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문제 정의
- 특히 포도당이 정상적으로 세포 내로 유입되는 과정을 통해 지방이 합성됨에도 불구하고 지방의 축적이 감소하였다는 것은 세포 내 지방의 분해속도가 합성속도보다 높은 경우에 해당된다고 하겠다. 따라서 세포 내 지방분해에 관여하는 효소의 발현을 확인하고자 하였다.
- 본 연구에서는 수세미오이 메탄올 추출물의 지방구 감소효과를 검증하기 위하여 형성된 지방구를 분해 또는 감소시킬 수 있는 지 여부를 측정한 것으로 다소 고농도인 600 μg/mL와 1000 μg/mL에서 그 효과가 입증되었다.
- 주요 유효성분으로는 saponin, coumaric acid, α-spinasterol, stigmasterol 등을 포함하고 있으며 현재까지 항균성, 면역 조절 능력 등에 대한 연구가 진행된 바 있다. 본 연구에서는 아직까지 수행된 바가 없는 수세미오이의 항비만 효과를 평가하기 위하여 인체적용시험에 앞서 in vitro 3T3-L1 지방세포에서의 작용기전과 효능을 검증하고자 하였다.
- 지방세포에서 triglyceride의 분해는 insulin responsive lipase인 HSL에 의해 주로 매개되어지는 것으로 알려져 있는데 세포 내 지방의 함량을 조절하는 중요한 단계로 여겨지고 있다. 본 연구에서는 유리된 glycerol이 HSL 등의 지방분해효소에 의한 것인지 판단하기 위해 mRNA의 발현과 지방세포로 유입된 glucose의 양을 측정하였다.
제안 방법
- 1 μg의 총 RNA를 oligo(dT) primer와 superscript II 역전사효소와 함께 반응시켜 1차 cDNA를 제작하였다.
- 2일 후 10% fetal bovine serum(FBS)와 MDI solution(0.5 mM IBMX, 0.5 μM dexamethasone, 10 μg/mL insulin)을 포함한 DMEM 배지를 3일 동안 처리하였고 다시 10% FBS와 10 μg/mL insulin을 포함한 DMEM을 3일 동안 처리하였고 그 이후는 10% FBS를 포함한 DMEM으로 배양하며 세포 내 지방구의 형성을 근거하여 지방세포로 분화시켰다.
- 3T3-L1 지방전세포의 배양과 유지는 10% bovine calf serum(FCS)을 넣은 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM) 배지로 5% CO2, 37℃에서 60% 세포가 자랐을 때 계대배양을 하도록 하였다.
- 60-mm culture dish에서 분화된 3T3-L1 세포를 0, 100, 200, 400, 600, 1000 μg/mL 농도로 처리하여 48시간 동안 배양한 후 PBS로 2회 세척하고 1%(v/v) calcium chloride를 첨가시킨 4% formaldehyde로 세포를 30분간 상온에서 고정시켰다.
- 고정된 세포를 건조시킨 후 absolute alcohol에 포화 시켜 0.4 μm filter로 여과한 Oil-Red O 염색시약을 세포에 40분간 처리한 후 PBS로 Oil-Red O 염색시약을 3번에 걸쳐 충분히 세척하였고 DMSO로 염색된 지방구를 유출시킨 후 560 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 본 연구에서는 수세미오이 메탄올 추출물의 지방구 감소효과를 검증하기 위하여 형성된 지방구를 분해 또는 감소시킬 수 있는 지 여부를 측정한 것으로 다소 고농도인 600 μg/mL와 1000 μg/mL에서 그 효과가 입증되었다. 따라서 지방구의 감소에 대한 작용기작을 두 가지 측면에서 고려하였는데 첫째, 지방구의 분해로 인한 감소와 둘째, glucose 유입 억제로 인한 지방구 합성의 감소 측면에서 검토하였다.
- 배양 및 분화과정에서 생존하고 있는 세포의 수는 미토콘드리아의 MTT(3-[4,5-2-yl]-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)를 formazan dye로 전환하는 능력을 간접적으로 이용하여 확인하였다(12). 우선 3T3-L1 세포를 12-well plate에서 분화시킨 후 추가로 48시간 동안 배양하여 Hank's balanced salt solution에 용해시킨 50 mg/mL MTT 용액을 첨가하여 37℃에서 4시간 더 배양하고 상층액을 2번 PBS로 세척한 후 1 mL DMSO를 첨가하여 염색을 유출시킨 다음 570 nm(reference wavelength; 665 nm)에서 흡광도를 측정하였다.
- 분화된 3T3-L1 지방세포에서 수세미오이의 메탄올 추출물이 지방의 축적 및 분해에 미치는 영향을 확인하였다. 수세미오이의 메탄올 추출물 안전범위(0～1000 μg/mL)에서 지방대사 관련한 여러 과정을 확인한 결과 600 μg/mL 이상의 농도에서 세포 내 지방축적이 억제되었고 특히 지방구 내의 triglyceride 함량이 억제되는 것으로 나타났다.
- 세포 내 총 RNA를 추출하고 정량하기 위하여 RNeasy Mini kit를 이용하였다. 1 μg의 총 RNA를 oligo(dT) primer와 superscript II 역전사효소와 함께 반응시켜 1차 cDNA를 제작하였다.
- 우선 분화된 3T3-L1 세포를 48시간 동안 수세미오이 메탄올 추출물을 농도별로 처리한 후 PBS로 2회 세척하고 20 μL의 AdipoRed 시약을 첨가하여 20분간 추가로 상온에서 배양하였고 excitation 485 nm와 emission 572 nm에서 형광신호를 측정하여 결과를 얻었다.
- 수세미오이의 메탄올 추출물 안전범위(0～1000 μg/mL)에서 지방대사 관련한 여러 과정을 확인한 결과 600 μg/mL 이상의 농도에서 세포 내 지방축적이 억제되었고 특히 지방구 내의 triglyceride 함량이 억제되는 것으로 나타났다. 이러한 결과에 대한 기전을 위해 포도당의 유입 억제로 인한 세포 내 triglyceride의 합성감소와 지방분해효소의 활성화로 인한 세포 내 triglyceride의 분해 증가의 두 가지로 확인하였다. 우선적으로 수세미오이의 메탄올 추출물의 포도당 유입 억제 효과를 실험하였지만 아무런 영향이 나타나지 않았다.
대상 데이터
- 5% agarose gel에 전기영동한 후 EtBr로 염색하여 UV에서 DNA를 확인하였고 DNA의 정량적 분석은 Applied Biosystem Inc.(Foster city, CA, USA)에서 제공된 7500 Systems SD software version 3.1.을 이용하여 측정하였다. PCR에 사용된 primer set은 Table 1에 나타내었다.
- 3T3-L1 미분화된 지방세포는 American Type Culture Collection(ATCC CL173, Manassas, VA, USA)로부터 구입하였고 지방세포의 분화에 사용된 시약인 insulin, dexamethasone, 1-methyl 3-isobutylxanthin은 Sigma Co.로부터 구입하여 실험하였다.
- 수세미오이 동결건조 분말은 전라남도 장성군에서 수집하여 물로 깨끗이 세척하고 얇게 썰어 freezer에서 -70℃까지 급속 냉동시킨 후 동결건조기(freeze-dryer, Bondiro DC1316 Ilshin Lab Co., LTD., Yangju, Korea)에서 72시간 동안 건조하여 100 mesh 체로 입자를 고르게 하여 수세미오이 분말을 제조하였다. 제조된 수세미오이 분말은 para film으로 밀봉하여 -20℃에 냉동 보관하면서 사용하였다.
데이터처리
- 실험결과는 평균(mean)±표준편차(SD)로 나타내었고 통계적 유의성은 Duncan's multiple range test와 Student's t-test를 이용하여 그룹간의 차이를 통계처리한 후 p<0.05 수준에서 유의성을 검정하였다.
이론/모형
- 2). 대부분의 지방구는 triglyceride와 perilipin A와 같은 단백질로 구성되어 있기 때문에 지방구의 감소를 보다 세밀하게 확인하기 위해 triglyceride의 함량을 형광염색법에 의해 측정하였다(Fig. 3)(16). Oil-Red O 염색 결과와 마찬가지로 600 μg/mL와 1000 μg/mL의 농도에서 지방구 내의 triglyceride의 함량이 각각 13.
- 수세미오이 메탄올 추출물의 세포독성 범위를 분화된 3T3-L1 지방세포를 이용하여 MTT 시험법에 의해 측정하였다(Fig. 1). 0 μg/mL에서 1200 μg/mL 농도범위 내에서 측정한 결과 1200 μg/mL의 농도까지 세포의 생장에 영향을 미치지 못하였다.
- 50 μL의 배지를 glycerol reagent에 첨가하여 1분간 반응시킨 후 1-mL cuvette에 옮겨 넣고 흡광도를 540 nm에서 측정하였다. 이때 단백질량을 Bradford 방법으로 정량하여 세포수를 보정하였다.
성능/효과
- Oil-Red O 염색 결과와 마찬가지로 600 μg/mL와 1000 μg/mL의 농도에서 지방구 내의 triglyceride의 함량이 각각 13.5%와 21% 감소하는 것으로 나타났다.
- 이러한 결과는 동일 농도인 1000 μg/mL에서 HSL의 발현이 ATGL보다 더 많은 경향을 보여 영향성이 높은 것으로 생각되며 수세미오이 메탄올 추출물이 triglyceride에서 diglyceride로 분해되는 첫 단계에서 효과적으로 작용하는 것을 의미한다. 결론적으로 분화된 3T3-L1 지방세포에서 수세미오이 메탄올 추출물의 지방축적 억제효과는 HSL과 ATGL 지방분해 효소의 발현 증가에 의한 것으로 판단된다.
- , Tokyo, Japan)로 메탄올을 증발시켜 감압농축한 후 다시 동결건조 하여 실험 때까지 -20℃에 보관하였다. 메탄올 추출을 통해 얻어진 수세미오이의 수득율은 약 9%로 나타났다.
- 5 μM dexamethasone, 10 μg/mL insulin)을 포함한 DMEM 배지를 3일 동안 처리하였고 다시 10% FBS와 10 μg/mL insulin을 포함한 DMEM을 3일 동안 처리하였고 그 이후는 10% FBS를 포함한 DMEM으로 배양하며 세포 내 지방구의 형성을 근거하여 지방세포로 분화시켰다. 모두 12일 동안의 분화를 통해 80% 이상의 세포가 분화되었음을 확인하였다.
- 본 연구에서 수세미오이 메탄올 추출물 0 μg/mL에서 1000 μg/mL에서 처리한 결과 1000 μg/mL에서 유리된 glycerol의 정도가 24.3% 증가한 것을 확인하였는데 이는 triglyceride의 분해로 인한 것으로 생각된다(Fig. 4).
- 따라서 지방세포 내로 포도당의 유입은 지방세포의 분화와 세포내 지방의 축적에 중요한 역할을 한다고 하겠다. 본 연구에서 수세미오이 메탄올 추출물의 지방대사에 미치는 영향을 확인하기 위해 실험한 결과 분화된 3T3-L1 지방세포에서 세포 내 포도당의 유입은 농도에 따라 전혀 변화가 나타나지 않았다(Fig. 5). 특히 1000 μg/mL에서 감소하는 경향을 나타내었지만 통계적 유의성은 나타나지 않았다.
- 따라서 LPL, HSL 그리고 ATGL 효소간의 작용에 따라 세포 내 지방 축적과 분해가 일정 수준 조절을 받게 된다고 하겠다. 본 연구에서는 3T3-L1 지방세포로부터 LPL mRNA의 발현을 확인한 결과 수세미오이 메탄올 추출물의 처리에 따른 효과는 나타나지 않았다(Fig. 6). 이에 반해 HSL은 600 μg/mL과 1000 μg/mL 농도에서, 그리고 ATGL은 1000 μg/mL의 농도에서 mRNA의 발현이 각각 13%, 37%와 24%로 유의적인 증가를 나타내었다.
- 분화된 3T3-L1 지방세포에 수세미오이 메탄올 추출물을 0 μg/mL에서 1000 μg/mL까지 처리한 후 생성되었던 지방구에 미치는 영향을 확인하기 위해 Oil-Red O 시약으로 염색한 결과 600 μg/mL과 1000 μg/mL에서 각각 9.7%와 19.4%의 감소를 나타내었다(Fig. 2).
- 수세미오이의 메탄올 추출물 안전범위(0～1000 μg/mL)에서 지방대사 관련한 여러 과정을 확인한 결과 600 μg/mL 이상의 농도에서 세포 내 지방축적이 억제되었고 특히 지방구 내의 triglyceride 함량이 억제되는 것으로 나타났다.
- 이러한 결과는 동일 농도인 1000 μg/mL에서 HSL의 발현이 ATGL보다 더 많은 경향을 보여 영향성이 높은 것으로 생각되며 수세미오이 메탄올 추출물이 triglyceride에서 diglyceride로 분해되는 첫 단계에서 효과적으로 작용하는 것을 의미한다.
- 이에 반해 HSL은 600 μg/mL과 1000 μg/mL 농도에서, 그리고 ATGL은 1000 μg/mL의 농도에서 mRNA의 발현이 각각 13%, 37%와 24%로 유의적인 증가를 나타내었다.
- 지방구에 존재하는 triglyceride는 3T3-L1 지방전세포로부터 지방세포로 분화하는 단계에서 3가지 과정에 의해 생성된다. 첫째로 세포 내로 유입되는 포도당의 대사과정, 둘째로 lipoprotein lipase에 의해 분해되어 유입된 모노글리세롤과 지방산, 그리고 세포 내 de novo 지방산 합성과정 등으로 인해 종합적으로 세포 내에 triglyceride가 생성되어 분화 마지막 단계까지 계속적으로 지방구는 형성되게 되는데 시간이 지날수록 지방구끼리 결합하여 그 크기가 점점 증가하게 된다. 본 연구에서는 수세미오이 메탄올 추출물의 지방구 감소효과를 검증하기 위하여 형성된 지방구를 분해 또는 감소시킬 수 있는 지 여부를 측정한 것으로 다소 고농도인 600 μg/mL와 1000 μg/mL에서 그 효과가 입증되었다.
- 하지만 지방분해효소 중 LPL을 제외한 HSL과 ATGL의 유전자 발현이 증가됨에 따라 세포 내 triglyceride이 지방산과 glycerol로 분해되었을 것으로 생각되며 이러한 결과는 세포 외로 유리된 glycerol의 함량이 수세미오이의 메탄올 추출물 1000 μg/mL의 농도에서 증가한 것을 통해 재확인할 수 있었다.
후속연구
- 하지만 600 μg/mL의 농도에서 triglyceride 분해는 촉진되었으나 glycerol의 유리가 유의적으로 나타나지 않은 것은 세포 내에서 분해된 glycerol의 일부가 세포 내 생합성에 재사용되었을 것으로 생각되며 실제 세포 외로 유리된 양을 확인하기 위해서는 보다 높은 농도가 필요한 것으로 여겨진다. 전반적으로 본 실험에서는 수세미오이의 메탄올 추출물이 분화된 3T3-L1 지방세포에서 지방구의 생성을 억제하였으나 효과 농도가 다른 많은 천연물에 비해 다소 높게 나타남으로써 제약으로서의 생산으로는 제한점이 있을 것으로 생각되는 반면 식품으로서 꾸준히 사용될 경우 항비만 소재로서의 가능성이 있을 것으로 생각된다.
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