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문제 정의
- 본 연구에서는 한약방에서 유통되고 있는 약재들의 농약 및 약초의 독성문제 등을 극복하고, 면역기능 증진 및 혈행개선 효과가 현저한 다기능성 음료를 개발하기 위한 방안으로 19가지의 산야초를 발효시킨 후 발효음료의 항산화작용, 면역기능, 혈전분해력, ACE활성억제 등의 생리활성을 연구하였다.
- 또한, 최근에는 NO가 세포 활성화 물질 및 reactive oxygen intermediates (ROI)에 의해 유발된 세포 독성을 최소화 시키는 역할이 밝혀짐으로 이 분야에 대해서 활발히 연구되고 있다[15,35]. 이에 본 실험에서는 시료를 대식세포에 투여하여 NO의 생성능을 확인하였다. 결과에서도 확인할 수 있는 것처럼 대식세포가 생성하는 NO량 2 μm보다 발효액의 첨가로 인해 22.
- 하지만 어떤 장애로 인한 불균형으로 인하여 혈전이 분해되지 않고 응집되어 혈관에 축적됨으로서 혈전증을 야기시킨다[31]. 이에 본 연구에서는 산야의 혈전분해능을 조사하고자 하였으며, 그 결과 산야 발효액에서 혈전분해능이 나타났다(Fig. 4). 특히, 산야 열수 추출물과 positive control인 plasmin을 비교 분석용으로 사용하였는데, plasmin 1 μg과 산야 열수 추출물 10 mg/ml의 혈전분해능과 비교실험을 실시한 결과 산야 발효액에서 높은 혈전분해능을 나타냈다.
가설 설정
- S: Sample absorbance. C: Control absorbance.
제안 방법
- 전자공여능(Electron donating ability, EDA)은 EDA (%)=(대조구흡광도-시료첨가구흡광도) /대조구흡광도×10 으로 계산하였다.
- 대식세포를 세포 배양판에 5×105 cells/ml의 세포가 되도록 재부유하여 LPS의 자극하에 24시간 배양하고 그 배양 상층액 내의 NO를 Griess 시약과 반응시켜 측정하였다[25].
- 혈전용해 활성의 측정에 있어서는 Astrup와 Hullertz의 방법[3]을 변형하여 사용하였다. 0.
- Merk)에 녹인 다음 직경 87×10 mm petridish에 10 ml을 넣은 후 thrombin (1,000 unit/ml Sigma) 20 unit를 첨가하여 실온에 30분간 방치하여 응고시켰다. 응고된 fibrin plate 에 각 시료를 적당량 점적하여 37℃에서 반응시켜 용해된 분해면적을 측정하였으며, 활성의 세기를 측정하기 위하여 혈전분해효소 plasmin과 비교 후 unit로 환산하여 단위를 정하였다.
- 대조구로서는 시료 대신 시료용매 50 μl를 가해 실험 하였으며, ACE 저해 활성효과는 다음 계산식을 이용하여 실험하였다.
- 지금까지의 보고에 의하면 항산화능과 플라보노이드의 함량에는 비례적인 연관성이 있다고 알려져 왔다[23]. 이에 본 연구에서는 항산화능이 우수한 산야 발효액에 대한 플라보노이드 함량을 HPLC로 정량 분석하였다(Table 1). Quercetin은 산야 발효액에서 87 μg/g의 함량을 보였지만, Kaemferol와 myricetin은 관찰되지 않았다.
- 대장균 Bacterial lipopolysaccharide (LPS)를 대식세포에 처리하여 NO를 유도시킨 다음 산야 발효액을 대식세포에 처리하여 NO 활성에 미치는 영향을 조사하였다(Fig. 3). 그 결과, LPS에 의하여 유도된 대식세포의 NO 합성은 산야 발효액을 농도별로 첨가하였을 때 점차 감소하였다.
- 발효액 시료에 대한 세포활성은 MTT 분석을 통해서 측정하였다. 그 결과 시료로 처리된 대식세포의 세포생존율이 90%정도를 나타내는 바 본 연구에서 사용된 시료에 대한 세포독성은 없는 것으로 관찰되었다.
- )를 생성하게 되고, 나머지 골격이 uric acid를 형성하여 혈장 내에 과량 존재하게 되면 골절에 축적되어 심한 통증을 유발하는 통풍과 신장에 침착되어 신장질환을 일으키는 효소로 알려져 있다. Xanthine oxidase 저해활성 측정은 일종의 항산화 능을 측정하는 방법으로 본 실험에서는 대조구로 catechin을 사용하였으며 산야 발효액과 농도별로 비교하였다. Xanthine oxidase저해 활성 측정 결과 농도가 증가할수록 저해활성이 증가하였으며, 대조구인 catechin과 비교한 결과 1 mg/ml에서 79.
대상 데이터
- 마우스대식세포주인 RAW264.7 세포는 American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA. USA)에서 구입하였으며, 세포배양에 사용된 배지인 RPMI 1640 medium(Eagle's MEM)과 fetal bovine serum (FBS), Hank's balanced salt solution (HBSS) 등은 모두 Hyclone (Logan, UT, USA)의 제품을 구입하여 사용하였다 RAW264.7 세포주는 10% FBS와 100 unit의 penicillin과 streptomycin이 함유된 RPMI 1640 media를 사용하여 5%의 이산화탄소를 포함한 37℃의 포화습도 공기조건하에서 배양하였다.
- 본 실험에 사용된 실험 재료는 증류수 10 l에 산야(민들레 40 g, 연자육 40 g, 솔잎 30 g, 참나리 30 g, 애쑥 30 g, 질경이 30 g, 뽕열매 40 g, 감초 24 g, 도라지 9 g, 쇠비름 9 g, 자소엽9 g, 박하 36 g, 금불초 9 g, 오가피 18 g, 참마 15 g, 연뿌리 18 g, 두충 30 g, 둥글레 200 g, 녹차잎 100 g)와 다시마(100 g)및 미네랄 수(해양성심층수, 0.5%)는 부재료로 첨가하여 당의 농도가 50.0～60.0 Brix가 되도록 설탕시럽을 넣은 후 발효시켰다. 약 6개월 동안 발효시킨 후 산야 발효액의 pH 5.
- Flavonoid glycoside 분석을 위한 표준용액(1 mg/ml) Quercetin, Kaemferol, Myricetin, Apigenine, Luteolin, Rutin을 메탄올에 용해시켜 사용하였고, 시료(10 mg/ml)는 메탄올에 용해 한 후 Sea-pak C18 cartridge와 0.2 μm filter로 여과하여 HPLC 분석용 시료로 사용하였다.
이론/모형
- 전자공여능 측정은 Blois의 방법[5]에 따라서 각 시료의 DPPH (1,1-diphenyl- 2-picrylhydrazyl)에 대한 수소공여 효과로 측정 하였다. 시료를 농도별로 희석하여 시료 40 μl와 1.
- NO의 생성은 비색법으로 세포 상등액에 축적되는 nitrite 양을 측정하였다. 대식세포를 세포 배양판에 5×105 cells/ml의 세포가 되도록 재부유하여 LPS의 자극하에 24시간 배양하고 그 배양 상층액 내의 NO를 Griess 시약과 반응시켜 측정하였다[25].
- 세포독성 실험은 mitochondrial dehydrogenase activity의 index를 나타내는 MTT colorimetric reduction assay 법으로 시료가 세포생존율에 미치는 영향을 분석하였다[25]. 96-well microtiter plate (Nunc, Vangaard, Neptune, NJ)에 RAW 264.
- 추출물의 SOD 유사활성은 Marklund 와 Marklund의 방법[24]에 따라 과산화수소(H2O2)로 전환시키는 반응을 촉매하는 pylogallol의 생성량을 측정하여 SOD 유사활성으로 나타내었다. 시서 5분간 incub료를 농도별로 희석하여, 시료 10 μl에 pH 8.
- Xanthine oxidase에 의해 생성된 superoxide radials 소거활성은 NBT (nitro-blue tetrazolium) 환원법[28]을 사용하여 검정하였다. 즉, 0.
- ACE저해 활성은 Cushman 등의 방법[6]에 따라 측정하였으며, 조효소액은 rabbit lung acetone powder (Sigma, USA)를 0.3 M NaCl을 함유한 0.1 M sodium borate buffer (pH 8.3)에 1g/ml (w/v)의 농도로 4℃에서 24시간 추출한 후, 4℃,4,000 rpm에서 40분간 원심 분리하여 상등액을 ACE 조효소액으로 사용하였다. 기질은 0.
성능/효과
- 특히 DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) radical 소거법은 항산화물질의 전자공여능을 이용한 항산화 측정법으로써 주로 pheonlic 구조와 aromatic amine 화합물에서 많이 사용되는 방법이다. 본 연구에서 산야 발효액의 항산화 효과를 DPPH radical 제거 정도를 측정하여 전자공여능으로 나타낸 결과 발효 원액에서 94.3%로 나타났다(Fig. 1). 일반적으로 이용되는 positive control인 BHA 0.
- 결과에서도 확인할 수 있는 것처럼 대식세포가 생성하는 NO량 2 μm보다 발효액의 첨가로 인해 22.0 μm의 높은 NO 생성능을 나타내었다(Fig. 2).
- 2). 이로써, 산야가 면역활성과 관련하여 활용 가능성이 있으며 전통발효를 통해 높은 면역활성의 증진이 있음을 확인할 수 있었다. 지금까지의 연구는 주로 침입한 미생물이나 종양세포가 분비하는 독성물질로 유발되는 NO 생성을 저해하는 효능에 대해 조사해 왔으며, 방어 물질로 또는 독성을 최소화시킬 수 있는 물질로써의 NO 생성 활성에 대한 연구는 거의 없는 것으로 판단된다.
- 3). 그 결과, LPS에 의하여 유도된 대식세포의 NO 합성은 산야 발효액을 농도별로 첨가하였을 때 점차 감소하였다. 발효액의 첨가로 56%의 NO 생성 저해능을 나타났으며(Fig.
- 그 결과, LPS에 의하여 유도된 대식세포의 NO 합성은 산야 발효액을 농도별로 첨가하였을 때 점차 감소하였다. 발효액의 첨가로 56%의 NO 생성 저해능을 나타났으며(Fig. 3), 이러한 결과는 산야로 부터의 성분들이 면역기능과 밀접한 관계가 있음을 보여주는 것이다. NO는 L-arginine의 guanidino nitrogen으로부터 nitric oxide synthase (NOS)에 의하여 생성되며[14], NO는 분비조직과 세포의 기능에 영향을 미치며, 세포성 면역계의 주된 역할의 하나로 세포 독성이나 성장 억제 작용을 한다[9].
- 특히, 산야 열수 추출물과 positive control인 plasmin을 비교 분석용으로 사용하였는데, plasmin 1 μg과 산야 열수 추출물 10 mg/ml의 혈전분해능과 비교실험을 실시한 결과 산야 발효액에서 높은 혈전분해능을 나타냈다.
- 발효액 시료에 대한 세포활성은 MTT 분석을 통해서 측정하였다. 그 결과 시료로 처리된 대식세포의 세포생존율이 90%정도를 나타내는 바 본 연구에서 사용된 시료에 대한 세포독성은 없는 것으로 관찰되었다. 또한, 실험결과에 나타난 NO의 생성량의 변화가 세포독성에 의한 영향과는 무관함을 확인할 수 있었다.
- 그 결과 시료로 처리된 대식세포의 세포생존율이 90%정도를 나타내는 바 본 연구에서 사용된 시료에 대한 세포독성은 없는 것으로 관찰되었다. 또한, 실험결과에 나타난 NO의 생성량의 변화가 세포독성에 의한 영향과는 무관함을 확인할 수 있었다.
- 본 연구에서 산야 발효액의 SOD 유사활성은 최고농도에서 42.2%의 활성을 보였으며 SOD 활성은 농도 의존적으로 항산화 활성이 증가하였다(Fig. 5). 대조구인 Vit.
- 2%의 SOD 유사활성을 나타내었다고 보고하였다. 이 결과로 보아 본 연구의 산야 발효액의 SOD 활성이 훨씬 더 우수하다고 판단되며 그 이용가치가 높음을 증명하고 있다.
- Xanthine oxidase 저해활성 측정은 일종의 항산화 능을 측정하는 방법으로 본 실험에서는 대조구로 catechin을 사용하였으며 산야 발효액과 농도별로 비교하였다. Xanthine oxidase저해 활성 측정 결과 농도가 증가할수록 저해활성이 증가하였으며, 대조구인 catechin과 비교한 결과 1 mg/ml에서 79.8%인 반면, 100배 희석한 산야 발효액은 75.6%로 높게 나타났다(Fig. 6). Catechin은 polyphenol계 항산화 물질로써 식물성 대사산물로 알려져 있으며 항산화효과가 비타민 E에 비해 무려 50배나 되고, 비타민 C에 비해 100배에 달하기 때문에, 체내의 활성산소를 제거하는 효과가 매우 탁월하다고 알려져 있다[29].
- 이러한 ACE의 활성 저해인자로는 저분자 peptide들과 그 유도체들, 녹차에 존재하는 catechin과 메밀의 rutin과 같은 polyphenol 성분들이 대표적으로 알려져 있다. 이러한 ACE의 작용을 억제하기 위한 활성이 산야에 있는 지 알아보기 위해 실험을 한 결과, 산야 발효액에서 높은 활성을 나타내었다(Fig. 7). 대조구로 현재 시판되고 있는 항고혈압제인 captopril을 사용하였으며, captopril 10 μg/ml에서 93.
- 7). 대조구로 현재 시판되고 있는 항고혈압제인 captopril을 사용하였으며, captopril 10 μg/ml에서 93.0%의 저해 활성을 보였는데 10배 희석한 산야 발효액에서 73.5%의 저해 활성을 보였다. 이러한 결과는 고혈압 예방 효능이 높은 기능성 식품인 유색감자 보다 뛰어난 효능을 나타내고 있다[28].
- Apigenine의 함량 분석과정에서 산야 발효액의 결과 484 μg/g으로 높은 함량을 나타내었다.
후속연구
- 특히, 건강음료 개발에 약용식물을 활용하고자 해 왔는데, 현재 시판되고 있는 건강음료의 종류는 섬유소를 주로 한 변비예방과 정장작용을 돕는 것이거나 체중조절을 위한 것, 체내수분과 전해질공급을 위한 것이 대부분이며, 그 외 건강 보양을 위한 것 등이 개발되고 있다. 아직은 약용식물을 이용한 음료개발에 관한 연구가 일부 영역만을 다루고 있어 건강기능성 음료로 활용하기 위해서는 앞으로 다각적인 연구가 요구된다.
- Catechin은 polyphenol계 항산화 물질로써 식물성 대사산물로 알려져 있으며 항산화효과가 비타민 E에 비해 무려 50배나 되고, 비타민 C에 비해 100배에 달하기 때문에, 체내의 활성산소를 제거하는 효과가 매우 탁월하다고 알려져 있다[29]. 특히, 산야 발효액의 XOase 저해효과는 catechin의 효과보다 높은 결과를 나타내고 있어 본 연구의 산야 발효액이 우수한 항산화 소재로 개발될 수 있을 것으로 기대된다.
- 이러한 결과는 고혈압 예방 효능이 높은 기능성 식품인 유색감자 보다 뛰어난 효능을 나타내고 있다[28]. 따라서 본 연구에서 개발된 산야 발효액은 고혈압 예방 기능성 음료로서 이용가능성이 높은 것으로 사료된다.
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