문제 정의

• 본 연구에서는 국내에 자생하는 왕대, 분죽, 조릿대, 호마죽과 같은 주요 대나무종 산림토양의 낙엽층, 부식층 그리고 근권토양 내 분포하는 방선균 밀도를 조사하고 방선균을 수집하였으며, 각 대나무림 토양으로부터 분리된 대표 방선균의 계통학적 다양성을 조사하여 바이오 소재산업에 활용 가능한 유전자원 다양성 확보를 위한 기반연구를 수행하였다.

제안 방법

• 16S rRNA유전자 PCR 증폭산물은 1% agarose gel, 0.5×TAE buffer (0.045 M Tris-borate, 0.001 M EDTA)에서 100V, 25 mA로 30분 동안 전기영동(Mupid-21, Gel documentation system, Bio-Rad, USA)한 후, ethidtum bromide (EtBr)로 15분간 염색하여 UV 하에서 증폭여부를 확인하고, QIAquick® PCR Purification kit (QIAGEN Inc.)를 이용하여 정제하였다.
• 28°C에서 10일간 배양하면서 평판배지 상에 형성된 방선균 콜로니를 계수하고 순수분리하였다(13).
• vesicatoria KACC 12872) 및 식중독균(Bacillus cereus KACC 11240)을 한국농업미생물자원센터(KACC)로부터 분양받아 검정균주로 사용하였다. Botrytis cinerea 곰팡이에 대한 항균활성 검정은 in vitro 항균활성 확인법에 따라 PDA 배지에 검정균주를 각각 접종한 후 분리된 방선균 균주를 대치배양하여 균체 주위에 형성된 생육저지대(growth inhibitor clear zone)의 크기에 따라 항균활성 수준을 결정하였다. Xanthomonas campestris, Xanthomonas axonopodis pv.
• PCR은 27 Forward primer, 1 μl; 1492 Reverse primer, 1 μl; EF-Taq polymerase (Solgent co., Korea), 0.25 μl; dNTP, 1 μl; 10× buffer, 5 μl; band doctor, 5 μl; H2O, 36.75 μl를 0.2 ml PCR tube에 넣고 잘 혼합한 후, initial denaturation 94°C, 2 min; denaturation 94°C, 30 sec; annealing 54-56°C, 40 sec; extention 72°C, 1 min동안 30 cycle을 반복하고, 72°C에서 5 min간 final extention의 조건으로 PCR (GeneAMPR PCR System 9700, Applied Biosystems) 반응을 실시하였다.
• 순수 배양된 방선균 단일 colony를 주형으로 직접 PCR 증폭을 하였다. E.
• )를 이용하여 정제하였다. 정제된 16S rRNA 유전자 PCR 증폭 산물은 27 Forward primer와 1492 Reverse primer를 각각 사용하여 ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction kit (Applied Biosystems)로 cycle sequencing을 수행한 후, ABI PRISM 310 Genetic Analyser (Applied Biosystems)로 약 700 bp 이상 결정하였다. 결정된 16S rRNA 유전자 염기서열은 NCBI의 GenBank (http://www.
• 희석된 시료 100 μl를 방선균 선택배지인 SCA (Starch, 10 g; Casein, 1 g; MgSO4·7H2O, 1.02 g; K2HPO4, 0.5 g; Agar, 1.5%; cycloheximide, 0.25 g, pH 5.5) 평판배지에 분주하여 고르게 도말하였다.

대상 데이터

• E. coli 16S rDNA 부분의 conserved sequence를 기초로 한 27F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′) primer와 1492R (5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGC-3′) primer를 사용하였다.
• 대나무 산림토양으로부터 수집된 방선균 330균주를 대상으로 형태 관찰을 통하여 분류된 36개 방선균군집에 속하는 대표 방선균 36균주와 우점적으로 나타낸 방선균군집으로부터 14균주를 선발하였다. 각 대표 방선균에 대해 16S rRNA 유전자 염기서열을 결정하고 RDP ( 7×10⁸ CFU/g의 매우 높은 밀도로 분포하였다. 본 연구에서는 대나무림 낙엽층으로부터 100균주, 부식층으로부터 70균주 그리고 근권토양으로부터 160균주로 총 330균주의 방선균을 수집하였다. 이들 분리된 균주들의 기균사, 기중균사 및 색소형성 등을 관찰한 결과 36개 방선균 군집으로 분류되었다.
• 7×10⁸ CFU/g의 높은 밀도로 계수되었다. 본 연구에서는 이들 다양한 종류의 대나무림 낙엽층으로부터 100균주, 부식층으로부터 70균주, 근권토양으로부터 160균주 총 330균주의 방선균을 수집하였다.
• 수집된 방선균의 항균활성능을 검토하기 위하여 국내 대표적인 식물병원성곰팡이로 딸기잿빛곰팡이병원균(Botrytis cinerea KACC 40963)과 세균성흑마병원균(Xanthomonas campestris KACC 10913), 고추세균성점무늬병원균(Xanthomonas axonopodis pv. vesicatoria KACC 12872) 및 식중독균(Bacillus cereus KACC 11240)을 한국농업미생물자원센터(KACC)로부터 분양받아 검정균주로 사용하였다. Botrytis cinerea 곰팡이에 대한 항균활성 검정은 in vitro 항균활성 확인법에 따라 PDA 배지에 검정균주를 각각 접종한 후 분리된 방선균 균주를 대치배양하여 균체 주위에 형성된 생육저지대(growth inhibitor clear zone)의 크기에 따라 항균활성 수준을 결정하였다.
• 전라남도 담양 죽녹원 내에 자생하고 있는 왕대(Phyllostachys bambusoides), 분죽(Phyllostachys nigro var. henonis), 조릿대(Sasa boreali), 호마죽(Phyllostachys nigra f. punctata) 대나무림의 낙엽층, 부식층, 표층으로부터 약 15 cm 아래의 근권으로부터 토양시료를 채취하였다. 채취한 토양시료는 polyethylene vinyl에 넣어 4°C에 보존한 후 24시간 이내에 실험하였다(31).

• 각 group에 속하는 Streptomyces 속의 참조균주와 비교한 결과, Streptomyces alni, Streptomyces violaceolatus 등을 포함하는 group I에 2균주가 속하였으며, Streptomyces acidiscabies, Streptomyces capoamus, Streptomyces graminofaciens, Streptomyces griseochromogenes, Streptomyces olivochromogene, Streptomyces nojiriensis, Streptomyces olivochromogene, Streptomyces pulveraceus, Streptomyces tauricus 등을 포함하는 group II에 35균주가 속하는 특징을 나타내었다. Streptomyces pensis, Streptomyces ldicus 등을 포함하는 group III에 6균주가 포함되었으며, Streptomyces purpureus, Kitasatospora azatica, Kitasatospora kifunensis 등을 포함하는 group IV에는 7균주가 포함되었다(Fig. 1).
• 본 연구에서 수집한 방선균을 Botrytis cinerea, Xanthomonas campestris 그리고 Xanthomonas axonopodis pv. vesicatoria에 대해 항균활성능을 검토한 결과, 각 74균주, 16균주, 25균주 그리고 24균주가 항균활성능을 나타내었다.
• 0 (Molecular evolutionary genetics analysis)을 사용하여 Phylogenetic tree 분석한 결과, 4개의 group으로 분류되었다. 각 group에 속하는 Streptomyces 속의 참조균주와 비교한 결과, Streptomyces alni, Streptomyces violaceolatus 등을 포함하는 group I에 2균주가 속하였으며, Streptomyces acidiscabies, Streptomyces capoamus, Streptomyces graminofaciens, Streptomyces griseochromogenes, Streptomyces olivochromogene, Streptomyces nojiriensis, Streptomyces olivochromogene, Streptomyces pulveraceus, Streptomyces tauricus 등을 포함하는 group II에 35균주가 속하는 특징을 나타내었다. Streptomyces pensis, Streptomyces ldicus 등을 포함하는 group III에 6균주가 포함되었으며, Streptomyces purpureus, Kitasatospora azatica, Kitasatospora kifunensis 등을 포함하는 group IV에는 7균주가 포함되었다(Fig.
• 이들 분리된 균주들의 기균사, 기중균사 및 색소형성 등을 관찰한 결과 36개 방선균 군집으로 분류되었다. 각 그룹으로부터 대표 방선균 50균주를 선발하여 16S rRNA 유전자 염기서열을 해석하고 계통학적 위치를 검토한 결과, 94%가 Streptomyces 속에 속하였으며, cluster I (2균주), II (35균주), III (6균주), 그리고 IV (7균주)에 속하는 특징을 나타내었다. 대나무 산림토양으로부터 수집된 Streptomyces 속 방선균 50균주를 Shannon-Wiener법에 의해 다양성 지수를 산출한 결과, 대나무림 낙엽층으로부터 수집된 방선균의 다양도는 3.
• 대나무 산림토양으로부터 수집된 방선균 330균주를 대상으로 형태 관찰을 통하여 분류된 36개 방선균군집에 속하는 대표 방선균 36균주와 우점적으로 나타낸 방선균군집으로부터 14균주를 선발하였다. 각 대표 방선균에 대해 16S rRNA 유전자 염기서열을 결정하고 RDP (http://rdp.cme.msu.edu/)를 이용하여 상동성 검색한 결과, 47균주가 Streptomyces 속에 속하였으며 Kitasatospora 속에 속하는 균주는 3균주로 확인되었다.
• 각 층위별 방선균 밀도를 조사한 결과 2.7×106-2.7×108 CFU/g로 상수리림 토양(2.2×105-3.2×106 CFU/g)에 비해 10-100배 이상 높은 계수치를 나타내었으며, 특히 조릿대 낙엽층 내에는 2.7×108 CFU/g의 높은 밀도로 계수되었다.
• 국내 자생하는 왕대, 분죽, 조릿대, 호마죽과 같은 다양한 대나무 산림토양의 낙엽층, 부식층, 근권토양 내 방선균 밀도 측정 결과, 2.7×106-2.7×108 CFU/g로 계수되었으며, 특히 조릿대 낙엽층 내에는 2.7×108 CFU/g의 매우 높은 밀도로 분포하였다.
• nojiriensis에 속하는 25균주가 항균활성균주로 선발되었다. 그리고 S. capoamus, S. acidiscabies, S. griseochromogenes, S. olivochromogene, S. tauricus, S. pulveraceus, S. purpureus, K. azatica, K. kifunensis에 속하는 24균주가 Bacillus cereus에 대한 항균활성능을 나타내었다(Table 5). 이상의 결과로부터 대나무 산림토양은 바이오 소재로 활용할 수 있는 항균활성 방선균을 탐색할 수 있는 우수한 서식처라고 판단된다.
• 기균사의 색상은 gray, brown, pink, yellow, orange, black, purple, kaki 그리고 ivory 등 9가지의 색을 나타내었으며, 이들 균주 중 97균주가 gray색의 기균사로 대부분 백색 포자를 형성하였다. 기중균사는 white, ivory, yellow, orange, pink, brown 그리고 purple 등 7가지의 색을 나타내었으며, 206균주가 백색의 기중균사를 나타내었다.
• 기균사의 색상은 gray, brown, pink, yellow, orange, black, purple, kaki 그리고 ivory 등 9가지의 색을 나타내었으며, 이들 균주 중 97균주가 gray색의 기균사로 대부분 백색 포자를 형성하였다. 기중균사는 white, ivory, yellow, orange, pink, brown 그리고 purple 등 7가지의 색을 나타내었으며, 206균주가 백색의 기중균사를 나타내었다. 배지 내 수용성 색소는 yellow, brown, pink, purple 등 4가지 색소를 형성하였으며, 배지표면을 변색시키는 균주도 다수 포함되었다.
• punctata) 대나무림의 낙엽층, 부식층, 근권토양으로부터 채취한 시료의 pH, 수분함량 및 방선균 밀도 측정 결과를 Table 1에 나타내었다. 대나무 산림토양 낙엽층 pH는 6.4-6.6을 나타내었으며, 부식층은 약 pH 5.0, 근권 토양은 pH 4.8-6.4를 나타내어 낙엽층에 비해 비교적 낮은 pH를 나타내었다. 각 층위별 방선균 밀도를 조사한 결과 2.
• 각 그룹으로부터 대표 방선균 50균주를 선발하여 16S rRNA 유전자 염기서열을 해석하고 계통학적 위치를 검토한 결과, 94%가 Streptomyces 속에 속하였으며, cluster I (2균주), II (35균주), III (6균주), 그리고 IV (7균주)에 속하는 특징을 나타내었다. 대나무 산림토양으로부터 수집된 Streptomyces 속 방선균 50균주를 Shannon-Wiener법에 의해 다양성 지수를 산출한 결과, 대나무림 낙엽층으로부터 수집된 방선균의 다양도는 3.33으로 부식층과 근권토양 보다 높게 나타났으며, 근권토양으로부터 수집된 방선균의 88%가 cluster II에 속하는 특징을 나타내었다. 본 연구에서 수집한 방선균을 Botrytis cinerea, Xanthomonas campestris 그리고 Xanthomonas axonopodis pv.
• 대나무 산림토양으로부터 수집된 방선균 총 330균주를 딸기 잿빛곰팡이병원균(Botrytis cinerea), 세균성흑마병원균(Xanthomonas campestris) 그리고 고추세균성점무늬병원균(Xanthomonas axonopodis pv. vesicatoria)에 대한 항균활성능을 검토한 결과, S. alni, S. violaceolatus, S. graminofaciens, S. olivochromogene, S. acidiscabies, S. capoamus, S. olivochromogene, S. griseochromogenes, S. nojiriensis, S. pulveraceus, S. tauricus, S. platensis, S. ldicus, S. purpureus, K. azatica, K. kifunensis를 포함하는 74균주가 딸기잿빛곰팡이병원균에 대한 항균활성능을 나타내었다. 세균흑마병원균에 대해 항균활성능을 나타낸 16균주는 S.
• 89로 확인되어 높은 다양성을 나타내었다. 대나무림 부식층으로부터 수집된 6균주는 각각 cluster II, III, IV에 속하였으며, 근권토양으로부터 수집된 방선균의 88%가 cluster II에 속하여 다양성 지수는 1.68, 균등도 지수는 0.75를 나타내었고, subcluster 9, 10, 13에 우점적으로 분포하였다(Table 3).
• 대표 방선균 50균주에 대한 16S rRNA 유전자 염기서열을 CLUSTAL X로 Multiple sequence alignment 한 후, MEGA 4.0 (Molecular evolutionary genetics analysis)을 사용하여 Phylogenetic tree 분석한 결과, 4개의 group으로 분류되었다. 각 group에 속하는 Streptomyces 속의 참조균주와 비교한 결과, Streptomyces alni, Streptomyces violaceolatus 등을 포함하는 group I에 2균주가 속하였으며, Streptomyces acidiscabies, Streptomyces capoamus, Streptomyces graminofaciens, Streptomyces griseochromogenes, Streptomyces olivochromogene, Streptomyces nojiriensis, Streptomyces olivochromogene, Streptomyces pulveraceus, Streptomyces tauricus 등을 포함하는 group II에 35균주가 속하는 특징을 나타내었다.
• 이상의 결과로부터 국내에 자생하는 대나무 산림 토양의 낙엽층, 부식층 및 근권토양 내에는 높은 밀도의 방선균이 분포하여 방선균의 우수한 서식처임을 확인할 수 있었다. 또한 대나무림 낙엽층, 부식층 및 근권토양으로부터 수집된 방선균의 96% 이상이 Streptomyces 속에 속하는 특징을 나타내었으며, 이들 Streptomyces 속 방선균은 층위별로 특징적인 계통군이 분포해 있음을 알 수 있었다.
• 배지 내 수용성 색소는 yellow, brown, pink, purple 등 4가지 색소를 형성하였으며, 배지표면을 변색시키는 균주도 다수 포함되었다. 또한 층위별 수집된 방선균 콜로니 특성을 확인한 결과, 대나무림 낙엽층으로부터 수집된 방선균 100균주는 총 23개의 군집형태로 나타났으며, 기균사가 생성되지 않거나 yellow 또는 pink색을 나타내는 16, 21, 22의 군집형태가 높은 비율을 나타내었다. 부식층으로부터 수집된 방선균 70균주에 대하여 콜로니 특성을 확인한 결과, 총 17개의 군집으로 분류 할 수 있었으며, 기균사가 gray 또는 kaki색을 나타내는 2, 27 군집형태가 우점적으로 분포하였다.
• 부식층으로부터 수집된 방선균 70균주에 대하여 콜로니 특성을 확인한 결과, 총 17개의 군집으로 분류 할 수 있었으며, 기균사가 gray 또는 kaki색을 나타내는 2, 27 군집형태가 우점적으로 분포하였다. 또한, 근권 토양으로부터 수집된 방선균 160균주는 총 26개의 군집형태로 분류되었으며, 기균사가 gray, yellow, white 또는 kaki색을 나타내는 4, 6 13, 16, 27 군집형태가 높은 비율을 나타내었다.
• 방선균은 유전적 다양성과 함께 기능적 다양성을 지니고 있기 때문에 고부가가치 자연자원으로 경제적 잠재가치를 가진 것으로 인정되고 있다. 방선균은 항생물질을 포함한 생리활성물질을 생산하는 균주로 주목 받아 오면서 지금까지 알려진 약 10,000여 종의 항생물질 중 75% 이상이 방선균에 의해 분리되었으며, 생리활성물질은 약 64%가 방선균류, 곰팡이류 25.6%, 기타 미생물로부터 분리되었다. 이와 같이 항생물질 및 생리활성물질 등 다양한 종류의 천연유기화합물을 생산하는 방선균은 미생물 유전자원의 보고로서 신물질의 탐색 및 생합성기작에 대해 깊이 연구되어 왔다(3, 6).
• 본 연구에서 대나무 산림토양으로부터 수집된 Streptomyces 속 방선균 50균주를 Lanoot의 16S rRNA 유전자 정보를 바탕으로 분류한 4개의 cluster 및 25개의 subcluster 계통군과 비교 검토한 결과, 대나무림 낙엽층으로부터 수집된 방선균은 cluster I, II, III, IV에 모두 속하였으며 다양성 지수는 3.33, 균등도 지수는 0.89로 확인되어 높은 다양성을 나타내었다. 대나무림 부식층으로부터 수집된 6균주는 각각 cluster II, III, IV에 속하였으며, 근권토양으로부터 수집된 방선균의 88%가 cluster II에 속하여 다양성 지수는 1.
• 본 연구에서 수집한 16S rRNA 유전자 염기서열 해석 결과, 분리균주 중 9균주는 Streptomyces 속 근연종과 98.5% 이하의 상동성을 나타내어 신종으로 제안 할 수 있는 균주로 예상되었다(Table 4). 이상의 결과로부터 국내에 자생하는 대나무 산림 토양의 낙엽층, 부식층 및 근권토양 내에는 높은 밀도의 방선균이 분포하여 방선균의 우수한 서식처임을 확인할 수 있었다.
• 본 연구에서는 대나무 산림토양으로부터 수집된 방선균 330균주의 형태분류를 위하여 SCA 평판배지에 배양 후 Bergey's Manual of Determinative Bacteriology 8판에 의거하여 방선균 형태(기균사; aerial mycelium, 기중균사; substrate mycelium 및 색소형성)를 관찰한 결과, 총 36개 방선균군집으로 대분류되었다(Table 2).
• 또한 층위별 수집된 방선균 콜로니 특성을 확인한 결과, 대나무림 낙엽층으로부터 수집된 방선균 100균주는 총 23개의 군집형태로 나타났으며, 기균사가 생성되지 않거나 yellow 또는 pink색을 나타내는 16, 21, 22의 군집형태가 높은 비율을 나타내었다. 부식층으로부터 수집된 방선균 70균주에 대하여 콜로니 특성을 확인한 결과, 총 17개의 군집으로 분류 할 수 있었으며, 기균사가 gray 또는 kaki색을 나타내는 2, 27 군집형태가 우점적으로 분포하였다. 또한, 근권 토양으로부터 수집된 방선균 160균주는 총 26개의 군집형태로 분류되었으며, 기균사가 gray, yellow, white 또는 kaki색을 나타내는 4, 6 13, 16, 27 군집형태가 높은 비율을 나타내었다.
• kifunensis를 포함하는 74균주가 딸기잿빛곰팡이병원균에 대한 항균활성능을 나타내었다. 세균흑마병원균에 대해 항균활성능을 나타낸 16균주는 S. capoamus, S. tauricus, S. acidiscabies, S. platensis에 속하는 특징을 나타내었으며, 고추세균성점무늬병원균의 경우 S. olivochromogene, S. violaceolatus, S. capoamus, S. griseochromogenes, S. graminofaciens, S. acidiscabies, S. tauricus, S. nojiriensis에 속하는 25균주가 항균활성균주로 선발되었다. 그리고 S.
• 본 연구에서는 대나무림 낙엽층으로부터 100균주, 부식층으로부터 70균주 그리고 근권토양으로부터 160균주로 총 330균주의 방선균을 수집하였다. 이들 분리된 균주들의 기균사, 기중균사 및 색소형성 등을 관찰한 결과 36개 방선균 군집으로 분류되었다. 각 그룹으로부터 대표 방선균 50균주를 선발하여 16S rRNA 유전자 염기서열을 해석하고 계통학적 위치를 검토한 결과, 94%가 Streptomyces 속에 속하였으며, cluster I (2균주), II (35균주), III (6균주), 그리고 IV (7균주)에 속하는 특징을 나타내었다.
• 이상의 결과로부터 36개 방선균군집 중 11개 군집(2, 3, 4, 5, 7, 11, 13, 16, 27, 29, 32)이 대나무 산림토양의 각 층위에 공통적으로 분포하였으며, 특히 2, 4, 16, 27 군집이 우점적으로 분포하는 특징을 나타내었다.
• 5% 이하의 상동성을 나타내어 신종으로 제안 할 수 있는 균주로 예상되었다(Table 4). 이상의 결과로부터 국내에 자생하는 대나무 산림 토양의 낙엽층, 부식층 및 근권토양 내에는 높은 밀도의 방선균이 분포하여 방선균의 우수한 서식처임을 확인할 수 있었다. 또한 대나무림 낙엽층, 부식층 및 근권토양으로부터 수집된 방선균의 96% 이상이 Streptomyces 속에 속하는 특징을 나타내었으며, 이들 Streptomyces 속 방선균은 층위별로 특징적인 계통군이 분포해 있음을 알 수 있었다.
• 이상의 결과로부터 대나무 산림토양으로부터 수집된 방선균은 계통학적으로 4개의 Streptomyces 속 group에 속하는 다양한 방선균이 존재함을 알 수 있었으며, 특히 group II에 속하는 Streptomyces가 우점 계통군임이 확인되었다.
• kifunensis에 속하는 24균주가 Bacillus cereus에 대한 항균활성능을 나타내었다(Table 5). 이상의 결과로부터 대나무 산림토양은 바이오 소재로 활용할 수 있는 항균활성 방선균을 탐색할 수 있는 우수한 서식처라고 판단된다.