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문제 정의
- 본 연구에서는 Demospongiae 강에 속하는 해면 Callyspongia elegans에서 배양가능한 세균을 분리·배양하여 탐색하고, 16S rDNA를 비교하여 세균의 군집 구조를 분석하고자 한다.
제안 방법
- 16S rDNA gene 염기서열로부터 계통학적 다양성을 분석해 보았다. 그 결과, C.
- 16S rDNA 유전자 증폭하기 위해 27 Forward (5′-AGAGTTTGATC CTGGCTCAG-3′) primer와 1522 Reverse (5′-AAGGAGGT GATCCAGCCGCA-3′) primer를 사용하였다.
- PCR 반응의 조성은 추출된 DNA 1 µl, 10 pmol/primer 1 µl, 10 mM dNTPs, 10X PCR buffer, 5 Unit Taq polymerase (TaKaRa, Japan), DW를 혼합하여 최종부피 25 µl로 맞추어 수행하였다. PCR 반응은 95℃에서 Initial denaturation 5분, 30 cycle 동안 94℃에서 denaturation 1분, 55℃에서 annealing 1분, 72℃에서 extention 3분을, 72℃분간 final extention로, PCR (Thermal cycler, Bio-Rad) 조건하에 실시하였다. 증폭된 PCR 산물은 1% agarose에서 전기영동(Mupid®-ex, ADVANCE)하여 확인하였다.
- PCR 반응의 조성은 추출된 DNA 1 µl, 10 pmol/primer 1 µl, 10 mM dNTPs, 10X PCR buffer, 5 Unit Taq polymerase (TaKaRa, Japan), DW를 혼합하여 최종부피 25 µl로 맞추어 수행하였다.
- 균질화된 시료는 연속희석법으로 희석 후, 현탁액을 marine agar (MA, Difco, USA), R2A (Difco) 배지에 도말 한 후 25℃에 7일간 배양하였다. 각 배지상에 나타난 군락을 육안으로 관찰했을 때 군락의 모양, 크기, 색깔 등에 따라 형태적으로 분류, 선별하여 순수분리 하였다. 각 분리된 미생물은 20% (v/v) glycerol에 현탁하여 초저온 냉동고(-80℃)에 동결 보관하였다.
- 균주의 형태학적 특징은 그람염색으로 그람양성균과 그람음성균을 구분하였다. 그람염색은 Color Gram 2 kit (bioMérieux)를 이용하여 균체를 슬라이드 글라스에 열고정하고, 크리스탈 바이올렛으로 1분 염색 후 세척, 요오드 용액으로 1분간 고정, 알코올로 15초간 탈색 후 사프라닌으로 다시 45초 염색하는 과정을 통해 수행하였다.
- 85% NaCl 용액에 넣어 homogenizer로 균질화 하였다. 균질화된 시료는 연속희석법으로 희석 후, 현탁액을 marine agar (MA, Difco, USA), R2A (Difco) 배지에 도말 한 후 25℃에 7일간 배양하였다. 각 배지상에 나타난 군락을 육안으로 관찰했을 때 군락의 모양, 크기, 색깔 등에 따라 형태적으로 분류, 선별하여 순수분리 하였다.
- 그람염색은 Color Gram 2 kit (bioMérieux)를 이용하여 균체를 슬라이드 글라스에 열고정하고, 크리스탈 바이올렛으로 1분 염색 후 세척, 요오드 용액으로 1분간 고정, 알코올로 15초간 탈색 후 사프라닌으로 다시 45초 염색하는 과정을 통해 수행하였다.
- 또한 방선균은 ISP2 배지에서 7–10일 배양 후 포자의 색상을 기록하였다.
- 모아진 DNA을 70% ethanol로 세척하여 TE buffer 50‒100µl와 RNase (10 mg/ml)를 첨가한 후 UV-Vis Spectrophotometer(UV, mini240, Shamdzu)로 DNA 농도를 측정한다.
- 분리된 plasmid DNA는 ㈜제노텍(Korea)에 의뢰하여 염기서열을 분석 하였다. 분석된 염기서열은 EzBioCloud 이용하여 유사한 염기서열을 비교하여 가장 근연속이나 종으로 나타나는 서열을 확인하였다.
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염기서열 분석 및 계통학적 분석
분리된 균주의 16S rDNA 유전자 염기서열은 EzbioCloud를 이용하여 유사한 염기서열을 비교하였다. 계통수(Felsenstein, 1981; Saitou and Nei, 1987)를 작성한 결과는 Fig.
- 분리된 plasmid DNA는 ㈜제노텍(Korea)에 의뢰하여 염기서열을 분석 하였다. 분석된 염기서열은 EzBioCloud 이용하여 유사한 염기서열을 비교하여 가장 근연속이나 종으로 나타나는 서열을 확인하였다. 본 연구에 의해서 결정된 염기서열과 EzBioCloud에서 회수된 표준미생물 염기서열은 Mega 4.
- Phenol/ Chloroform/ Isoamylalcohol (25:24:1)를 첨가 후 원심분리(13,000 rpm, 5분)하여 깨끗한 상층액을 새 마이크로 튜브에 옮겨주고, 옮겨진 부피의 2배의 chloroform/ isoamylalcohol (24:1)를 첨가하였다. 상층액을 새 튜브에 조심스럽게 옮겨 isopropanol를 첨가하여 DNA를 확인하였다. 모아진 DNA을 70% ethanol로 세척하여 TE buffer 50‒100µl와 RNase (10 mg/ml)를 첨가한 후 UV-Vis Spectrophotometer(UV, mini240, Shamdzu)로 DNA 농도를 측정한다.
- 클로닝 산물은 ampicillin, IPTG, X-gal이 포함된 LB agar 배지에서 도말 후 37℃, 16시간 동안 배양하여 흰 집락을 선별하였다. 선별한 집락을 ampicillin이 포함된 LB broth에 접종하여 16시간 배양하여 DNA-spin Plasmid DNA Extraction Kit (iNtRON, Korea)를 사용하여 plasmid DNA를 분리하였다. 분리된 DNA는 1% agarose gel에서 전기영동하여 확인하였다.
- 순수 배양된 세균들은 MA, R2A 평판배지에 2–3일 배양한 후 집락의 색상을 기록하였다.
- 그람염색은 Color Gram 2 kit (bioMérieux)를 이용하여 균체를 슬라이드 글라스에 열고정하고, 크리스탈 바이올렛으로 1분 염색 후 세척, 요오드 용액으로 1분간 고정, 알코올로 15초간 탈색 후 사프라닌으로 다시 45초 염색하는 과정을 통해 수행하였다. 염색 후 광학현미경(AX10SCOPE A1, ZEISS)을 통해서 그람양성균과 그람음성균을 관찰하였다.
- 증폭된 PCR 산물은 1% agarose에서 전기영동(Mupid®-ex, ADVANCE)하여 확인하였다.
- 채집한 해면은 멸균된 인공해수에 세척 후, 해면의 안쪽을 1 g 정도 잘라 멸균된 0.85% NaCl 용액에 넣어 homogenizer로 균질화 하였다. 균질화된 시료는 연속희석법으로 희석 후, 현탁액을 marine agar (MA, Difco, USA), R2A (Difco) 배지에 도말 한 후 25℃에 7일간 배양하였다.
대상 데이터
- 16S rDNA 분석은 추출된 genomic DNA를 사용하였다. 16S rDNA 유전자 증폭하기 위해 27 Forward (5′-AGAGTTTGATC CTGGCTCAG-3′) primer와 1522 Reverse (5′-AAGGAGGT GATCCAGCCGCA-3′) primer를 사용하였다.
- 본 연구에서는 해면 Callyspogia elegans는 제주도 문섬 앞바다 수심 10 m에서 스쿠버 다이빙에 의해 채집하였다. 채집한 해면은 즉시 해수가 담아진 멸균된 용기에 보관하여 운반하였으며, 4℃에서 보관 후 미생물을 분리하는데 사용하였다.
데이터처리
- 분석된 염기서열은 EzBioCloud 이용하여 유사한 염기서열을 비교하여 가장 근연속이나 종으로 나타나는 서열을 확인하였다. 본 연구에 의해서 결정된 염기서열과 EzBioCloud에서 회수된 표준미생물 염기서열은 Mega 4.0 software (Tamura et al., 2007)에 포함된 Clustal W 프로그램(Thomson et al., 1994)을 이용하여 multiple alignment로 정렬하였다.
이론/모형
- Genomic DNA는 MINI-PREP 방법을 사용하여 분리하였다. 액체배지에 접종하여 배양 후 원심분리로 상층액을 제거 후 모아진 pellet을 사용하였다.
성능/효과
- MA보다 R2A 배지에서 세균수가 훨씬 낮게 계수되었다. C. elegans에서 배양가능한 세균은 총 112균주가 분리되었다. 그람염색법으로 확인한 결과로 그람양성균은 37균주, 그람음성균은 75균주로 그람음성균이 더 많게 분포하는 것으로 나타났다.
- Bacteroidetes 그룹에 속하는 균주는 다른 그룹과는 달리 낮은 염기서열 유사도를 보여주었다. CE81는 Actibacter sediminis JC2129T와 91.9%, Tenacibaculum 속(genus) 분리균주들은 Tenacibaculum crassostreae JO-1T , Tenacibaculum litopenaei B-IT , Tenacibaculum litoreum CL-TF13T 91.8‒94.5%낮은 상동성이 확인되었다. 이와 같이 16S rDNA 유전자 염기서열 비교를 통해 분리된 112균주 중 16균주가 표준균주와 유전자 염기서열의 97% 이하의 상동성을 보여 새로운 속 또는 종으로 보고될 가능성이 있다고 판단된다.
- 1%의 유사도를 보여주었다. Endozoicomonas 속은 Endozoicomonas elysicola MKT110T와 Endozoicomonas montiporae CL-33T과 93.6‒93.8, 96.2%의 상동성을 보여주었다.
- Firmicutes 그룹에 속해 있는 균주는 대부분 기존의 염기서열과 95.1‒100% 상동성을 보여주었으며, CE84는 Lysinibacillus massiliensis 4400831T과 97.2%, CR9, CR12는 각각 Paenibacillus chondroitinus DSM 5051T , Paenibacillus telluris PS38T와 96.8%와 95.1%의 낮은 유사도를 나타내었다. 그리고 Actinobacteria 그룹에 속하는 균주는 기존의 염기서열과 98.
- Proteobacteria 계통군은 다시, Alphaproteobacteria, Gammaproteobacteria 계통에 각각 39%와 22%에 속하였음을 확인하였으며(Fig. 3), Proteobacteria가 다른 분류군에 비해 우점하는 것을 알 수 있었다. 이는 해양환경에서 일반적으로 서식하며, 해양 해면에서도 높은 비율로 분포하는 것으로 보고 되었고(Li et al.
- Proteobacteria 그룹은 기존의 염기서열과 93–100%의 상동성을 나타내었다.
- 그람염색법으로 확인한 결과로 그람양성균은 37균주, 그람음성균은 75균주로 그람음성균이 더 많게 분포하는 것으로 나타났다. 균주의 집락의 색깔은 아이보리색, 노란색, 흰색, 갈색 등으로 다소 제한적으로 나타남을 알 수 있었다.
- 16S rDNA gene 염기서열로부터 계통학적 다양성을 분석해 보았다. 그 결과, C. elegans의 주요 세균 군집구조로 Proteobacteria(Alphaproteobacteria, Gammaproteobacteria), Actinobacteria, Firmicutes, Bacteroidetes의 4개의 문(Phylum), 5개의 강(Class), 9개의 목(order), 15개의 과(Family), 그리고 23개의 속(Genus)으로 구성되었다(Table 1). 그 중 Gammaproteobacteria 문(phylum)에는 4개의 목(order), 5개의 과(family), 5개의 속(genus)으로 Actionobacteria 문(phylum)에서는 5개의 과, 6개의 속(genus) 등 다양한 분류군이 나타났다(Table 1).
- elegans의 주요 세균 군집구조로 Proteobacteria(Alphaproteobacteria, Gammaproteobacteria), Actinobacteria, Firmicutes, Bacteroidetes의 4개의 문(Phylum), 5개의 강(Class), 9개의 목(order), 15개의 과(Family), 그리고 23개의 속(Genus)으로 구성되었다(Table 1). 그 중 Gammaproteobacteria 문(phylum)에는 4개의 목(order), 5개의 과(family), 5개의 속(genus)으로 Actionobacteria 문(phylum)에서는 5개의 과, 6개의 속(genus) 등 다양한 분류군이 나타났다(Table 1).
- elegans에서 배양가능한 세균은 총 112균주가 분리되었다. 그람염색법으로 확인한 결과로 그람양성균은 37균주, 그람음성균은 75균주로 그람음성균이 더 많게 분포하는 것으로 나타났다. 균주의 집락의 색깔은 아이보리색, 노란색, 흰색, 갈색 등으로 다소 제한적으로 나타남을 알 수 있었다.
- 1%의 낮은 유사도를 나타내었다. 그리고 Actinobacteria 그룹에 속하는 균주는 기존의 염기서열과 98.0‒100%의 상동성을 보여주었다. Bacteroidetes 그룹에 속하는 균주는 다른 그룹과는 달리 낮은 염기서열 유사도를 보여주었다.
- 속(genus)은 Pseudovibrio 30%, Bacillus 13%, Microbulbife 10%, Pseudoalteromonas, Streptomyces, Ruegeria 5%, Mycobacterium와 Tenacibaculum 그리고 Endozoicomonas는 4%, Lysinibacillus, Paenibacillus 3%이며, Rhodococcus 2%, Nocardia, Marmoricola, Sanguibacter, Actibacter, Marinitalea, Brevibacillus, Pseudomonas, Lysobacter, Stenotrophomonas, Labrenzia, Rhizobium는 1%순으로 구성되어 있으며, Pseudovibrio(34균주), Bacillus (14균주), Microbulbifer (11균주)로 나타났다(Fig. 2).
- 3). 이 결과와 비교하여 볼 때 공통적으로 나타난 Proteobacteria를 제외하고는 세균군집 구조가 서로 다르게 분류되고 있음을 알 수 있었고, C. elegans에서는 다양한 세균군집을 나타났음을 확인하였다. 이는 해면 종에 따라 세균군집 구조가 서로 다르다는 연구(Li et al.
- 5%낮은 상동성이 확인되었다. 이와 같이 16S rDNA 유전자 염기서열 비교를 통해 분리된 112균주 중 16균주가 표준균주와 유전자 염기서열의 97% 이하의 상동성을 보여 새로운 속 또는 종으로 보고될 가능성이 있다고 판단된다. 향후 표준균주와 함께 실험이 신종 실험이 수행되어야 할 것이다.
- 그리고 남태평양에서 서식하는 Callyspongia sp. 주요 공생세균으로 Proteobacteria, Chloroflexi, Cyanobacteria의 3개의 문에 속하는 세균 그룹이 보고되었으나(Park, 2010), 본 연구에서는 Proteobacteria, Firmicutes, Actinobacteria, Bacteroidetes의 4개의 문에 속하는 세균 그룹이 확인되었다(Fig. 3). 이 결과와 비교하여 볼 때 공통적으로 나타난 Proteobacteria를 제외하고는 세균군집 구조가 서로 다르게 분류되고 있음을 알 수 있었고, C.
- 평판배양법으로 세균 수를 측정한 결과, MA 배지에서 분리한 세균은 4.8 × 104 CFU/g, R2A 배지에는 2.0 × 104 CFU/g의 세균수가 관찰되었다.
- 해면 C. elegans에서 분리된 112균주는 24속 52종으로 동정되었다. Proteobacteria 그룹은 기존의 염기서열과 93–100%의 상동성을 나타내었다.
후속연구
- 이와 같이 16S rDNA 유전자 염기서열 비교를 통해 분리된 112균주 중 16균주가 표준균주와 유전자 염기서열의 97% 이하의 상동성을 보여 새로운 속 또는 종으로 보고될 가능성이 있다고 판단된다. 향후 표준균주와 함께 실험이 신종 실험이 수행되어야 할 것이다.
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