최근 연구에서 폴리페놀을 함유한 천연물은 질병의 위험과 노화의 원인인 ROS와 RNS를 감소시키는 것과 연관이 있다고 밝혔다. 본 연구에서는 섬쑥부쟁이 추출물과 분획물의 산화와 염증에 대한 저해 효과가 있는지에 대한 연구를 조사하였다. 섬쑥부쟁이 70% 메탄올 추출물은 헥산층, 에틸아세테이트층, 부탄올층, 물층을 극성별로 분획하였다. 섬쑥부쟁이로부터 분획한 에틸아세테이트 추출물과 부탄올 추출물의 전자공여능은 $50\;{\mu}g/mL$에서 각각 58.0%, 46.4%를 나타냈다. 에틸아세테이트 추출물의 superoxide anion radical 소거능은 $50\;{\mu}g/mL$에서 64.65%를 나타냈고, 부탄올 추출물은 $50\;{\mu}g/mL$의 농도에서 35.66%의 저해 효과를 나타내었다. 항염증 효과와 관련된 hyaluronidase와 lipoxygenase의 저해 활성에 대한 에틸아세테이트 분획물의 효과는 $5\;{\mu}g/mL$의 농도에서 각각 24.37%, 29.5%의 저해 효과를 나타냈다. 이러한 에틸아세테이트 추출물의 항염증 효과는 nitric oxide 생성 억제에서도 유의했으며, Raw 264.7 cell 내 LPS에 의해 유도된 iNOS 단백질에서 $50\;{\mu}g/mL$의 EtOAc 추출물을 처리시 81.5%의 발현을 억제하는 효과가 확인되었다.
최근 연구에서 폴리페놀을 함유한 천연물은 질병의 위험과 노화의 원인인 ROS와 RNS를 감소시키는 것과 연관이 있다고 밝혔다. 본 연구에서는 섬쑥부쟁이 추출물과 분획물의 산화와 염증에 대한 저해 효과가 있는지에 대한 연구를 조사하였다. 섬쑥부쟁이 70% 메탄올 추출물은 헥산층, 에틸아세테이트층, 부탄올층, 물층을 극성별로 분획하였다. 섬쑥부쟁이로부터 분획한 에틸아세테이트 추출물과 부탄올 추출물의 전자공여능은 $50\;{\mu}g/mL$에서 각각 58.0%, 46.4%를 나타냈다. 에틸아세테이트 추출물의 superoxide anion radical 소거능은 $50\;{\mu}g/mL$에서 64.65%를 나타냈고, 부탄올 추출물은 $50\;{\mu}g/mL$의 농도에서 35.66%의 저해 효과를 나타내었다. 항염증 효과와 관련된 hyaluronidase와 lipoxygenase의 저해 활성에 대한 에틸아세테이트 분획물의 효과는 $5\;{\mu}g/mL$의 농도에서 각각 24.37%, 29.5%의 저해 효과를 나타냈다. 이러한 에틸아세테이트 추출물의 항염증 효과는 nitric oxide 생성 억제에서도 유의했으며, Raw 264.7 cell 내 LPS에 의해 유도된 iNOS 단백질에서 $50\;{\mu}g/mL$의 EtOAc 추출물을 처리시 81.5%의 발현을 억제하는 효과가 확인되었다.
The Plants and their extracts containing polyphenol have been shown to be associated with decreased the cause of aging and variety of disease such as reaction oxygen species (ROS) and reactive nitrogen species (RNS) in several recent studies. We conducted to investigate whether the extracts and frac...
The Plants and their extracts containing polyphenol have been shown to be associated with decreased the cause of aging and variety of disease such as reaction oxygen species (ROS) and reactive nitrogen species (RNS) in several recent studies. We conducted to investigate whether the extracts and fractionation isolated from Aster glehni Fr. Schm. has an inhibitory effect association with oxidation or inflammation. The Aster glehni Fr. Schm. 70% aq. MeOH was fractioned according to polarity with n-hexane layer, EtOAc layer, n-BuOH layer and water layer. The electron donating ability of EtOAc, n-BuOH solvent fraction from Aster glehni Fr. Schm. was about 58.0%, 46.4% at $50\;{\mu}g/mL$, respectively. The superoxide anion radical inhibitory effect of EtOAc extracts was about 64.65% at $50\;{\mu}g/mL$, and n-BuOH extracts was 35.66% at $50\;{\mu}g/mL$. EtOAc layer to the inhibition activity of hyaluronidase and lipoxygenase were inhibited about 24.37%, 29.5% at $5\;{\mu}g/mL$. In the anti-inflammation effect of EtOAc layer inhibited the generation of nitric oxide. also, these results showed that EtOAc extract inhibited 81.5% at $50\;{\mu}g/mL$ on the expressions of iNOS protein in Raw264.7 cell line.
The Plants and their extracts containing polyphenol have been shown to be associated with decreased the cause of aging and variety of disease such as reaction oxygen species (ROS) and reactive nitrogen species (RNS) in several recent studies. We conducted to investigate whether the extracts and fractionation isolated from Aster glehni Fr. Schm. has an inhibitory effect association with oxidation or inflammation. The Aster glehni Fr. Schm. 70% aq. MeOH was fractioned according to polarity with n-hexane layer, EtOAc layer, n-BuOH layer and water layer. The electron donating ability of EtOAc, n-BuOH solvent fraction from Aster glehni Fr. Schm. was about 58.0%, 46.4% at $50\;{\mu}g/mL$, respectively. The superoxide anion radical inhibitory effect of EtOAc extracts was about 64.65% at $50\;{\mu}g/mL$, and n-BuOH extracts was 35.66% at $50\;{\mu}g/mL$. EtOAc layer to the inhibition activity of hyaluronidase and lipoxygenase were inhibited about 24.37%, 29.5% at $5\;{\mu}g/mL$. In the anti-inflammation effect of EtOAc layer inhibited the generation of nitric oxide. also, these results showed that EtOAc extract inhibited 81.5% at $50\;{\mu}g/mL$ on the expressions of iNOS protein in Raw264.7 cell line.
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문제 정의
현재까지 섬쑥부쟁이에 관하여 알려진 물질로는 β-amyrin acetate, phytol, alismol, α-tocopheryl, quinone, α-spinasterol, 10-O-methyl-alismoxide, alismoxide, 3-O-[6'-O-palmitoyl-β-D-glucosyl]-spinasta-7, 22-diene[20]와 α-pinene, limonene, δ-elemene, β-pienene, cis-3-hexenol, myrcene 외 25종과 살초활성 물질인 coumarin[14]이 있다. 본 연구에서는 섬쑥부쟁이 메탄올 추출물로부터 용매 분획한 섬쑥부쟁이 분획물에 대해 항산화, 항염증에 대한 여러 종류의 in vitro 검색법을 실시하여, 식품과 제약 그리고 화장품 산업에 적용하기 위한 천연소재로서의 가치를 검토하였다.
최근 연구에서 폴리페놀을 함유한 천연물은 질병의 위험과 노화의 원인인 ROS와 RNS를 감소시키는 것과 연관이 있다고 밝혔다. 본 연구에서는 섬쑥부쟁이 추출물과 분획물의 산화와 염증에 대한 저해 효과가 있는지에 대한 연구를 조사하였다. 섬쑥부쟁이 70% 메탄올 추출물은 헥산층, 에틸아세테이트층, 부탄올층, 물층을 극성별로 분획하였다.
제안 방법
Hyaluronidase(HAase) 저해활성 측정은 sodium-hyaluronic acid(HA)로부터 형성된 N-acetylglucosamine을 glucoxazoline 유도체로 변형시킨 후 p-dimethylaminobenzaldehyde(DMAB)로 발색시켜 흡광도를 측정하여 효소 활성을 측정하였다[16]. 0.
NO 생성량은 24시간 후에 상층액를 모아 griess 시약으로 10분간 반응시킨 후에 540 nm에서 흡광 도로 측정하였다. LPS만 첨가한 군에서 생성된 NO의 양을 100%로 하여 시료가 첨가된 경우에 측정된 흡광도를 환산하여 표기하였다.
Nitric oxide(NO) 측정은 세포의 상층액에서의 nitric oxide(NO)의 양을 nitrite와 nitrate로서 측정을 하였다[8]. Nitrite에 대한 nitrate로 환원된 후의 안전한 형태인 griess reagent(Sigma, USA)를 사용하였으며, 6 well plate에 2×106개의 cell을 confluence가 80%일 때, PBS로 2번 washing한 후에 무혈청 배지를 사용하여 12시간 이상 배양시킨 후에 lipopolysaccharide(LPS) 10 µg/mL을 대조군을 뺀 모든 well에 다 넣어서 자극시켰다.
Nitrite에 대한 nitrate로 환원된 후의 안전한 형태인 griess reagent(Sigma, USA)를 사용하였으며, 6 well plate에 2×106개의 cell을 confluence가 80%일 때, PBS로 2번 washing한 후에 무혈청 배지를 사용하여 12시간 이상 배양시킨 후에 lipopolysaccharide(LPS) 10 µg/mL을 대조군을 뺀 모든 well에 다 넣어서 자극시켰다.
RAW 264.7 세포에 시료용액의 여러 농도(1, 10, 100, 1000 µg/mL) 또는 양성 대조군을 1시간 전처리한 후 LPS(1 µg/mL)를 처리하고 24시간 배양하였다.
따라서 본 실험에서는 섬쑥부쟁이 에틸아세테이트 분획물의 농도를 100 µg/mL 이하의 농도에서 nitric oxide량을 측정하였다.
페놀계 물질들은 식물체에 특수한 색깔을 부여하고, 한 분자 내에 2개 이상의 phenolic hydroxyl(OH)기를 가진 방향족 화합물들을 가리키며, 플라보노이드와 탄닌이 주성분으로 충치 예방, 고혈압 억제, 항에이즈, 항산화, 항암 등의 다양한 생리활성을 가진다[29]. 본 실험에서는 섬쑥부쟁이의 용매별 분획물에 존재하는 총 페놀 함량을 tannic acid를 이용하여 작성한 표준곡선으로 mg/g TAE(tannic acid equivalent) 단위로 나타내었다. 각 분획물에 함유된 총 폴리페놀 함량을 분석한 결과는 Table 1과 같다.
본 연구에서는 섬쑥부쟁이 분획물을 이용하여 항산화 효과와 항염증 효과를 동시에 가지는 활성을 탐색하였으며, 그 중 가장 우수한 활성을 나타낸 섬쑥부쟁이 에틸아세테이트 분획물을 이용하여 pro-inflammation 및 anti- inflammation 등 다양한 메커니즘 내의 in vitro 검색법을 수행하였다. 결론적으로, 섬쑥부쟁이 에틸아세테이트 분획물의 항염증 활성은 관련 분야의 활용 가치로서 이용 가능성이 크다고 판단된다.
본 연구에서는 섬쑥부쟁이 추출물과 분획물의 산화와 염증에 대한 저해 효과가 있는지에 대한 연구를 조사하였다. 섬쑥부쟁이 70% 메탄올 추출물은 헥산층, 에틸아세테이트층, 부탄올층, 물층을 극성별로 분획하였다. 섬쑥부쟁이로부터 분획한 에틸아세테이트 추출물과 부탄올 추출물의 전자공여능은 50 µg/mL에서 각각 58.
섬쑥부쟁이 에틸아세테이트 분획물이 iNOS를 저해하는 효과가 있는지 알아보기 위하여 Raw 264.7 cell에 LPS(10 µg/µL)을 처리하고 1시간 뒤, 섬쑥부쟁이 에틸아세테이트 분획물을 100 µg/mL로 처리 한 후 24시간 배양한 후 iNOS, protein의 발현 변화를 western blotting으로 확인하였다.
시료의 추출은 섬쑥부쟁이 5 kg을 시료 중량의 10배 양인 70% 메탄올을 가하여 상온에서 1주일간 3회 추출한 다음 filter paper(Whatman No. 2)로 여과하였고, 얻어진 여액은 감압농축하여 메탄올 추출물(472.7 g)을 얻었다. 섬쑥부쟁이 메탄올 추출물을 물에 현탁 후, 현탁액과 n-hexane을 1:1 비율로 분획 깔대기에 넣고 n-hexane층과 물층으로 분획하였고, n-hexane층을 다시 감압 농축하여 154.
39 µg/mL와 비교 시 유의적인 효과를 나타내었다. 에틸아세테이트 분획물은 부탄올 분획물 또는 70% 메탄올 추출물과 비교했을 때, 각 분획물 중 전자공여능이 가장 우수한 것으로 나타나 phenolic hydroxyl(OH)기가 free radical의 환원 능력에 영향을 미친 것으로 추정하였다.
전자공여능(EDA: electron donating ability)은 기존에 보고된 방법을 변형하여 96 well plate에 맞게 수정하여 측정하였다[3]. 각 시료용액 2 mL에 0.
즉, 100배 희석한 시료용액 3 mL에 Folin-Ciocalteu phenol reagent 시약 1 mL를 가하고, 1 N HCl 0.2 mL을 넣은 후, 포화용액 Na2CO3 1 mL를 가하여 혼합한 후 1시간 실온에서 방치하고, 640 nm에서 흡광도를 측정한 후, 표준물질인 tannic acid로 미리 작성한 표준곡선의 흡광도 값과 비교하여 폴리페놀 함량을 산출하였다.
대상 데이터
본 실험에 사용한 섬쑥부쟁이(Aster glehni Fr. Schm.)는 2009년 7, 8월경 경북 울릉군 울릉읍에서 건조된 잎을 구입하여 실험재료로 사용하였다.
본 실험에 이용한 각 세포의 배양은 10% fetal bovine serum(FBS)과 1% penicillin/streptomycin(100 U/mL)을 첨가한 Dulbeco's modified eagle’s medium(DMEM) 배지를 사용하였으며, 37℃, 5% CO2 incubator에 적응시켜 계대 배양하였다.
22g를 얻었다. 이상의 동일한 과정을 EtOAc, n-BuOH, 물로 순차적으로 가하여 각각 74.66 g, 87.84 g, 155.98 g의 분획물을 얻은 후, 동결 건조하여 용매를 제거한 뒤 실험에 사용하였다(Fig. 1).
이론/모형
Superoxide anion radical 소거능은 nitroblue tetrazolium(NBT) 환원방법에 의해 측정하였다[10]. 각 시료용액 0.
세포 독성 측정은 Carmichael 등[6]의 방법에 따라 각 세포주 macrophage(Raw 264.7) cell을 96 well plate에 0.6~ 8×103cells/well이 되게 0.18 mL 분주하고, 시료를 농도 별로 조제하여 0.02 mL 첨가한 후 37℃, 5% CO2 배양기에서 24시간 배양하였다.
대조군인 ascorbic acid의 10 µg/mL과 비교 시 에틸아세테이트 분획물이 28.5%의 전자공여능을 나타내어 ascorbic acid 보다 다소 낮은 활성을 확인할 수 있었으나, IC50 값에서는 에틸아세테이트 분획물이 8.90 µg/mL로 ascorbic acid의 9.39 µg/mL와 비교 시 유의적인 효과를 나타내었다.
대조군인 tannic acid(7.02±0.82 mgTAE/g)의 폴리페놀 함량과 비교 시 에틸아세테이트 분획물의 폴리페놀 함량이 더욱 높게 나타났음을 알 수 있었으며, phenolic hydroxyl(OH)기의 활성물질은 메탄올 추출물(6.77±0.43 mgTAE/g)에서 EtOAc 분획물로 더욱 이행한 것으로 추정하였다.
또한, IC50 값은 에틸아세테이트 분획물이 39.69 µg/mL로 ascorbic acid의 83.72 µg/mL 와 비교 시 우수한 효과를 나타내었다.
모든 용매추출물에서 농도 유의적으로 흡광도 수치가 감소함을 알 수 있었고, 에틸아세테이트 분획물의 경우에는 5 µg/mL의 농도에서 29.5%로 비교적 높은 저해활성을 보였다.
섬쑥부쟁이 헥산 분획물은 10 µg/mL에서 17.91%, 에틸아세테이트 분획물은 10 µg/mL에서 24.37%, 부탄올 분획물은 10 µg/mL에서 15.74%, 물 분획물은 10 µg/mL에서 8.75%의 저해 효과가 나타났고, 대조군인 (+)-Catechin의 경우, 10 µg/mL에서 31.61%의 저해능을 나타내어, 섬쑥부쟁이 분획물이 고분자 hyaluronic acid의 염증반응 조절에 다소 낮은 역할을 한 것으로 나타 났다.
섬쑥부쟁이로부터 분획한 에틸아세테이트 추출물과 부탄올 추출물의 전자공여능은 50 µg/mL에서 각각 58.0%, 46.4%를 나타냈다.
섬쑥부쟁이의 에틸아세테이트 분획물은 7.91±0.07 mgTAE/g로 총 폴리페놀 함량이 가장 많이 함유되어 있으며, 헥산 분획물은 2.78±0.12 mgTAE/g, 부탄올 분획물은 6.45±0.27 mgTAE/g, 물 분획물은 5.95±0.66 mgTAE/g를 함유하고 있었다.
9%를 억제하였다. 이는 Byun 등[5]의 현삼 메탄올 추출물과 Kim 등[15]의 상황 H2O 추출물의 LPS로 유도된 Raw cell의 NO 생성 억제능에 미치는 결과와 비교하여 보면 섬쑥부쟁이 분획물 중 에틸아세테이트 분획물의 NO 생성 억제능이 가장 우수하다는 것을 확인할 수 있었다.
5%로 비교적 높은 저해활성을 보였다. 이는, 대조군인 (+)-catechin의 18.97% 보다 우수하였으며, 에틸아세테이트 분획물은 대체로 저농도에서 우수한 활성을 보였다.
이때 세포의 여러 조건에서도 그 발현정도의 차이가 거의 없는 house keeping gene인 GAPDH에 대한 섬쑥부쟁이 EtOAc 분획물의 iNOS protein 발현율은 50 µg/mL을 처리한 농도에서 81.5%을 감소시켜 우수한 활성이 관찰되었다(Fig. 8).
5%의 저해 효과를 나타냈다. 이러한 에틸아세테이트 추출물의 항염증 효과는 nitric oxide 생성 억제에서도 유의했으며, Raw 264.7 cell 내 LPS에 의해 유도된 iNOS 단백질에서 50 µg/mL의 EtOAc 추출물을 처리시 81.5%의 발현을 억제하는 효과가 확인되었다.
6과 같이 나타내었다. 즉 섬쑥부쟁이 에틸아세테이트 분획물이 lipopolysaccharide(LPS)로 유도된 nitric oxide의 생성을 감소시킨 것인지, 섬쑥부쟁이 에틸아세테이트 분획물의 세포 독성으로 인한 cell population의 저하에서 기인하는 것인지를 측정한 결과, 전 농도에서 20% 이하의 세포 독성을 나타내었다. 따라서 본 실험에서는 섬쑥부쟁이 에틸아세테이트 분획물의 농도를 100 µg/mL 이하의 농도에서 nitric oxide량을 측정하였다.
항염증 효과와 관련된 hyaluronidase와 lipoxygenase의 저해 활성에 대한 에틸아세테이트 분획물의 효과는 5 µg/mL의 농도에서 각각 24.37%, 29.5%의 저해 효과를 나타냈다.
후속연구
본 연구에서는 섬쑥부쟁이 분획물을 이용하여 항산화 효과와 항염증 효과를 동시에 가지는 활성을 탐색하였으며, 그 중 가장 우수한 활성을 나타낸 섬쑥부쟁이 에틸아세테이트 분획물을 이용하여 pro-inflammation 및 anti- inflammation 등 다양한 메커니즘 내의 in vitro 검색법을 수행하였다. 결론적으로, 섬쑥부쟁이 에틸아세테이트 분획물의 항염증 활성은 관련 분야의 활용 가치로서 이용 가능성이 크다고 판단된다. 추가적인 연구로, 분획물 내 어떠한 화합물이 우수한 항염증 활성을 나타내는지를 확인하여 아토피 유발 NC/ Nga mice를 이용한 항아토피 연구와 같은 in vivo test를 제안한다.
추가적인 연구로, 분획물 내 어떠한 화합물이 우수한 항염증 활성을 나타내는지를 확인하여 아토피 유발 NC/ Nga mice를 이용한 항아토피 연구와 같은 in vivo test를 제안한다. 또한, 향후 기능성 화장품, 연고제 등의 산업적 가치를 고려했을 때, 제재 첨가 시에 따른 안정성 및 안전성 등에 관한 추가적인 연구가 필요하다고 사료된다.
결론적으로, 섬쑥부쟁이 에틸아세테이트 분획물의 항염증 활성은 관련 분야의 활용 가치로서 이용 가능성이 크다고 판단된다. 추가적인 연구로, 분획물 내 어떠한 화합물이 우수한 항염증 활성을 나타내는지를 확인하여 아토피 유발 NC/ Nga mice를 이용한 항아토피 연구와 같은 in vivo test를 제안한다. 또한, 향후 기능성 화장품, 연고제 등의 산업적 가치를 고려했을 때, 제재 첨가 시에 따른 안정성 및 안전성 등에 관한 추가적인 연구가 필요하다고 사료된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
섬쑥부쟁이에 함유된 물질로 무엇이 있나요?
Aster속 식물들은 한방에서 뱀에 물린데 상처를 치료하거나 타박상을 치료하는데 사용되어 왔다[13]. 현재까지 섬쑥부쟁이에 관하여 알려진 물질로는 β-amyrin acetate, phytol, alismol, α-tocopheryl, quinone, α-spinasterol, 10-O-methyl-alismoxide, alismoxide, 3-O-[6'-O-palmitoyl-β-Dglucosyl]-spinasta-7, 22-diene[20]와 α-pinene, limonene, δ-elemene, β-pienene, cis-3-hexenol, myrcene 외 25종과 살초활성 물질인 coumarin[14]이 있다. 본 연구에서는 섬쑥부쟁이 메탄올 추출물로부터 용매 분획한 섬쑥부쟁이 분획물에 대해 항산화, 항염증에 대한 여러 종류의 in vitro 검색법을 실시하여, 식품과 제약 그리고 화장품 산업에 적용하기 위한 천연소재로서의 가치를 검토하였다.
섬쑥부쟁이란?
방향성 식용식물자원의 하나인 섬쑥부쟁이는 울릉도 산지에서 자생하는 국화과 개미취 속 다년초로서 모양은 취나물과 비슷하게 생겼고, 울릉도에서는 부지깽이라고 부르는데 이른 봄 새순을 잘라 식용하면 향이 진하다. 높이 1~1.
염증 반응이 지속되어 활성 질소종과 활성 산소종이 과다하게 발생하면, 어떤 문제를 발생시키나요?
염증 반응의 조절은 대단히 복잡한 것으로 알려져 있는데, 이는 생체 내 복구체계의 증강 및 손상을 감소시키기 위한 것으로 알려져 있다. 그러나 반복되는 조직의 손상이나 재생에 의해 염증반응이 지속되면, 염증관련 세포에서 ROS와 RNS가 과다 생성되고 그 결과로 영구적인 유전자의 변형이 야기된다[2]. 이처럼 ROS와 RNS는 생체 내 여러 가지 세포의 작용을 조절하는 염증 반응과 깊이 관련되어 있다.
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