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문제 정의
- 그러나 각 품종들의 무작위적 수집 및 불분명한 반입경로 등으로 인하여 품종들의 기원이 모호해졌기 때문에, 품종간의 차이를 구분할 수 있는 구분법의 개발이 필요해 졌다. 따라서 본 연구에서는 느티만가닥버섯을 구분하는 방법을 개발하고, 각 품종을 구분할 수 있는 DNA 마커(marker)를 찾는데 목표를 두었다.
- 본 연구에서는 국내에서 수집된 느티만가닥버섯 30종에 대한 RAPD 분석을 수행하여 각 품종들을 분류하였으며, RAPD 상에 나타난 특이 DNA 조각의 염기서열을 바탕으로 품종 특이적 DNA 마커 개발을 시도하였다.
제안 방법
- 각 콜로니를 LB-ampicillin 액체배지에 배양한 후 plasmid를 추출하고 (plasmid prep kit, Solgent), 제한효소 EcoRI을 처리하여 insert 존재유무를 확인하였다. Cloning이 완료된 plasmid는 상업적 염기서열결정서비스 회사(Solgent)에 의뢰하여 염기서열을 결정하였다.
- PCR 조건은 94℃에서 5분간 denaturation 후, 94℃ 45초, 40℃45초, 72℃ 3분로 40 cycle 증폭하였으며, 이후 72℃에서 10분간 방치하여 반응을 완결하였다. PCR 산물은 agarose gel electrophoresis(150V에서 1시간 30분)로 분리하였고 EtBr(ethidium bromide)염색 후 Gel doCumentation system(Vilber-Lourmat Bio-Vision 3000 model)를 사용하여 gel image를 획득하였다. 각 PCR 산물의 크기는 1 kb DNA ladder(New England Biolabs)를 size marker로 사용하여 확인하였다.
- RAPD에서 나타난 특이적 DNA band를 품종 특이적 마커로 개발하기 위하여 각 DNA band의 염기서열을 결정하였다. 이를 위하여 각 품종별 특이 DNA band 18개를 선정하여 gel에서 추출하였다.
- PCR 산물은 agarose gel electrophoresis(150V에서 1시간 30분)로 분리하였고 EtBr(ethidium bromide)염색 후 Gel doCumentation system(Vilber-Lourmat Bio-Vision 3000 model)를 사용하여 gel image를 획득하였다. 각 PCR 산물의 크기는 1 kb DNA ladder(New England Biolabs)를 size marker로 사용하여 확인하였다.
- 형질전환 대장균은 LB-ampicillin(100 mg/ml)에 도말하고 37℃에서 12시간 배양하였다. 각 콜로니를 LB-ampicillin 액체배지에 배양한 후 plasmid를 추출하고 (plasmid prep kit, Solgent), 제한효소 EcoRI을 처리하여 insert 존재유무를 확인하였다. Cloning이 완료된 plasmid는 상업적 염기서열결정서비스 회사(Solgent)에 의뢰하여 염기서열을 결정하였다.
- 4B). 결정된 염기서열을 바탕으로 18 뉴클레오타이드의 길이를 가진 primer를 제작하였고, 이들을 이용하여 PCR 반응을 수행하였다. Fig.
- 4A). 그 결과 얻어진 PCR 패턴으로부터 느티만가닥 품종 Hm0-4에서만 특이적으로 만들어 지는 250 bp DNA 밴드를 추출하여 TA-cloning 하여 염기서열을 결정하였다 (Fig. 4B). 결정된 염기서열을 바탕으로 18 뉴클레오타이드의 길이를 가진 primer를 제작하였고, 이들을 이용하여 PCR 반응을 수행하였다.
- , 1989). 먼저 PDA에서 키운 버섯균사를 모아서, 1X TE(Tris-EDTA) buffer에 현탁한 후 막자사발로 곱게 갈았다. 이를 microtube에 500 ml씩 분주하고 Trichoderma harzianum lysing enzyme(SIGMA) 2 mg을 가하여 잘섞은 뒤에 2시간동안 상온에서 교반하며세포벽을 용해시켰다.
- 반응액은 주형 DNA 2 µl, primer(100 mM) 1 µl, 10 nM dNTP, Taq polymerase(Solgent Co.) 1 µl, 10X Taq buffer(Solgent Co.) 2 µl을 가하고 증류수로 반응액의 부피를 20 Rl로 조정하였다.
- 이와 더불어 RAPD는 버섯 각 품종별로 특징적인 DNA 단편들을 만들어 내기 때문에 RAPD의각 DNA 단편들이 품종 특이적 마커로 사용될 수 있다. 본 연구에서는 이러한 가능성을 확인하기 위하여, Hm0-4, Hm0-7, Hm1-1, Hm1-4, Hm1-6, Hm2-7, Hm2-10, Hm3-6, Hm3-8, Hm3-10등 10 균주에대하여, primer OPL-13으로 PCR 반응을 수행하였다 (Fig. 4A). 그 결과 얻어진 PCR 패턴으로부터 느티만가닥 품종 Hm0-4에서만 특이적으로 만들어 지는 250 bp DNA 밴드를 추출하여 TA-cloning 하여 염기서열을 결정하였다 (Fig.
- 수집된 30종 느티만가닥버섯의 계통분석을 위하여, 고체배지상에서 자란 균사체를 모아 염색체 DNA를 추출하였다. 추출된 염색체를 주형으로 하여 OPS-1, OPS-10, OPL-13 등 세가지 primer를 이용하여 PCR 반응을 수행하였다 (Fig.
- RAPD에서 나타난 특이적 DNA band를 품종 특이적 마커로 개발하기 위하여 각 DNA band의 염기서열을 결정하였다. 이를 위하여 각 품종별 특이 DNA band 18개를 선정하여 gel에서 추출하였다. 추출된 DNA를 pGEM Teasy vector(Promega)와 ligation 후, Escherichia coli DH5alpha competent cell에 열 충격(heat shock) 방법으로 삽입하였다.
- 이를 위하여 각 품종별 특이 DNA band 18개를 선정하여 gel에서 추출하였다. 추출된 DNA를 pGEM Teasy vector(Promega)와 ligation 후, Escherichia coli DH5alpha competent cell에 열 충격(heat shock) 방법으로 삽입하였다. 형질전환 대장균은 LB-ampicillin(100 mg/ml)에 도말하고 37℃에서 12시간 배양하였다.
- 수집된 30종 느티만가닥버섯의 계통분석을 위하여, 고체배지상에서 자란 균사체를 모아 염색체 DNA를 추출하였다. 추출된 염색체를 주형으로 하여 OPS-1, OPS-10, OPL-13 등 세가지 primer를 이용하여 PCR 반응을 수행하였다 (Fig. 1). 각 PCR 반응에서 분자량 200 bp~2500 bp 크기의 DNA 단편들이 균주당 30여개씩 증폭됨을 확인하였다.
- 추출한 염색체 DNA를 주형(template)으로 하고, RAPD용 random primer(Qiagen) OPS-1(5´-CTA CTG CGC T-3´), OPS-10(5´-ACC GTT CCA G-3´) 및 OPL13(5´-ACC GCC TGC T-3´)을 이용하여 PCR을 수행하였다 (11).
대상 데이터
- 본 실험에 이용한 느티만가닥버섯(Hypsizygus marmoreus) 균주는 일본유래 재배종 및 국내보존기관 보유종(야생버섯균주은행, 그린피스버섯연구소, 국립원예특작과학원), 덕유산에서 수집된 야생종 1종 등 총 30종의 균주를 사용하였다(Table 1). 각 균주는 potato-dextrose agar(PDA) 배지에 계대배양하며 보관하였다.
데이터처리
- RAPD 결과로 얻어진 DNA 패턴은 특정 위치의 DNA band의 유무를 1과 0의 값으로 엑셀프로그램으로 정리하였고, FreeTree 소프트웨어(Pavlicek et al., 1999)를 이용하여 UPGMA(Unweighted Pair-Group Method With Arithmetic Average) 분석방법(Rohlf, 1989)으로 유연관계 분석하였다. 최종적으로 얻어진 데이타는 TreeView 소프트웨어(Page, 1996)를 이용하여 dendrogram으로 나타내었다.
이론/모형
- Dendrogram analysis of the RAPD results. The RAPD gel images using OPS-1, OPS-10, and OPL-13 primers were analyzed with UPGMA cluster analysis methodology. The dendrogram was calculated with 500 repeats of bootstrapping.
- 각 PCR 반응에서 분자량 200 bp~2500 bp 크기의 DNA 단편들이 균주당 30여개씩 증폭됨을 확인하였다. 이러한 DNA 단편들의 각 균주별 패턴을 UPGMA 방법으로 클러스터링(clustering) 하였다 (Fig. 2). 클러스터링결과, 대부분의 느티만가닥버섯 품종은 Cluster 1 이나 Cluster 2, 둘 중 하나의 클러스터에 속하였으며, 특이하게도 한국 덕유산에서 채집된 야생종(Hm3-10)은 어느 클러스터에도 속하지 않는 독립된 종임을 알 수 있었다.
성능/효과
- 결정된 염기서열을 바탕으로 18 뉴클레오타이드의 길이를 가진 primer를 제작하였고, 이들을 이용하여 PCR 반응을 수행하였다. Fig. 4C는 그 결과를 보여주는 것으로, Hm0-4 균주에서만 특이적인 250 bp의 DNA 밴드가 증폭됨을 확인하였다. Hm2-7 균주의 경우에도 DNA 밴드는 관찰되었으나, 목표크기보다 큰 비특이적 증폭의 결과였다.
- 1). 각 PCR 반응에서 분자량 200 bp~2500 bp 크기의 DNA 단편들이 균주당 30여개씩 증폭됨을 확인하였다. 이러한 DNA 단편들의 각 균주별 패턴을 UPGMA 방법으로 클러스터링(clustering) 하였다 (Fig.
- 국내 보유 30종의 느티만가닥버섯의 유전학적인 계통분석을 통해, 이들은 대체로 4개의 그룹으로 나누어짐을 확인하였다(Fig. 1, Fig. 2). 우리나라 야생에서 채취한 느티만가닥버섯 품종은 현재 유통되는 일본유래의 품종과는 확연히 구분되는 분자유전학적, 재배형태학적 특징을 보여주었으며(Fig.
- 3), 이를 통하여 우리나라 고유의 느티만가닥버섯 재배종 육성을 위한 바탕이 마련되었다. 또한, RAPD를 통하여 얻어지는 품종특이적 DNA 단편의 염기서열을 결정하였고, 이를 바탕으로 특이적 primer를 제작하였으며, 이들을 이용하여 PCR을 수행한 결과, 특정 품종에서만 특정 DNA 단편이 증폭됨을 보임으로서, 이 방법이 품종 구분용 DNA 마커 개발될 수 있음을 보였다.
- 2). 우리나라 야생에서 채취한 느티만가닥버섯 품종은 현재 유통되는 일본유래의 품종과는 확연히 구분되는 분자유전학적, 재배형태학적 특징을 보여주었으며(Fig. 2, Fig. 3), 이를 통하여 우리나라 고유의 느티만가닥버섯 재배종 육성을 위한 바탕이 마련되었다. 또한, RAPD를 통하여 얻어지는 품종특이적 DNA 단편의 염기서열을 결정하였고, 이를 바탕으로 특이적 primer를 제작하였으며, 이들을 이용하여 PCR을 수행한 결과, 특정 품종에서만 특정 DNA 단편이 증폭됨을 보임으로서, 이 방법이 품종 구분용 DNA 마커 개발될 수 있음을 보였다.
- 위 실험들을 통하여 RAPD가 느티만가닥버섯의 품종구분에 사용될 수 있음을 보였다. 이와 더불어 RAPD는 버섯 각 품종별로 특징적인 DNA 단편들을 만들어 내기 때문에 RAPD의각 DNA 단편들이 품종 특이적 마커로 사용될 수 있다.
- 이는 이들 흰색계통들이 원래 갈색계통의 버섯들에서 육종되어 개발된 품종임을 시사하는 것이다. 이상의 결과들을 종합하면, RAPD에 의한 느티만가닥버섯의 분자유전학적 구분법이, 버섯자실체의 재배형태학적 특성을 비교적 잘 반영하고 있음을 알 수 있다.
- 2). 클러스터링결과, 대부분의 느티만가닥버섯 품종은 Cluster 1 이나 Cluster 2, 둘 중 하나의 클러스터에 속하였으며, 특이하게도 한국 덕유산에서 채집된 야생종(Hm3-10)은 어느 클러스터에도 속하지 않는 독립된 종임을 알 수 있었다. 이러한 현상은 주로 일본, 중국, 대만등지에서 수집된 느티만가닥 품종들이 대부분 유사한 기원에서 출발하였기 때문임을 추정할 수 있는데, 이는 아마도 이들 국가에서 유통 중인 느티만가닥버섯의 재배종 품종들이 대부분 일본의 재배기술과 함께 이들 국가로 흘러들어갔기 때문일것으로 생각된다.
후속연구
- 이러한 현상은 주로 일본, 중국, 대만등지에서 수집된 느티만가닥 품종들이 대부분 유사한 기원에서 출발하였기 때문임을 추정할 수 있는데, 이는 아마도 이들 국가에서 유통 중인 느티만가닥버섯의 재배종 품종들이 대부분 일본의 재배기술과 함께 이들 국가로 흘러들어갔기 때문일것으로 생각된다. 이들 가운데서 한국 야생종 균주 Hm3-10은 독특한 위치를 점하고 있기 때문에 향후 육종을 통한 균주개발의 중요한 자산이 될 것으로 생각된다.
- Hm2-7 균주의 경우에도 DNA 밴드는 관찰되었으나, 목표크기보다 큰 비특이적 증폭의 결과였다. 이러한 결과는 RAPD에서 관찰되는 품종특이적 DNA 단편들이 각 품종을 구분할 수 있는 DNA 마커로서 개발될 수 있음을 보여주는 것이다.
- 또한, 버섯의 느린 성장 속도로 인하여 조직이 치밀하고 저장성이 좋기 때문에 세계시장을 바라보는 수출용 버섯으로서의 가능성도 충분하다고 볼 수 있다. 이러한 이유로 국내에서도 새로운 품종개발이나 유용성분분석, 재배기술개발 등 느티만가닥버섯에 대한 본격적 연구가 필요하다. 현재 국내에서 재배되고 있는 느티만가닥버섯 품종은 일본에서 도입된 품종이나, 최근에는 국내 육종가를 통하여 새로운 느티만가닥 품종이 출원되고 있다.
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