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문제 정의
- 본 연구의 목표는 전립선 암세포의 성장 억제 및 anti-apoptotic 유전자 산물의 억제를 통한 apoptosis 경로의 관련된 신선초의 항암효과를 조사하는 것이었다. 최종적으로 세포주기의 sub-G1 DNA 함유량을 축적하는 것을 볼 수 있었고, 성장 단백질 (cyclin D1)과 anti-apoptotic gene product (Bcl-2, Bcl-xl, cIAP1/2, survivin)경로의 관련된 신선초의 항암효과를 억제에 의한 annexin V (+) apoptotic body의 유도와 DNA 분절을 볼 수 있었다.
- 이 연구 논문은 전립선 암세포 주에서 식물의 항암효과를 조사한 첫 번째 보고이다. 이 결과들은 MF가 다른 신선초의 추출물과 비교하였을 때 DU145 전립선 암세포에서 가장 세포독성 효과가 좋다는 것을 분명하게 보여준다.
제안 방법
- 2시간 후 20% sodium-dodesylsulfate(SDS), 50% dimethylformamide가 포함된 용액 100 μl/well을 첨가하여 생존 세포에 의해 형성된 보라색 formazan을 용해시킨 다음 분광광도계 (ELISA reader, (TECAN)를 이용하여 570 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.
- Combination index (CI)는 Chou-Talalay 방법과 calcusyn software (Biosoft, Ferhuson, MO)에 의해 측정되었으며, 세 개의 각각 다른 병합 (MF10/DOX0.1, MF20/DOX0.25, MF30/DOX0.5)으로 얻어진 CI값은 3번 반복의 평균값으로 나타내었다. CI값이 1보다 작을 경우 상승효과로, CI값이 1일 경우 첨가물로, CI가 1보다 클 경우 그 반대효과로 나타내었다.
- MF가 DOX로 유도되어 세포고사를 더욱 강화시키는지 알아보기 위해 MF를 처리하기전 Du145 cell에 DOX를 1시간전에 미리 처리하였다. 그 결과 MF는 DOX를 미리 처리한 Du145 세포에서 분명하게 상승효과를 일으키는 것으로 확인되었다 (그림 4).
- 신선초의 apoptosis 유도 효과를 전립선 암세포에 처리하여 실험하였다. MF의 apoptotic activity를 평가하기 위하여 Western blot으로 caspase-3와 PARP의 쪼개짐을 관찰하였다. Caspase-3, effector caspase의 활성형은 MF를 처리한 DU145 세포에서 농도 의존적으로 증가하였다.
- Western blot 분석을 이용하여 MF가 Du145 세포의 성장 단백질(cyclin D1)과 anti-apoptotic 단백질 (Bcl-2, Bcl-xl, cIAP1/2, and survivin)의 발현을 억제하는 효과를 관찰하였다. DU145 세포에 MF를 0, 10, 30, 50 μg/ml)로 24시간 처리하였을 때, 농도의존적으로 억제되는 것을 관찰할 수 있었다 (그림 3A).
- cells/ml)에 50 μg/ml의 농도로 신선초의 메탄올 (MF) 분획물을 처리한 다음 24시간 동안 배양한 후, 세포를 수확하여 PBS로 세척하였다. 그 후 -20℃에서 70 % ethanol로 하루 동안 고정 시키고 PBS 세척 후 2 ml RNase A (1 mg/ml)를 처리한 다음에 propidium iodide (PI; Sigma, MO, USA)로 염색하고, Flow Cytometer (FACScan Calibur, BD Biosciences)로 세포주기를 분석하였다.
- 동량의 세포 파쇄액 (단백질 30 μg)은 5× sample buffer와 섞어 100℃에서 5분 끓인 후에 8 ~ 12 % SDS-PAGE를 시행하였다.
- 배양된 DU145 세포에서 세포자연사를 확인하기 위하여 terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT)-mediated dUTP-digoxigenin nick end-labeling (TUNEL) kit (Roche)를 사용하였다. 배양된 세포는 4% paraformaldehyde 로 30분간 고정한 후 PBS로 세척하였다.
- 1% Sodium citrate)을 이용해 풀어준 다음 4℃에 하루 종일 나둔 후 PBS를 이용하여 세척해주었다. 세척 후 TUNEL enzyme으로 37℃에서 60분간 처리한 후 PBS로 세척하고 FITC가 결합되어 있는 antibody로 염색을 시행하고 Flow Cytometer (FACScan Calibur, BD Biosciences)로 DNA의 분절을 분석하였다.
- 세포 생존율 측정은 세포 배양관 (96-wel lplate)에 세포 (5×103 cells/ml)를 100 ml씩 분주하여 24시간 동안 CO2세포 배양기 안에서 안정시킨 후, 여러가지의 신선초 추출물을 처리한 다음, MTT 용액 (5 mg/ml)을 배양액에 농도별로 첨가하였다.
- 세포 생존을 알아보기 위하여 전립선 암세포주 (DU145)를 배양후 신선초 추출물을 다양한 농도로 (0 to 50 μg/ml) 24시간 처리하여 MTT assay를 이용해 측정하였다.
- 세포주기의 관찰을 통해 MF의 효과를 관찰하였다. Apoptosis 유발에 관련된 DNA sub-G1의 함량을 관찰해보니 MF를 처리한 DU145 세포에서 급격하게 증가하는 것을 관찰 할 수 있었다 (그림 1C).
- 신선초의 apoptosis 유도 효과를 전립선 암세포에 처리하여 실험하였다. MF의 apoptotic activity를 평가하기 위하여 Western blot으로 caspase-3와 PARP의 쪼개짐을 관찰하였다.
- 이로써 이 연구는 MF에 의해 조절되는 protein의 새로운 정보를 제공하고 전립선 암세포의 성장저해와 apoptosis의 효과를 입증하였다. MF는 신선초에서 분리된 가장 주요한 추출물로써 apoptotic effect 의해 세포 성장을 억제한 다는 것으로 가능성 있는 물질이 될 것이다.
- PVDF membrane은 5 % skim milk와 상온에서 2시간 반응시켜 비 특이적 항체결합을 억제시켰다. 측정하고자 하는 항체는 0.1%의 Tween-20이 포함된 5% skim milk에 1:1000으로 희석하여 상온에서 4℃에서 하루 동안 반응 시킨 후 이차항체 anti-rabbit IgG conjugated horse-radish peroxidase을 1시간 처리 한 후, enhanced chemiluminescence kit (ECL kit:Amersham, England)를 사용하여 ECL필름에 노출시켰다.
대상 데이터
- 더구나 caspase가 활성을 보여 PARP가 쪼개지면 세포의 분해를 촉진하고 apoptosis의 marker 역할을 제공한다4). PARP가 쪼개짐은 MF를 처리한 DU145 세포에서 관찰 되었다. 또한 MF를 처리한 세포에서 Annexin V (+)의 비율이 증가를 알 수 있었다.
- 신선초 (Angelica keiske; 1.5 kg)를 중량의 4배에 해당하는 ethanol을 가한 후 상온에서 3일 동안 교반 하였으며, 진공여과를 통해 상층액을 회수하였다. 이 과정을 3회 반복하여 모은 상층액을 감압 농축법을 이용하여 신선초 80% MeOH 추출물 240 g을 얻었다.
- 전립선 암세포주인 DU145는 항생제가 첨가된 (100 units/ml penicillin A and 100 μg/ml of streptomycin) RPMI 1640 (L-glutamine, 25 mM HEPES buffer, and sodium bicarbonate Gibco BRL, MD, USA)배지를 이용하여 37℃, 5% CO2의 완전 습윤 조건의 CO2배양기 내에서 배양하였다.
데이터처리
- 통계처리 방법은 ANOVA를 이용하여 분석한 후 Bonferroni test를 사용하여 검정하였으며, p값이 0.01미만일 때 통계학적인 유의성을 인정하였다.
이론/모형
- MF를 처리하지 않은 군과 (50 μg/ml)로 처리한 군을 비교하였을 때 MF를 처리한 군이 초기 apoptosis를 일으키는 것을 확인 하였다 (그림 2A). Apoptosis가 유도됨을 증명하기 위하여 TUNEL 방법으로 실험 하였다. MF를 처리하지 않은 군(5.
- MF에 유도되는 apoptosis의 활성을 평가하기 위해 Annexin V assay를 수행하였다. MF를 처리하지 않은 군과 (50 μg/ml)로 처리한 군을 비교하였을 때 MF를 처리한 군이 초기 apoptosis를 일으키는 것을 확인 하였다 (그림 2A).
성능/효과
- 최종적으로 세포주기의 sub-G1 DNA 함유량을 축적하는 것을 볼 수 있었고, 성장 단백질 (cyclin D1)과 anti-apoptotic gene product (Bcl-2, Bcl-xl, cIAP1/2, survivin)경로의 관련된 신선초의 항암효과를 억제에 의한 annexin V (+) apoptotic body의 유도와 DNA 분절을 볼 수 있었다. 2,적으로 MF는 caspase-3 활성을 통한 apoptosis를 유도하고, doxorubicin이 MF 효과를 강화시켰다.
- 세포주기의 관찰을 통해 MF의 효과를 관찰하였다. Apoptosis 유발에 관련된 DNA sub-G1의 함량을 관찰해보니 MF를 처리한 DU145 세포에서 급격하게 증가하는 것을 관찰 할 수 있었다 (그림 1C). 아무런 처리를 안한 군 (2.
- DU145 세포에 MF를 0, 10, 30, 50 μg/ml)로 24시간 처리하였을 때, 농도의존적으로 억제되는 것을 관찰할 수 있었다 (그림 3A).
- IAP family protein은 caspase의 binding과 inhibiting을 통하여 apoptosis가 조절 된다18-19). MF를 처리한 DU145 세포는 농도의존적으로 c-IAP1과 c-IAP2를 억제하는 것을 알 수 있었다. 더욱이 MF를 처리한 DU145 세포에서 IAP family protein중에 하나인 survivin의 발현이 상당히 많이 억제되는 것을 알 수가 있었다.
- Bcl-2 family protein은 미토콘드리아에 존재하고 caspase의 활성을 조절한다. MF를 처리한 DU145 세포에서 anti-apoptotic Bcl-2와 Bcl-xl의 protein 발현의 변화를 알아본 결과 Bcl-2와 Bcl-xl의 시간 의존적으로 감소 됨을 알 수 있었다. 추가로 다른 apoptosis 조절 protein인 IAP (inhibitors of apoptosis proteins)는 최근 많은 암세포에서 apoptotic cell death를 조절하는 중요한 타겟으로 생각되고 있다.
- Caspase-3는 apoptosis 유도에 가장 중요한 역할을 한다. caspase-3 활성으로 인한 apoptosis 인지 아닌지의 여부를 DU145 세포에 MF를 농도별로 24시간 처리하여 Western blot 분석을 통해 관찰하였더니 MF에 의해 유도된 apoptosis임이 확인되었다 (그림 3B).
- MF가 DOX로 유도되어 세포고사를 더욱 강화시키는지 알아보기 위해 MF를 처리하기전 Du145 cell에 DOX를 1시간전에 미리 처리하였다. 그 결과 MF는 DOX를 미리 처리한 Du145 세포에서 분명하게 상승효과를 일으키는 것으로 확인되었다 (그림 4).
- MF를 처리한 DU145 세포는 농도의존적으로 c-IAP1과 c-IAP2를 억제하는 것을 알 수 있었다. 더욱이 MF를 처리한 DU145 세포에서 IAP family protein중에 하나인 survivin의 발현이 상당히 많이 억제되는 것을 알 수가 있었다. Survivin의 독특한 구조 때문에 화학적인 치료와 방사선 치료의 유력한 타겟으로 생각되고 있다20-22).
- PARP가 쪼개짐은 MF를 처리한 DU145 세포에서 관찰 되었다. 또한 MF를 처리한 세포에서 Annexin V (+)의 비율이 증가를 알 수 있었다. 세포 주기 측정은 MF에 의해 sub-G1 비율이 크게 증가함을 나타내었고 이로써 apoptotic cell death를 유도하는 것을 알 수 있었다.
- 또한 MF를 처리한 세포에서 Annexin V (+)의 비율이 증가를 알 수 있었다. 세포 주기 측정은 MF에 의해 sub-G1 비율이 크게 증가함을 나타내었고 이로써 apoptotic cell death를 유도하는 것을 알 수 있었다.
- 이 연구 논문은 전립선 암세포 주에서 식물의 항암효과를 조사한 첫 번째 보고이다. 이 결과들은 MF가 다른 신선초의 추출물과 비교하였을 때 DU145 전립선 암세포에서 가장 세포독성 효과가 좋다는 것을 분명하게 보여준다. 이 실험의 결과들은 신선초에서 분리한 다양한 물질로 실험한 neuroblastoma와 leukemia의 세포생존의 영향을 조사하였던 이 전에 보고된 연구결과와 일치한다15-16).
- 3%) 보다 처리한 군이 TUNEL (+)가 15%까지 증가하는 것으로 보아 이것은 이전의 실험결과와 일치된다. 이를 바탕으로한 결과에서 MF는 DU145 세포의 세포주기 arrest 및 apoptosis를 유도하는 것으로 보인다.
- 본 연구의 목표는 전립선 암세포의 성장 억제 및 anti-apoptotic 유전자 산물의 억제를 통한 apoptosis 경로의 관련된 신선초의 항암효과를 조사하는 것이었다. 최종적으로 세포주기의 sub-G1 DNA 함유량을 축적하는 것을 볼 수 있었고, 성장 단백질 (cyclin D1)과 anti-apoptotic gene product (Bcl-2, Bcl-xl, cIAP1/2, survivin)경로의 관련된 신선초의 항암효과를 억제에 의한 annexin V (+) apoptotic body의 유도와 DNA 분절을 볼 수 있었다. 2,적으로 MF는 caspase-3 활성을 통한 apoptosis를 유도하고, doxorubicin이 MF 효과를 강화시켰다.
후속연구
- 물론 SPC3042, YM55, LY2181308 같은 pro-apoptotic surviving inhibitor들이 개발되고 있지만 과학적인 증거는 아직 미미하다23-25). MF가 survivin inhibitor가 될 수 있는 가능성을 생각하면 흥미로울 것이고 앞으로 DU145 세포에 대한 더욱 명확한 apoptosis 조절메커니즘 의 연구가 진행되어야 할 것이다.
- MF는 신선초에서 분리된 가장 주요한 추출물로써 apoptotic effect 의해 세포 성장을 억제한 다는 것으로 가능성 있는 물질이 될 것이다. 앞으로의 연구는 신선초의 활성 구성성분에 대해 상세히 연구되어야 하고 생물학적, 세포학적인 실험과 동물실험이 추가로 진행되어야 할 것으로 예상된다.
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