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문제 정의
- 본 연구에서는 DSS로 유발시킨 궤양성 대장염 동물 모델을 이용하여 감초 추출물(Glycyrrhiza glabra Linne)의 궤양성 대장염 억제 효과를 조사하였다. 대조구에서는 체중 감소가 관찰되었으나, 감초 추출물 투여에 의하여 농도의존적으로 체중 감소의 개선 효과가 관찰되었다.
- 본 연구에서는 함염증 성분들이 함유된 감초 추출물을 이용하여 마우스에서 DSS로 유발시킨 궤양성 대장염 동물 모델을 이용하여 감초 추출물의 궤양성 대장염 억제 효과를 살펴보고자 하였다.
제안 방법
- 즉, 정상대조군, 궤양 유발군, 감초 추출물은 각각 100 ㎎/㎏, 10 ㎎/㎏, 1 ㎎/㎏으로 양성대조군 5-ASA는 150 ㎎/㎏으로 나누었다. 감초 추출물 및 5-ASA은 2.5% carboxymethyl cellulose로 용해시킨 후, 3% DSS 섭취 3일 전부터 하루에 한 번씩 경구 투여를 10일간 하였으며, 정상 대조군과 궤양 유발군은 2.5% carboxymethyl cellulose를 경구 투여하였다(Juskiewicz 등 2004). 궤양 유발군과 감초 추출물 투여군은 3% DSS를 1주일간 자유롭게 섭취하였으며, 정상 대조군은 물을 자유롭게 섭취하였다.
- 마우스의 체중 변화, 변의 형태 변화와 변에 피가 섞인 정도에 따라 질환 활성 지표(disease activity index, DAI)로 평가하였으며, 정상 상태의 변을 0으로 하여 무른 변만 보일 경우는 1이며, 무른 변과 잠혈이 보이면 2이고, 설사와 잠혈이 모두 관찰되면 3, 설사와 직장 주위에 피가 나며 허는 경우를 4로 하여 측정하였다(Table 1).
- 또한 조직학적인 변화는 Chen 등(2002)의 방법에 준수하여 점막 손상의 정도를 평가하였다. 즉, 병변의 범위를 두 가지 방법으로 종합하여 판단하였다. 포르말린에 고정시킨 결장을 항문으로부터 3 ㎝ 되는 부분의 조직을 취하여 일반적인 방법대로 파라핀으로 고정시킨 후에 5 ㎛의 절편으로 자르고 H & E 이중염색을 하였다.
- 실험 동물은 ICR 웅성 마우스(20～25 g)로 6주령을 중앙실험동물㈜로부터 구입하여 1주 동안 고형사료와 물을 자유롭게 섭취시키면서 55±5%의 습도와 22±2℃의 온도 및 12시간 주기로 명암이 조절되는 실험 환경에 1주간 적응시켰고, 한군에 8마리씩 5군으로 나누었다. 즉, 정상대조군, 궤양 유발군, 감초 추출물은 각각 100 ㎎/㎏, 10 ㎎/㎏, 1 ㎎/㎏으로 양성대조군 5-ASA는 150 ㎎/㎏으로 나누었다. 감초 추출물 및 5-ASA은 2.
- 995% 이산화탄소를, 보조 용매, 유기 용매 추출 및 HPLC 분석에 사용된 용매는 모두 HPLC급을 사용하였다. 초임계 유체 추출은 ISCO사(USA)의 SFX 3560을 사용하여 압력은 300 bar, 60℃에서 보조 용매로써 70% methanol을 사용하여 초임계 이산화탄소에 대해 15%(v/v)를 첨가하고, 3 ㎖/min의 유속으로 50분 동안 흘려주는 것으로 추출을 수행하였다.
- 포르말린에 고정시킨 결장을 항문으로부터 3 ㎝ 되는 부분의 조직을 취하여 일반적인 방법대로 파라핀으로 고정시킨 후에 5 ㎛의 절편으로 자르고 H & E 이중염색을 하였다.
대상 데이터
- 감초는 약령시장으로부터 구입하여 Warning blender로 분쇄한 후 30 mesh와 60 mesh 사이의 크기를 갖도록 제조하여 연구에 사용하였다. 초임계 유체 추출 용매로 순도 99.
- 궤양성 대장염 유발 물질인 dextran sulfate sodium(DSS, MW 35,000～45,000), 실험 대조약물인 5-amino salicylic acid(5-ASA) 및 MPO kit는 Sigma(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다.
- 실험 동물은 ICR 웅성 마우스(20～25 g)로 6주령을 중앙실험동물㈜로부터 구입하여 1주 동안 고형사료와 물을 자유롭게 섭취시키면서 55±5%의 습도와 22±2℃의 온도 및 12시간 주기로 명암이 조절되는 실험 환경에 1주간 적응시켰고, 한군에 8마리씩 5군으로 나누었다.
- 감초는 약령시장으로부터 구입하여 Warning blender로 분쇄한 후 30 mesh와 60 mesh 사이의 크기를 갖도록 제조하여 연구에 사용하였다. 초임계 유체 추출 용매로 순도 99.995% 이산화탄소를, 보조 용매, 유기 용매 추출 및 HPLC 분석에 사용된 용매는 모두 HPLC급을 사용하였다. 초임계 유체 추출은 ISCO사(USA)의 SFX 3560을 사용하여 압력은 300 bar, 60℃에서 보조 용매로써 70% methanol을 사용하여 초임계 이산화탄소에 대해 15%(v/v)를 첨가하고, 3 ㎖/min의 유속으로 50분 동안 흘려주는 것으로 추출을 수행하였다.
이론/모형
- 다형핵 백혈구(polymorphonuclear leukocyte: PMN)의 침착 정도를 나타내는 MPO의 활성도를 Cuzzocrea 등(2000)의 방법에 따라 아래와 같이 측정하였다. 장조직을 10 mM potassium phosphate buffer(pH 7)에 용해시킨 0.
- 장관의 소낭선과 내피의 손상 정도에 따라 점막의 손상 정도를 Table 2와 같이 5개 등급으로 평가하였다. 또한 조직학적인 변화는 Chen 등(2002)의 방법에 준수하여 점막 손상의 정도를 평가하였다. 즉, 병변의 범위를 두 가지 방법으로 종합하여 판단하였다.
- 장 점막의 손상 정도 평가는 Dieleman 등(1998)의 방법에 따라서 현미경하에서 점막이 손상된 최대의 길이를 측정, 계산하여 8 ㎝ 길이에서 점하는 백분비를 병변의 범위로 정하고, 백분비에 근거하여 병변의 범위를 5개 등급으로 나누었다. 장관의 소낭선과 내피의 손상 정도에 따라 점막의 손상 정도를 Table 2와 같이 5개 등급으로 평가하였다.
성능/효과
- 1) G-100, G-10 and G-1 are stand for 100 ㎎/㎏, 10 ㎎/㎏ and 1㎎/㎏ of extract of Glycyrrhiza glabra respectively. Dose of 5-ASA is 150 ㎎/㎏.
- 2) DAI was calculated as the sum of scores assigned as follows: percentage of body weight reduction(0: no change, 1: 1～5%, 2: 6～10%, 3: 11～15%, 4: >15%), Stool consistency(0: normal, 2: loose, 4: diarrhea) and the presence of fecal blood(0: normal, 2: positive occult blood test, 4: visible bleeding).
- 7일간 3% DSS 섭취에 의한 궤양성 대장염 유발군의 체중을 시간별로 관찰한 결과, 3% DSS 단독 섭취군은 7일째 DSS 섭취한 날에는 처음과 비슷한 체중으로 정상군에 비해 유의성 있는 체중 감소를 보였다. 감초 추출물 10 ㎎/㎏ 및 5-ASA 150 ㎎/㎏ 투여군에서의 체중 변화는 비슷한 양상의 변화를 보였으며, 염증의 발생에 따른 체중의 변화에서는 정상군에는 미치지 못하였다.
- DSS 투여군에서의 조직학적 변화는 3.55±0.13으로 결장점막 조직에 염증세포가 침투되었고, 장조직의 용모와 장샘(crypt)이 상실됨이 관찰되었다.
- 감초 추출물 1, 10 및 100 ㎎/㎏ 투여군에는 각각 2.80±0.3, 2.30±0.1 및 0.70±0.1 nM/tissue로 나타나, 농도 의존적으로 유의하게 감소하였고, 감초 추출물 10 ㎎/㎏ 투여군은 양성 대조군인 5-ASA 150 ㎎/㎏ 투여군과 유사한 정도의 효능을 나타내었으며, 감초 추출물 100 ㎎/㎏ 투여군은 5-ASA 투여군보다 우수한 효능을 나타내었다(Fig. 1).
- 감초 추출물 1, 10 및 100 ㎎/㎏ 투여군의 DAI 변화는 각각 2.15±0.51, 1.59±0.41 및 1.30±0.31로 나타나 농도 의존적으로 유의하게 개선되었다(Table 3).
- 감초 추출물 1, 10 및 100 ㎎/㎏ 투여군의 조직학적 변화는 각각 3.05±0.45, 2.15±0.37 및 1.21±0.43으로 나타나 농도 의존적으로 유의하게 개선되었고, 조직학적 변화에 있어서는 감초 추출물 10 ㎎/㎏ 투여군은 양성 대조군인 5-ASA 150 ㎎/㎏ 투여군보다 개선 정도가 낮게 나타났지만, 다른 효능지표인 체중, DAI 및 MPO activity와 일치하지 않은 결과를 나타내었고, 오히려 감초 추출물 100 ㎎/㎏ 투여군과 유사한 효능을 나타내었다(Table 3).
- 궤양성 대장염 유발군의 실험 동물에서 8마리 모두에서 혈변 및 묽은 변이 나타났으며, 2마리의 경우는 직장 주위에서 출혈이 발생하였다. 감초 추출물 100 ㎎/㎏ 투여군에서는 거의 정상군과 비슷한 변의 형태를 보였으며, 1마리에서는 혈변이 나타났다. 그리고 감초 추출물 10 ㎎/㎏을 투여한 군과 양성 대조군인 5-ASA 150㎎/㎏ 투여군에서는 2마리가 묽은 변을 보였으며, 그 중 1마리는 잠혈이 보였다.
- 결장조직의 H&E 이중염색소견에서 DSS 투여군에서는 충혈, 염증과 궤양이 관찰되었고, 많은 염증세포들이 관찰되었지만, 감초 추출물 투여군에서는 위의 병리소견들이 현저히 감소하였다.
- 결장조직의 변화에서 감초 추출물 1, 10 및 100 ㎎/㎏ 투여군의 조직학적 변화는 각각 3.05±0.45, 2.15±0.37 및 1.21±0.43으로 나타나 농도 의존적으로 유의하게 개선되었다.
- 5% carboxymethyl cellulose를 경구 투여하였다(Juskiewicz 등 2004). 궤양 유발군과 감초 추출물 투여군은 3% DSS를 1주일간 자유롭게 섭취하였으며, 정상 대조군은 물을 자유롭게 섭취하였다. 3% DSS는 사용하기 전에 증류수를 이용하여 만들어 사용하였다.
- 감초 추출물 10 ㎎/㎏ 및 5-ASA 150 ㎎/㎏ 투여군에서의 체중 변화는 비슷한 양상의 변화를 보였으며, 염증의 발생에 따른 체중의 변화에서는 정상군에는 미치지 못하였다. 그러나 감초 추출물 10 ㎎/㎏ 및 5-ASA 150 ㎎/㎏을 포함한 모든 시험구에서 DSS 단독 처리군에 비해 유의성 있는 체중 증가가 관찰되었다(Table 3). 식이 섭취량은 모든 군에서 유의적인 차이가 보이지 않았다(data not shown).
- 감초 추출물 100 ㎎/㎏ 투여군에서는 거의 정상군과 비슷한 변의 형태를 보였으며, 1마리에서는 혈변이 나타났다. 그리고 감초 추출물 10 ㎎/㎏을 투여한 군과 양성 대조군인 5-ASA 150㎎/㎏ 투여군에서는 2마리가 묽은 변을 보였으며, 그 중 1마리는 잠혈이 보였다.
- 다형핵 백혈구의 침착 정도를 나타내는 MPO는 DSS 투여군의 경우 3.10±0.2 nM/㎎ tissue이었는데, 이는 양성 대조구인 5-ASA 150 ㎎/㎏ 투여군 (2.20±0.4 nM/㎎ tissue)에 비해 유의하게 감소하였다.
- 본 연구에서는 DSS로 유발시킨 궤양성 대장염 동물 모델을 이용하여 감초 추출물(Glycyrrhiza glabra Linne)의 궤양성 대장염 억제 효과를 조사하였다. 대조구에서는 체중 감소가 관찰되었으나, 감초 추출물 투여에 의하여 농도의존적으로 체중 감소의 개선 효과가 관찰되었다. 생화적적 지표인 MPO 활성의 경우, 감초 추출물 1, 10 및 100 ㎎/㎏ 투여군에서는 각각 2.
- 43으로 나타나 농도 의존적으로 유의하게 개선되었다. 따라서 감초 추출물의 항염증 효과는 염증성 장 질환에 효능이 있는 것으로 동물 모델에서 확인하였다. 추가적으로 감초 추출물에 의한 사이토카인의 변화 등의 많은 연구가 필요하리라 사료된다.
후속연구
- 따라서 감초 추출물의 항염증 효과는 염증성 장 질환에 효능이 있는 것으로 동물 모델에서 확인하였다. 추가적으로 감초 추출물에 의한 사이토카인의 변화 등의 많은 연구가 필요하리라 사료된다.
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