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문제 정의
- 동의보감에서는 해 열 제, 이뇨제로 이용하며, 민간요법에서는 기침, 천식 등에 쓰이고 있으며, 잎에서 즙을 내어 벌레 물린 데에도 사용한다. 쑥부쟁이의 생리활성에 대한 연구는 전혀 없으므로, 본 연구는 쑥부쟁이를 사용하여 小 u泊0에서의 암세포 증식 억 제효 과와 암 예방 지 표로 쓰이는 quinone reductase 유도 활성 에 대한 연구를 하여 보고하는 바이다.
제안 방법
- 각 세포주를 1 x 105 cells/ well의 농도로 맞추고 24 well에 각각 1 mL씩 첨가하여 24시간 동안 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양한 후 용매 종류별 분획물을 각각 일정량의 dimethyl sulfoxide(DMSO)에 녹여서 100, 200, 300, 400 및 500 Pg/mL의 농도로 첨가하였다. 48시간 동안 배양한 후 각 well에 PBS 완충액에 녹인 MTT 용액 (3 mg/mL)을 100 虬씩 첨가하여 4시간 동안 다시 배 양 시킨 후, well 바닥에 형성된 formazan이 흩어지지 않게 상 등 액을 제거하고 DMSO와 ethanol을 1:1로 혼합한 용액 1 mL를 첨가하여 천천히 녹인 후 UV-visible spectrophoto- meter를 이용하여 570 nm와 690 nm에서 각각 흡광도를 측정하여 대조군 세포 수를 100%로 하였을 때의 상대적인 세 포성 장 억제율을 구하였다.
- 본 실험에 사용한 암 세포주는 인체 간암 세포인 HepG2 (human hepatocellular carcinoma), 자궁경부암 세포인 HeLa (human cervicse adenocarcinoma) 및 유방암 세포인 MCF- 7(human brease adenocarcinoma pleual effusion)로서 2003년 5월 한국 세포주 은행 (Korean Cell Line Bank, KCLB)에 서구입하였다. HepG2, HeLa 및MCF-7세 포주는는 DMEM medium에 10% fetal bovine serum(FBS) 100 mL와 1% 100 units/mL의 penicillin streptomycin lOmL가 함유된 배지를 사용하여 , 37℃ 5% CO2 incubator에서 monolayer로 배 양하였다. 일주일에 3번 새로운 배지로 교환하고 7~8일 만에 PBS (Phosphate buffered saline) 세척한 후 0.
- QR 생성 유도 효과는 Prochaska와 Santamaria의 방법(19)을 일부 변형하여 측정하였다. 즉 T-75 flask에서 배양 중인 HepG2 세 포가 80%이상 증식하게 되 면 24 well plate의 각 well에 1 X104 cells/mL가 되도록 HepG2세 포를 분주하여, 37℃ 5% CO2 incubator에 24시간 동안 배양한 후 쑥부쟁이 추출물을 각각 DMSO에 녹여 40, 60, 80 및 100 Pg/mL의 농도로 첨가하고 다시 24시간 동안 배양한 다음 배양액을 제거하였다.
- 시료로 사용된 쑥부쟁이는 건조 후 분말화하여 시료 중량 의 배의 메탄올을 첨가한 후 37℃에서 진탕한 후 4시간 동안 진탕하여 3회 반복 추출하고 회전식 진공 농축기로 감압 농 축시 킨 후 동결 건조하여 쑥부쟁이 의 methanol 추출물(AYM) 을 얻고, 이 추출물을 각 용매 별로 분획하여 hexane층(AY- MH), ethyl ether 층(AYMEE), ethyl acetate 층(AYMEA), butanol층(AYMB) 및 물층 분획물(AYMA)을 얻었다. 각 분획물을 감압 농축 후 동결 건조하여 시료로 사용하였다.
- 쑥부쟁이 추출 분획물의 암세포 증식억제 효과는 3-(4, 5- dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide를 사용하여 MTT assay로 행하였다. 각 세포주를 1 x 105 cells/ well의 농도로 맞추고 24 well에 각각 1 mL씩 첨가하여 24시간 동안 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양한 후 용매 종류별 분획물을 각각 일정량의 dimethyl sulfoxide(DMSO)에 녹여서 100, 200, 300, 400 및 500 Pg/mL의 농도로 첨가하였다. 48시간 동안 배양한 후 각 well에 PBS 완충액에 녹인 MTT 용액 (3 mg/mL)을 100 虬씩 첨가하여 4시간 동안 다시 배 양 시킨 후, well 바닥에 형성된 formazan이 흩어지지 않게 상 등 액을 제거하고 DMSO와 ethanol을 1:1로 혼합한 용액 1 mL를 첨가하여 천천히 녹인 후 UV-visible spectrophoto- meter를 이용하여 570 nm와 690 nm에서 각각 흡광도를 측정하여 대조군 세포 수를 100%로 하였을 때의 상대적인 세 포성 장 억제율을 구하였다.
- 본 연구는 약용 및 식용 식물로 사용되고 있는 쑥부쟁이 추출물과 분획물의 암세포 증식 억제 효과와 QR 유도 효과를 실험하였다. 쑥부쟁이 의 metanol 추출 및 용매 분획물의 암세포 증식 억제 효과를 MTT assay로 실험한 결과, 3종의 인체 암 세포주, 간암 세포주인 HepG2, 자궁경부암 세포주인 HeLa 및 유방암 세포주인 MCF-7에서 모두 쑥부쟁이의 ethyl ether 분획 층인 AYMEE층과 ethyl acetate 분획 층인 AYMEA층에서 암세포 성장 저지 효과가 제일 컸다.
- 시료로 사용된 쑥부쟁이는 건조 후 분말화하여 시료 중량 의 배의 메탄올을 첨가한 후 37℃에서 진탕한 후 4시간 동안 진탕하여 3회 반복 추출하고 회전식 진공 농축기로 감압 농 축시 킨 후 동결 건조하여 쑥부쟁이 의 methanol 추출물(AYM) 을 얻고, 이 추출물을 각 용매 별로 분획하여 hexane층(AY- MH), ethyl ether 층(AYMEE), ethyl acetate 층(AYMEA), butanol층(AYMB) 및 물층 분획물(AYMA)을 얻었다. 각 분획물을 감압 농축 후 동결 건조하여 시료로 사용하였다.
- 암 예 방지 수로 사용되는 quinone reductase(QR) 유도 효과 여부를 조사하기 위하여 쑥부쟁이 분획물의 암세포 증식 억제 효과에 사용된 3종의 인체 암세 포주 중 유일하게 quinone reductase를 가지고 있는 간암 세포주인 HepG2를 사용하여 QR 유도 활성 효과를 측정하였으며 , 그 결과는 Fig. 4에 나타내었다. 즉, HepG2 세포주에 각각의 시료 분획물을 40, 60, 80 및 100 Ug/mL의 농도로 첨가했을 때 쑥부쟁이 의 hexane 분획층 AYMH에서 QR 효소 활성을 월등히 증가시키 는 것으로 나타났다.
- QR 생성 유도 효과는 Prochaska와 Santamaria의 방법(19)을 일부 변형하여 측정하였다. 즉 T-75 flask에서 배양 중인 HepG2 세 포가 80%이상 증식하게 되 면 24 well plate의 각 well에 1 X104 cells/mL가 되도록 HepG2세 포를 분주하여, 37℃ 5% CO2 incubator에 24시간 동안 배양한 후 쑥부쟁이 추출물을 각각 DMSO에 녹여 40, 60, 80 및 100 Pg/mL의 농도로 첨가하고 다시 24시간 동안 배양한 다음 배양액을 제거하였다. 배지가 제거된 각 well에 250 UL의 lysis buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8.
- 02% EDTA(Gibco BRL)을 사용하여 부착된 세포를 분리하였다. 집적된 암세포에 배지를 넣고 암세포가 골고루 분산되도록 피 펫으로 잘 혼합하여 75 mL cell culture flask에 10 mL씩 일정량 분할하여 주입하고, 6~7일마다 계대 배양하면서 실험에 사용하였다.
대상 데이터
- 실험에 사용된 쑥부쟁이는 2003년 5월 진주 시내의 한 재래시장에서 구입하여 깨끗하게 손질하여 씻은 후 음건하였다. 암세포 증식 억제 실험에 사용된 시약 중 NP-40과 menadione 은은 Sigma사(St. Louis, USA) 제품을 사용하였고, flavin adenine dinucleotide (FAD), dicumarol 및 glucose- 6-phosphate dehydrogenase는 Amresco사(USA) 제품을 구 입하였으며, minimum essential medium(MEM), Dulbeco's Eagle modified medium(DMEM)고]" phosphate buffered sa~ line(PBS) 등은 Gibco-BRL(Grand Island Biologic Co., USA) 에서 구입하였으며, 그 외 연구에 사용된 용매 및 시약은 특급을 사용하였다.
- 본 실험에 사용한 암 세포주는 인체 간암 세포인 HepG2 (human hepatocellular carcinoma), 자궁경부암 세포인 HeLa (human cervicse adenocarcinoma) 및 유방암 세포인 MCF- 7(human brease adenocarcinoma pleual effusion)로서 2003년 5월 한국 세포주 은행 (Korean Cell Line Bank, KCLB)에 서구입하였다. HepG2, HeLa 및MCF-7세 포주는는 DMEM medium에 10% fetal bovine serum(FBS) 100 mL와 1% 100 units/mL의 penicillin streptomycin lOmL가 함유된 배지를 사용하여 , 37℃ 5% CO2 incubator에서 monolayer로 배 양하였다.
- 실험에 사용된 쑥부쟁이는 2003년 5월 진주 시내의 한 재래시장에서 구입하여 깨끗하게 손질하여 씻은 후 음건하였다. 암세포 증식 억제 실험에 사용된 시약 중 NP-40과 menadione 은은 Sigma사(St.
이론/모형
- 4) 혼합액을 250 11L씩 첨가하여 효소 반응을 정지시키고 UV-visible spectrophotometer를 이용하여 610 nm에서 흡광도를 측정하여 계산하였다. 그리고 단백질 량은 동일한 set의 well plate에 대한 crystal violet 염색 방법으로 정량하였다.
- 쑥부쟁이 추출 분획물의 암세포 증식억제 효과는 3-(4, 5- dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide를 사용하여 MTT assay로 행하였다. 각 세포주를 1 x 105 cells/ well의 농도로 맞추고 24 well에 각각 1 mL씩 첨가하여 24시간 동안 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양한 후 용매 종류별 분획물을 각각 일정량의 dimethyl sulfoxide(DMSO)에 녹여서 100, 200, 300, 400 및 500 Pg/mL의 농도로 첨가하였다.
성능/효과
- 즉, 시료 농도 200 Jig/mL를 첨가했을 때 AYMEE, AYMEA 및 AYMB 분획물 모두에서 월등히 암세포 증식억제 효과가 나타났으며 평균 약 70% 이상의 억제율을 보였다. 300 Ug/mL를 첨가했을 때는 AYMEE에서 95.2%의 아주 높은 암세포 증식 억제 효과를 나타내었고, AYMEA의 경우 87.3%, AYMB 의 경우 78.4%이었으며 AYMH층의 경우는 낮은 시료 첨가 농도에서는 그 억제 효과가 미약하였으나 시료 최고 첨가 농도인 500 mg/mL에서 AYMH층은 91.9%로 AYMEA층의 결과와 거의 유사하였다. Fig.
- 5%의 높은 암세포 증식 억제 효과를 보여 시료 농도 증가 시 유사한 수준의 암세포 증식 억제 효과를 나타내었다. AYMEA의 경우 100 Ug/mL을 첨가했을 때 73.9%의 높은 효과가 나타났으며, 200 Ug/mL에서 는 83.3%를 나타내 어 농도의 존 적으로로 계속 높은 암세포 증식억제 효과를 나타내었고, AYMB의 경우 시료 농도 200 Ug/mL를 첨 가시 89.7%의 높은 암세포 증식 억제 효과가 나타났으며 첨가 농도를 증가시켜도 대체적으 로 그 효과가 유지되었다. 즉, 다섯 가지의 용매 분획 중 AYMEE, AYMEA 및 AYMB층에서 높은 암세포 증식 억제 효과를 나타냈으며 hexane층인 AYMH에서는 300 Ug/mL 시료 첨가농도에서부터 암세포 성장저지 효과가 좋았으며 최고 첨가 농도인 500 Ug/mL에서는 AYM층과 같이 앞서의 세 분획 층 AYMEE, AYMEA 및 AYMB층의 효과와 거의 같은 경향이었다.
- 그다음으로는 AYMEE층이 었으며, 그 외의 분획 층은 영향을 미치지 않았다. AYMH의 경우 용매 대 조 군을 1.0으로 하여 비교한 결과, 40, 60, 80 및 100 Ug/mL의 시료 첨가 농도에서 각각 1.92, 2.31, 2.28 및 2.46으로 높은 QR 유도 활성효과를 나타내었으며, AYMEE의 경우 각각 1.25, 1.47, 1.71 및 1.88이었다.
- Butanol층인 AYMB와 메탄올층인 AYM에서는 대체적으로 낮은 농도에서는 효과가 약하였으나 300 Ug/mL 이상에서는 높은 암세포 성장저지 효과를 보였다. HepG2 세포를 이용하여 암 예방 지수인 QR 유도 활성을 측정한 결과, 다른 분획 층에 비해 비극성 용매 층인 hexane 분획 층, AYMH에서 QR 유도 활성을 증가시키는 경향이었다.
- 본 연구는 약용 및 식용 식물로 사용되고 있는 쑥부쟁이 추출물과 분획물의 암세포 증식 억제 효과와 QR 유도 효과를 실험하였다. 쑥부쟁이 의 metanol 추출 및 용매 분획물의 암세포 증식 억제 효과를 MTT assay로 실험한 결과, 3종의 인체 암 세포주, 간암 세포주인 HepG2, 자궁경부암 세포주인 HeLa 및 유방암 세포주인 MCF-7에서 모두 쑥부쟁이의 ethyl ether 분획 층인 AYMEE층과 ethyl acetate 분획 층인 AYMEA층에서 암세포 성장 저지 효과가 제일 컸다. 특히 HepG2 세포주에서는 AYMEE를 200 Ug/mL 첨가 시 켰을 때 94.
- 이상의 결과로서 일반적으로 암 예방 효과의 지수로 사용되는 QR 유도 활성효과는 쑥부쟁이 성분 중 비극성 친유성 성분이 녹아있는 hexane 분획 층에 제일 많이 존재할 것으로 생 각되 며 ethyl ether 분획 층에도 quinone reductase의 활성 유도 물질이 존재함으로서 쑥부쟁이의 비극성 용매에 녹아 있는 높은 생리활성 물질의 존재를 추정할 수 있었다.
- 이상의 결과를 종합해 볼 때, 3종의 암 세포주 HepG2, HeLa 및 MCF-7에 대하여 모두 AYMEE, AYMEA 및 AYMB층 에서 높은 암세포 증식억제 효과를 나타내었다. Lee 등(20)은 국화과인 쑥갓잎에서 테르페노이드계 화합물을 분리하여 펴】, 결장 등 3종의 인체의 암세포 주에 대하여 비교적 강한 활성을 나타내었음을 보고하였는데 본 연구에서도 쑥부쟁이가 암세포 증식 억제 효과가 높게 나타나 암세포 주의 종류 는 다르나 국화과의 식물이 인체 암 세포주에 강한 활성이 있음을 확인할 수 있었다.
- 3은 유방암 세 포주인 MCF-7의 결과이며, 이 경우에서도 HepG2와 HeLa 세포주의 결과와 비슷하게 나타났다. 즉 AYMA를 제외한 모든 분획 층에서 농도의 존 적 인 유사한 경향이 었으며, AYMEE를 200 Ug/mL 를 첨가했을 때 이미 82.9%의 높은 암세포 증식 억제 효과를 나타내었으며, 300 Ug/mL 첨가의 경우 AYMEE는 93.9%, AYMEA는 92.1%의 암세포 증식 억제 효과를 나타내었다. 그 효과는 첨가농도를 500 Ug/mL 증가 시 켜도 그대로 유지 되었다.
- 1은 인체 간암 세포주인 HepG2에 용매별 각 시료 분 획 물을 100, 200, 300, 400 및 500 Pg/mL씩 농도를 증가 시 키며 첨가하였을 때의 암세포 증식억제 효과를 나타낸 것이며, 200 Ug/mL 첨가 시부터 AYMEE, AYMEA 및 AYMB 층에서 높은 암세포 증식 억제 효과가 나타났다. 즉, AYMEE를 가했을 경우 200 Ug/mL 첨가했을 때 이미 94.5%의 높은 암세포 증식 억제 효과를 보여 시료 농도 증가 시 유사한 수준의 암세포 증식 억제 효과를 나타내었다. AYMEA의 경우 100 Ug/mL을 첨가했을 때 73.
- 4에 나타내었다. 즉, HepG2 세포주에 각각의 시료 분획물을 40, 60, 80 및 100 Ug/mL의 농도로 첨가했을 때 쑥부쟁이 의 hexane 분획층 AYMH에서 QR 효소 활성을 월등히 증가시키 는 것으로 나타났다. 그다음으로는 AYMEE층이 었으며, 그 외의 분획 층은 영향을 미치지 않았다.
- 7%의 높은 암세포 증식 억제 효과가 나타났으며 첨가 농도를 증가시켜도 대체적으 로 그 효과가 유지되었다. 즉, 다섯 가지의 용매 분획 중 AYMEE, AYMEA 및 AYMB층에서 높은 암세포 증식 억제 효과를 나타냈으며 hexane층인 AYMH에서는 300 Ug/mL 시료 첨가농도에서부터 암세포 성장저지 효과가 좋았으며 최고 첨가 농도인 500 Ug/mL에서는 AYM층과 같이 앞서의 세 분획 층 AYMEE, AYMEA 및 AYMB층의 효과와 거의 같은 경향이었다. 자궁경부암 세포주인 HeLa에 대한 실험 결과는 Fig.
- 1의 HepG2 세포주에 대한 암세포 증식 억제 효과와 매우 유사한 결과를 나타내었다. 즉, 시료 농도 200 Jig/mL를 첨가했을 때 AYMEE, AYMEA 및 AYMB 분획물 모두에서 월등히 암세포 증식억제 효과가 나타났으며 평균 약 70% 이상의 억제율을 보였다. 300 Ug/mL를 첨가했을 때는 AYMEE에서 95.
- 쑥부쟁이 의 metanol 추출 및 용매 분획물의 암세포 증식 억제 효과를 MTT assay로 실험한 결과, 3종의 인체 암 세포주, 간암 세포주인 HepG2, 자궁경부암 세포주인 HeLa 및 유방암 세포주인 MCF-7에서 모두 쑥부쟁이의 ethyl ether 분획 층인 AYMEE층과 ethyl acetate 분획 층인 AYMEA층에서 암세포 성장 저지 효과가 제일 컸다. 특히 HepG2 세포주에서는 AYMEE를 200 Ug/mL 첨가 시 켰을 때 94.5%의 암세포 증식 억제 효과가 나타났으며, 농도를 증가시킬수록 그 효과가 커져 500 Ug/mL에서는 97.7%의 저지 효과를 보였다. MCF-7 세포주와 HeLa 세포주에서도 이와 비슷한 경향이었다.
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