocyte 발현용 운반체를 선형화 시킨 후 mMESSAGE mMACHINE high capped RNA Transcription Kit(Ambion, Austin, TX, USA» 사용하여 전사반응을 통하여 cRNA(complementary RNA)를 합성하였다. DNase로 운반체 DNA를 완전히 제거한 후 Lithium chloride 침전 반응을 통하여 RNA를 회수 하여 20μL DEPC water에 녹였다.
Xenopus oocyte 발현용 운반체로서는 pcDNA3. l/Zeo(-)(Invitrogen, Carlsbad, California, USA), pGEMHE 그리고 pGEMHE-GFP vector를 사용하였다 [Liman 등, 1992], 이들 각각의 운반체로 AtPIP2-l유전자를 클로닝 하기 위하여 primer(pcDNA F-AAGAATTCATGGCAAAG GATGTGGAA, pcDNA R-AAGGATCCTIAGAGrTGGCAGC ACT), (pGEMHE F-AAGGATCCAATGGCAAAGGATGTGG AA, pGEMHE R-AAAAGCTTTTAGACGTTGGCAGCACT), (pGEMHE-GFP F-AAGGATCCATGGCAAAGGATGTGGAA, Pgemhe-GFP R-AAGAATTCAGACGITGGCAGCACTTCT) 를각각 사용하여 PCR을 통해 A1PIP2-1 유전자를 증폭 한 후, 제한효소 EcoRVBamHI, BamHi/HindHl, Ba湖표/EcoRI으로 처리 후 DNA Ligation kit ver3.1(TaKaRa, Tokyo, Japan)로 ligation 하고 대장균 DH₅a에 형질 전환하여 유전자를 클로닝하였다.
개구리는 Xenopus laevis을 사용하였으며, 얼음 마취를 통해 개구리를 해부하여 oocyte을 꺼내 Barth's solution(10 mM HEPES, 88 mM NaCl, ImM KC₁, 2.4 mM NaHCo3, 0.4 mM CaCl2, 0.33 mM Ca(No3)2, ImM MgSO₄, pH 7.4)冶로 옮겨 해부 현미경으로 관찰하며 포셉으로 포막을 제거하였다. 막이 제거된 oocyte는 50 p, g/mL gentamycin°l 첨가된 Barth's solution으로 옮겨 17℃ 에서 하루 동안 안정화하였다.
이를 위하여 Geiger 등(2010)은 oocyte 에서 GFP(Green fluorescent protein)을 이용하여 유전자의 발현을 확인하는 실험을 하였으며, BiFC(Bimolecular fluorescent complementation) 와같은 단백질 상호작용과 complex의 localizatione 확인하는 실험을 수행하여 보고하였다(Geiger 등, 2010). 본 실험에서도 PIP2-1 단백질의 발현과 세포 내 위치를 확인하기 위하여 pGEMHE vector0]] GFP(Green fluorescent protein)가 융합돤 vector에 PIP2-1 를 클로닝하고 이를 cRNA에 주입하여 Green fluorescent를 확인하였다. Fig.
애기장대(4w况初wis thaliana cloumbia 0)를재료로 사용하였다. 종자를 Isopropanol에서 3분간, 50% 락스에서 2분간 정치 배양하여 멸균수로 3회 세척한 후, 종자를 배지에 고정시키기 위해 0.1% agarose에 현탁 하여 1/2 MS (Murashige skoog) 고체배지에 치상하였다. 4℃ 암 조건에서 2 일간 배양 후 22。。장일 조건으로 옮겨 3주간 배양 하였다.
Water channel 활성 측정. 주입한 cRNA의 안정적인 발현을 위해 주입 후 17℃ 조건하에 3일 간 50 gg/mL gentamycin0] 첨가된 Barth's solution에서 배양 한 후 water channel 활성을 측정하였다 Barth, s solution에서 유지 되었던 oocyte를 5배 또는 2배로 희석시킨 ND96용액(96mM NaCl, 5mM HEPES, ImM MgCL, 2mM KC₁, 1.8mM CaCl2, pH 7.4)으로 옮긴 후 Nikon SMZ1500 해부 현미경을 이용하여 oocyte를 관찰 하고 카메라를 통하여 oocyte 부피 변화를 1분 간격으로 사진을 찍었다. NIS-Elements BR 3.

대상 데이터

식물체 생육. 애기장대(4w况初wis thaliana cloumbia 0)를재료로 사용하였다. 종자를 Isopropanol에서 3분간, 50% 락스에서 2분간 정치 배양하여 멸균수로 3회 세척한 후, 종자를 배지에 고정시키기 위해 0.

이론/모형

4)으로 옮긴 후 Nikon SMZ1500 해부 현미경을 이용하여 oocyte를 관찰 하고 카메라를 통하여 oocyte 부피 변화를 1분 간격으로 사진을 찍었다. NIS-Elements BR 3.07(Nikon Inc., Japan) 프로그램을 이용하여 oocyte의 지름을 측정하였으며 oocyte의 표면 부피를측정을 위하여 4/3兀(지름평균/2)3=V V/V°=AV의 식을 이용하였다.

성능/효과

본 실험에서도 PIP2-1 단백질의 발현과 세포 내 위치를 확인하기 위하여 pGEMHE vector0]] GFP(Green fluorescent protein)가 융합돤 vector에 PIP2-1 를 클로닝하고 이를 cRNA에 주입하여 Green fluorescent를 확인하였다. Fig. 4에서와 같이 GFP만 발현시켰을경우 Green fluorescence가 oocyte 전체에 나타나지만, PIP2-1 과 GFP 융합 단백질의 경우는 Green fluorescence 발현이 확인되어 PIP2단백질이 발현되었음을 확인할 수 있었으며, Green fluorescent가 oocyte 외곽의 plasmamembrane지역에 위치하므로, Xenopus oocyte내에서 water channel이 기능하는 위치에서 발현됨을 알 수 있었다.
또한 1/2ND biiflfei에서 6분 이상 지속시킬 경우 oocytee] 터짐이 발생하는 것으로 보아 I/2ND buffei조건이 적당하다는 것을 알 수 있었다. 이것은 cRNA의 안정성 혹은 단백질 합성효율에 5과 3' UTR부분이 크게 기여함을 보여주는 결과이며, 따라서 Xenopus oocyte에서 애기장대의 PIP2-1 활성측정을 위하여는 pGEMHE vector! 사용하는 것이 효율적이라고 여겨진다’
또한 GFP가 Vision된 PIP2J에서도 water channel 활성이 존재하는 것을 통하여 water channel 활성은 AtPIP2-l단백질의 발현에 의한 것임을 알 수 있었다. 이 결과를 보았을 때 애기장대의 PIP2-1 단백질이 oocyte에서 발현되고 기능하는 위치인 plasmamembrane에 위치한다는 것을 알 수 있었다.
1 를 사용할 경우 swelling assay를 U5ND buffer 조건에서 수행하는 것이 1/2ND buffet에 비하여 AtPIP2-l의 활성을 극대화하여 보여줌을 알 수 있었다. 또한 hypoosmotic shock의 적절한 시간을 규명하기 위하여 관찰한 바에 의하면, 1/5ND 조건에서 6분 이상 지속시킬 경우 oocyte의 파열이 시작되는 것을 알 수 있었으므로, 6분 이내에서 swelling assay를 중지시키는 것이 적당하다는 것을 알 수 있었다. 본 실험을 통하여 pcDNA vector 를 이용하여 애기장대의 AtPIP2-l의 활성측정을 위하여는 1/5ND buffer 수준의 hypoosmotic shock가 적 당하며, hypoosmotic shock 후 6분 이내에 활성을 측정을 하는 것이 적당하다는 것을 확인할 수 있었다.
또한 hypoosmotic shock의 적절한 시간을 규명하기 위하여 관찰한 바에 의하면, 1/5ND 조건에서 6분 이상 지속시킬 경우 oocyte의 파열이 시작되는 것을 알 수 있었으므로, 6분 이내에서 swelling assay를 중지시키는 것이 적당하다는 것을 알 수 있었다. 본 실험을 통하여 pcDNA vector 를 이용하여 애기장대의 AtPIP2-l의 활성측정을 위하여는 1/5ND buffer 수준의 hypoosmotic shock가 적 당하며, hypoosmotic shock 후 6분 이내에 활성을 측정을 하는 것이 적당하다는 것을 확인할 수 있었다. 이를 통해 vector의 발현 수준에 따라서 hypoosmotic stress의 최적 조건을 찾을 필요가 있음을 확인할 수 있었다.
이 결과를 보았을 때 애기장대의 PIP2-1 단백질이 oocyte에서 발현되고 기능하는 위치인 plasmamembrane에 위치한다는 것을 알 수 있었다.
본 실험을 통하여 pcDNA vector 를 이용하여 애기장대의 AtPIP2-l의 활성측정을 위하여는 1/5ND buffer 수준의 hypoosmotic shock가 적 당하며, hypoosmotic shock 후 6분 이내에 활성을 측정을 하는 것이 적당하다는 것을 확인할 수 있었다. 이를 통해 vector의 발현 수준에 따라서 hypoosmotic stress의 최적 조건을 찾을 필요가 있음을 확인할 수 있었다.

참고문헌 (19)

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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