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문제 정의
- 따라서 천연 항노화 제품이나 미백물질보다 안전하고 우수한 효과를 지닌 한약재를 탐색하기 위한 연구의 일환으로 기존 한약재 중 피부질환에 주로 사용되는 약재를 검색해 본 결과, 오배자가 肺經으로 歸經하고 맛이 酸澀하며 피부과 질환에 외용재로 다용되고11-12) 기존에는 종기나 피부염 등의 외상에 외용재로, 최근에는 항균효과에 집중되어 연구되고 있음13-15)을 알 수 있었다. 그 외에도 오배자에 함유된 다량의 gallotanin 성분은 수렴작용이 있어 피부점막에 접촉되면 조직 단백이 응고되어 수렴효과16)를 나타내고 있음을 볼 때 광노화에 대한 항 주름 효과에도 긍정적인 작용을 미칠 것으로 생각하여 본 실험을 실행하였으며, 오배자가 피부 노화에 결정적 역할을 하는 Elastase 활성과 MMP-1 발현에 미치는 영향 및 Tyrosinase 활성에 미치는 영향 등에 아래와 같은 결과를 얻었기에 이에 보고하고자 한다.
- 본 실험에서는 기존에 연구 개발되어진 천연 항노화 제품이나 미백물질보다 안전하고 우수한 효과를 지닌 한약재를 탐색해내기 위한 연구의 일환으로 오배자의 주름억제 효능을 탐색하였으며, 항 주름 효과 뿐 아니라 오배자가 지니는 멜라닌 생합성의 첫 단계에 관여하는 효소인 Tyrosinase 활성 억제와 단백질의 발현, 멜라닌 합성 등을 관찰하여 다음과 같은 결과를 얻었다.
- . 이러한 사실을 기반으로 하여 Tyrosinase를 억제하는 효과를 가지면 피부의 반점과 기미 등의 색소를 생성하는 멜라닌을 억제하는 미백효과를 거둘 수 있을 것으로 보고, 오배자가 미백효과를 지니는지 Tyrosinase inhibition assay를 통하여 관찰하여 보았다. 그 결과, 대조군인 Arbutin(1000 ㎍/㎖)보다 훨씬 적은 농도인 100 ㎍/㎖에서도 약 2배의 효과를 지니고 있는 것으로 관찰되어, 오배자가 항 주름 효과 뿐 아니라 미백에도 뛰어난 효과가 있는 것으로 생각되었다.
제안 방법
- α-MSH를 1 μM로 처리하여 3일 동안 배양한 후에, phase contrast microscope (Olympus Optical, Tokyo, Japan)를 사용하여 세포변화를 비교하였다.
- PCR 조건은 94℃에서 30 sec, 55℃에서 30 sec, 72℃에서 45 sec로 하였다. 30 cycle에서 5 ㎕을 취해서 2.0% 한천 겔에 전기영동하고 ethidium bromide로 염색하여 PCR 산물을 확인하였다.
- 5 ㎍ (Amersham Biosciences, USA)과 DEPC를 처리한 물을 가하고 65℃에서 10분간 반응시킨 뒤 얼음에서 2분간 식혔다. 5 x first strand buffer 와 0.1 M DTT, 10mM dNTP, 200 unit M-MLV reverse transcriptase (Invitrogen, USA), 그리고 DEPC 처리한 증류수를 가하여 총 50 ㎕ 가 되게 하고 42℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 다시 95℃에서 5분간 가열한 뒤 cDNA를 만들었다.
- Anti MMP-1(R&D systems, Moimmeapolis, MN, USA), Anti TIMP-1를 이용하여 1차 항체반응을 4℃에서 16시간 반응시킨 다음 PBS-T로 세척하였다.
- B16 cell을 FBS 10%가 함유된 Phenol red Free DMEM배지를(Gibco-BRL) 넣은 24 well dish에 2×105 의 농도로 하루 동안 배양을 한 다음, 오배자 추출물을 농도별로(0.8, 4, 20, 100 ㎍/㎖) 함유한 DMEM 배지로 갈아주어 한 시간 동안 처리 하였다.
- B16 mouse melanoma cell을 이용 하여 멜라닌의 생성정도를 비교하였다6). B16 cell을 FBS 10%가 함유된 Phenol red Free DMEM배지를(Gibco-BRL) 넣은 24 well dish에 2×105 의 농도로 하루 동안 배양을 한 다음, 오배자 추출물을 농도별로(0.
- 5 unit Taq. DNA polymerase (TaKaRa Korea, Seoul, Korea)를 혼합하여 시행하였다. PCR 조건은 94℃에서 30 sec, 55℃에서 30 sec, 72℃에서 45 sec로 하였다.
- Elastase 활성억제의 비교를 위해 실험에서는 양성 대조군으로 arbutin을 사용하였으며 음성 대조군으로 tyrosinase 대신 0.1 M sodium phosphate buffer를 동량 분주하였다. Tyrosinase 활성 억제에 대한 공식은 다음과 같다.
- 얼음에서 5분간 방치하여 반응을 중지시킨 뒤 410 ㎚ 파장의 microlpate reader기를 사용하여 흡광도를 측정하였다. Elastase 활성억제의 비교를 위해 실험에서는 양성 대조군으로 ursolic acid 를 사용하였으며 음성 대조군으로 Elastase 효소액 대신 100 mM Tris -HCl buffer를 동량 분주하였다. Elastase 활성 억제에 대한 공식은 다음과 같다.
- HS68 세포에 UV를 조사하여 MMP-1의 발현을 유도하였다. 지름 100 ㎜ plate에 세포를 6×105으로 심어 24시간 배양하였다.
- MMP-1이 자외선으로 인하여 어떠한 영향를 가지는지, 또한 오배자가 자외선으로 인하여 과다 발현하게 된 MMP-1에게 미치는 효과를 알아보기 위해 western blot을 통하여 단백질의 변화를 관찰하였다. 자외선에 의하여 생성되는 MMP-1은 HS68 세포의 배지를 회수하여 배지에 분비된 MMP-1의 발현량을 분석하는 방법을 사용하여 원하는 단백질을 얻었다.
- Mouse-IgG (Jackson Immuno Reserch Laboratories, Inc, westGrone, pa, USA) 2차 항체반응을 상온에서 1시간동안 반응시켰다. PBS-T로 10분, 15분, 30분간 세척한 후 ECL (Amersham Biosciences, UK)로 발광하여 X-ray film에 노출시켜 단백질 발현분석을 실시하였다.
- The cells were cultured with 0.8-100 ㎎/㎖ Galla Rhois for 3 days, and phase contrast pictures were taken using Ⅸ51 inverted microscope (Olympus, Tokyo, Japan). (a) Control, (b) α-MSH, (c) α-MSH+ Galla Rhois(100 ㎎/㎖), (d) α-MSH+Galla Rhois(4 ㎎/㎖), (e) α-MSH+Galla Rhois(0.
- 25 ㎎/㎖로 넣은 뒤 암소에서 2시간 반응하였다. micro plate reader 기를 490 ㎚에서 흡광도를 측정하여 약재의 세포 독성 및 증식 효과에 대한 영향을 조사하였다.
- stock을 분주한 후에 7일 정도 안정화시킨 후, Hemocytimeter를 사용하여 센 다음 세포를 96-well culture plate에 각각 2×104 개가 되도록 심어 주었다.
- 그 후 2000unit/㎖ 의 mushroom tyrosinase (fluka, 93898)를 potassium phosphate buffer에 녹여서 만든 것을 10 ㎕씩 넣은 뒤 15 mM의 tyrosine (sigma, T3754)을 20 ㎕씩 분주 후 최종 양을 150 ㎕ 로 만든 뒤 잘 섞어주고 37℃에서 20분간 반응시켰다. 신속하게 얼음에서 5분간 방치하여 반응을 중단시키고, 490 ㎚에서 흡광도를 측정하고 tyrosinase 효소 활성 억제율을 구하였다.
- 그 후 25℃에서 20분간 방치하였다. 얼음에서 5분간 방치하여 반응을 중지시킨 뒤 410 ㎚ 파장의 microlpate reader기를 사용하여 흡광도를 측정하였다. Elastase 활성억제의 비교를 위해 실험에서는 양성 대조군으로 ursolic acid 를 사용하였으며 음성 대조군으로 Elastase 효소액 대신 100 mM Tris -HCl buffer를 동량 분주하였다.
- 오배자가 HS68 세포에 처리 되었을 때 실제 오배자가 미치는 세포독성을 알아보고, 세포에서의 안전한 한약의 투여 농도를 결정하기 위하여 HS68 세포에 오배자를 농도별로 처리했을 때의 생존율을 MTS (Promega, Madison, USA) assay로 조사하였다. stock을 분주한 후에 7일 정도 안정화시킨 후, Hemocytimeter를 사용하여 센 다음 세포를 96-well culture plate에 각각 2×104 개가 되도록 심어 주었다.
- 이를 바탕으로 Elastase를 억제하는 오배자가 MMP-1을 억제하는 효과와 함께 TIMP-1 발현효과를 관찰하기 위하여 UVA를 HS68 Cell인 HS68세포에 노출시켜 변화를 관찰하여 보았다. 우선 HS68 세포에 대한 오배자의 세포생존률에 미치는 영향을 살펴보기 위해 10, 50, 100 및 250 ㎍/㎖농도의 오배자를 처리한 결과, HS68 세포는 96.
- MMP-1이 자외선으로 인하여 어떠한 영향를 가지는지, 또한 오배자가 자외선으로 인하여 과다 발현하게 된 MMP-1에게 미치는 효과를 알아보기 위해 western blot을 통하여 단백질의 변화를 관찰하였다. 자외선에 의하여 생성되는 MMP-1은 HS68 세포의 배지를 회수하여 배지에 분비된 MMP-1의 발현량을 분석하는 방법을 사용하여 원하는 단백질을 얻었다. 그 후 배지를 모아 Amicon (millipore, U.
- RNA 침전물을 75% 에탄올로 세척하고, 상온에서 건조시킨 다음 diethylpyrocarbonate (DEPC)로 처리한 증류수에 녹였다. 정제된 RNA를 GeneQuant Pro (Amersham Biosciences)로 정량하고, ethidium bromide를 넣은 한천 겔에 전기영동 하여 RNA의 integrity와 정확한 quantification을 재확인하였다.
- 한약재에 대한 Tyrosinase 활성억제 측정은 96well을 사용하여 흡광도를 측정하였다. 96well micro plate에 0.
대상 데이터
- 실험에 사용된 약재는 Sunten Pharmacrutical Co.(Taipei, Taiwan)에서 구입하였다. Sunten에서는 water extract 상태로 구입하였다.
- Elastase 억제효과를 살피기 위하여 구입한 Elastase (pancreatic from porcine pancreas), N-Succinyl-(Ala)3-p-nitroanilide, Ursolic acid 와 Tyrosinase 억제효과를 살피기 위하여 mushroom tyrosinase, L-tyrosine, arbutin은 Sigma aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다. 배지를 농축하기 위하여 사용한 Amicon Ultra는 millipore Coporation (Billerica, MA, USA)에서 구입하였다.
- HS68(ATCC, CRL1635) 세포와 멜라닌을 형성하는 세포인 B16 melanoma (KCLB, 80007)는 10% fetal bovine serum (FBS)을 첨가한 Dulbecco's modified Eagle's media (DMEM)에 1% 항생제(penicillin-streptomycin, (Gibco BRL))를 첨가한 배지에서 2-3일 마다 배양액을 교환해 주었으며, 배양 환경은 37℃ 포화 습도로 유지되는 5% CO2 배양기에서 배양하였다.
- Hand Hold UV lamp 는 Vilber Lourmat (B.P.66-Z.I.sud france)에서 구입하였으며, MMP-1 항체는 R&D system (Minneapolis, MN, USA), anti-Tyrosinase (MS-800-P1,Neo marker), anti-MiTF (MS-771-P0, N대 marker) 이차항체는 Jackson Immuno Reasearch Laboratories, Inc (westGone, PA, USA)에서 구입하여 실험하였다.
- Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다. 배지를 농축하기 위하여 사용한 Amicon Ultra는 millipore Coporation (Billerica, MA, USA)에서 구입하였다. Hand Hold UV lamp 는 Vilber Lourmat (B.
데이터처리
- 유의성 검증은 Student‘s t-test를 이용하여 p<0.05 을 유의한 것으로 인정하였다.
이론/모형
- 얻은 총 단백질을 Brad-ford assay (Bio-Rad Laboratories, Hercules, California) 방법을 이용하여 정량한 다음 20 ㎍의 단백질을 15% acrylamide gel 에 전기 영동하였다. 이것을 nitrocellulose membrane (Schleicher & Schuell Bioscience, Dassel, Germany)에 transfer 하여 PBS-T 에 1% skim milk와 1% BSA 가 든 blocking 용액에서 1시간 동안 blocking 한 후 PBS-T 로 5분간 3회 세척하였다.
성능/효과
- 1. Elastase 활성 억제에 미치는 오배자의 영향 오배자의 Elastase 활성억제를 살펴본 결과 500 및 1000 ㎍/㎖ 의 오배자 처리군은 각각 65.79±0.89 및 52.42±1.52로, 대조군의 137.51±3.49와 양성대조군인 ursolic acid의 63.80±5.92에 비하여 오배자의 농도가 높아질수록 Elastase의 농도 의존적으로 감소되었다(Table Ⅰ, Fig.1).
- 1. 오배자의 Elastase 활성 억제를 살펴본 결과 500 및 1000 ㎍/㎖ 의 오배자 처리군은 대조군을 100으로 보았을 때 각각 65.79±0.89 및 52.42±1.52 로 오배자의 농도가 높아질수록 Elastase의 농도 의존적인 감소로 나타났다.
- 2. 오배자가 HS68 세포의 생존률에 미치는 영향을 살펴본 결과, 250 ㎍/㎖까지의 농도에서 HS68 세포활성에 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다.
- 3. 오배자가 MMP-1에 미치는 영향을 알아본 결과, MMP-1의 발현이 줄어들고 TIMP-1은 아무런 변화 없이 모두 동일하게 발현하였음을 알 수 있었다.
- 4. 자외선에 노출된 HS68 세포는 그렇지 못한 것에 비하여 MMP-1 의 발현이 증가되는 것을 관찰할 수 있었으며, 자외선을 노출시킨 후 오배자를 처리하였을 때 MMP-1 의 발현이 현저하게 줄어드는 것을 알 수 있었다.
- 5. 오배자가 c-Jun과 c-Fos의 발현에도 어떠한 관여를 하는지 알아본 결과, 오배자의 처리에서도 아무런 변화를 나타내지 않음을 관찰하였다.
- 6. 오배자가 100, 500, 1000(㎍/㎖)의 농도에서 각각 15.93±1.74, 8.41±8.54, 10.41±0.94 로, 대조군인 arbutine(31.78±7.44)의 Tyrosinase 활성 억제력 보다 월등한 효능을 지닌 것으로 나타났다.
- 7. 오배자가 MiTF18)에 미치는 농도별 변화를 관찰해본 결과, 오배자의 농도가 높아질수록 Tyrosinase와 MiTF 모두 농도 의존적으로 현저하게 발현이 억제되는 것으로 나타났다.
- 8. 오배자가 멜라닌 생성을 저해시키는지 세포의 변화를 관찰한 결과, 오배자는 100 ㎎/㎖에서 가장 뛰어난 멜라닌 생성 저해 효과를 보여주었으며, 농도 의존적으로 효과를 보이는 것으로 나타났다.
- MMP-1의 발현에 변화를 주는 오배자가 MMP-1의 발현을 유도하는 AP-1의 heterodimer인 c-Jun과 c-Fos의 발현에도 어떠한 관여를 하는지 알아보기 위하여 RT-PCR을 수행해본 결과, c-Jun과 c-Fos는 ｍRNA Level에서 UV에 의한 변화를 보이지 않았으며 오배자의 처리에서도 아무런 변화를 나타내지 않음을 관찰하였다(Fig. 5).
- MMPs는 다양한 경로를 통하여 유도되는데, UVA와 UVB 를 통하여도 MMPs 가 증가되며, 그 중에서도 MMP-1은 collagen type Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ를 분해시키는 것으로 알려졌다. 또한 tissuespecific inhibitors of MMPs (TIMP)는 특이적으로 MMPs를 불활성화 시켜 생물학적으로 평형상태를 유지시킨다고 알려져 있다1).
- Sim4) 등은 UVA 조사로 인하여 MMP-1 유전자의 mRNA 발현이 증폭되는 것을 관찰하였는데, 이러한 사실을 바탕으로 UVA를 2분간 조사하여 collagen을 파괴하는 MMP-1의 발현과 오배자의 관계를 mRNA 발현과 단백질 발현에서 조사한 결과 자외선조사를 받지 않은 HS68 세포에 비하여 자외선조사를 받은 세포가 많은 양의 MMP-1을 발현하는 것을 관찰하였으며, 오배자가 UVA에 의하여 증가되는 MMP-1의 mRNA 발현을 우수하게 저해시키는 것을 관찰할 수 있었다. UVA에 의한 MMP-1의 변화를 단백질의 발현을 통하여 관찰한 것23)을 바탕으로 western bolt을 통하여 MMP-1을 관찰한 결과, UVA에 의하여 MMP-1의 단백질 발현이 현저하게 증가하였으며, 오배자를 처리한 결과 MMP-1을 다시 억제시켜주는 것을 알 수 있었다.
- 오배자가 MMP-1에 미치는 영향을 알아보기 위해 mRNA level에서의 MMP-1 발현과 MMP-1의 Inhibitor인 TIMP-1의 발현을 함께 관찰해 본 결과, 오배자를 처리하였을 때 MMP-1의 발현이 줄어들고 TIMP-1은 아무런 변화 없이 모두 동일하게 발현하였음을 알 수 있었다. b)의 경우는 약물 처리에 의해 mRNA 양에 변화가 없는 GAPDH를 분모로 MMP-1의 오배자에 의한 억제 효과를 보여주는 것으로 UV만 조사한 경우 아무 처리를 하지 않은 것에 비해 2.27배 MMP-1의 mRNA의 발현이 증가되었으나 오배자를 UV와 같이 처리한 경우 1.30으로 MMP-1의 발현을 억제함을 알수 있었다(Fig. 3).
- 이러한 사실을 기반으로 하여 Tyrosinase를 억제하는 효과를 가지면 피부의 반점과 기미 등의 색소를 생성하는 멜라닌을 억제하는 미백효과를 거둘 수 있을 것으로 보고, 오배자가 미백효과를 지니는지 Tyrosinase inhibition assay를 통하여 관찰하여 보았다. 그 결과, 대조군인 Arbutin(1000 ㎍/㎖)보다 훨씬 적은 농도인 100 ㎍/㎖에서도 약 2배의 효과를 지니고 있는 것으로 관찰되어, 오배자가 항 주름 효과 뿐 아니라 미백에도 뛰어난 효과가 있는 것으로 생각되었다.
- 이상으로 오배자가 피부의 탄력성을 저하시키고 주름을 유발하는 Elastase를 500 ㎍/㎖의 농도에서 현저히 억제할 뿐 아니라, UVA의 자극에 의해서 진피층에서 유도되는 MMP-1의 다량 발현에 대하여 mRNA level 뿐 아니라 단백질 level에서도 억제하고, 주요 전사인자인 c-fos 및 c-jun에 대한 전사억제 효과도 50 ㎍/㎖의 농도에서 보여주었다. 또 collagen을 보호하는 항 주름 효과와, 멜라닌을 생성하는데 있어 중추적인 역할을 하는 Tyrosinase는 역시 100 ㎍/㎖의 농도에서부터 500 ㎍/㎖까지 농도 의존적으로 억제하는 뛰어난 효능을 보여주었으며, 이러한 효과의 주요 분자들인 MiTF단백질과 tyrosinase 단백질, 그리고 육안적인 멜라닌세포의 억제 효과를 역시 100 ㎍/㎖의 농도에서 관찰할 수 있었다. 이러한 실험결과를 미루어 볼 때, 오배자의 항 주름 뿐 아니라 미백 효과를 함께 가진 우수한 효능을 가진 주요 후보물질로 생각되어 지며, 미백, 항 주름을 한꺼번에 실험하고 미백에서도 또한 다른 실험적인 방법을 씀으로 인한 각 실험용량의 차이가 50 ㎍/㎖에서 500 ㎍/㎖로 다양하나 elastase activity 활성억제를 제외한 대부분의 실험에서 50 ㎍/㎖에서 100 ㎍/㎖의 용량에서 효과를 보여주어 유의성을 가질 수 있으며, 이러한 용량 등의 문제는 이미 유효성을 확인하였으므로 추후의 동물실험 등을 통해서 재확인할 필요가 있을 것으로 생각된다.
- 오배자가 HS68 세포의 생존률에 미치는 영향을 살펴보기 위해 10, 50, 100 및 250 ㎍/㎖ 농도의 오배자를 처리한 결과, HS68 세포는 96.8, 92.9, 97.1 및 104.8%의 생존류를 보여주어 오배자는 250 ㎍/㎖ 까지의 농도에서 HS68 세포활성에 영향을 미치지 않아 세포독성이 없는 것으로 나타났다(Fig. 2).
- 오배자가 MMP-1에 미치는 영향을 알아보기 위해 mRNA level에서의 MMP-1 발현과 MMP-1의 Inhibitor인 TIMP-1의 발현을 함께 관찰해 본 결과, 오배자를 처리하였을 때 MMP-1의 발현이 줄어들고 TIMP-1은 아무런 변화 없이 모두 동일하게 발현하였음을 알 수 있었다. b)의 경우는 약물 처리에 의해 mRNA 양에 변화가 없는 GAPDH를 분모로 MMP-1의 오배자에 의한 억제 효과를 보여주는 것으로 UV만 조사한 경우 아무 처리를 하지 않은 것에 비해 2.
- 오배자가 Tyrosinase에 대한 효능을 알아보기 위하여 농도별로 실험한 결과17), 오배자가 100, 500, 1000(㎍/㎖)의 농도에서 각각 15.93±1.74, 8.41±8.54, 10.41±0.94 로, 대조군인 arbutine (31.78±7.44)의 Tyrosinase 활성 억제력 보다 유의하게 억제되었다(Table Ⅱ, Fig. 6).
- 오배자가 melanin의 생성에 관여하는 Tyrosinase와 Tyrosinase의 promoter를 regulation하는 specific transcription factor인 MiTF18)에 미치는 농도별 변화를 관찰해본 결과, 오배자의 농도가 높아질수록 Tyrosinase와 MiTF 모두 농도 의존적으로 발현이 억제되었다(Fig. 7).
- 오배자가 melanin의 생성에 관여하는 Tyrosinase와 Tyrosinase의 promoter를 regulation하는 specific transcription factor인 MiTF18)에 미치는 농도별 변화를 관찰해본 결과, 오배자의 농도가 높아질수록 Tyrosinase와 MiTF모두 농도 의존적으로 현저하게 발현이 억제되는 것으로 나타났다. 이는 오배자가 전사인자인 MiTF를 억제하여 Tyrosinase의 발현을 저해 시키는 것으로 생각되며, 그 정도는 멜라닌 생성 억제율과 상관성이 매우 클 것으로 생각된다.
- 오배자가 실제로 B16 melanoma cell에서 멜라닌 생성을 저해시키는지 세포의 변화를 관찰한 결과, 오배자는 100 ㎎/㎖에서 가장 뛰어난 멜라닌 생성 저해 효과를 보여주었으며, 농도 의존적으로 효과를 보이는 것으로 나타났다(Fig. 8).
- 오배자가 자외선으로 인하여 과다 발현된 MMP-1에게 미치는 결과를 알아보기 위해 western blot을 통해 단백질 변화를 관찰해 본 결과, 자외선에 노출된 HS68 세포는 그렇지 못한 것에 비하여 MMP-1의 발현이 증가되는 것을 관찰할 수 있었으며, 자외선을 노출시킨 후 오배자를 처리하였을 때 MMP-1의 발현이 감소하였다(Fig. 4).
- 이를 바탕으로 Elastase를 억제하는 오배자가 MMP-1을 억제하는 효과와 함께 TIMP-1 발현효과를 관찰하기 위하여 UVA를 HS68 Cell인 HS68세포에 노출시켜 변화를 관찰하여 보았다. 우선 HS68 세포에 대한 오배자의 세포생존률에 미치는 영향을 살펴보기 위해 10, 50, 100 및 250 ㎍/㎖농도의 오배자를 처리한 결과, HS68 세포는 96.8, 92.9, 97.1 및 104.8%의 생존률을 보여주어 오배자는 250 ㎍/㎖ 까지의 모든 농도에서 95% 이상의 HS68 세포에 대한 세포생존률을 보여주었고, 각 군간 통계적인 유의성은 없어, 그 중에서도 가장 안전하다고 판단되는 50 ㎍/㎖의 농도를 사용하여 UVA를 유도한 뒤 시료처리를 수행하였다. Sim4) 등은 UVA 조사로 인하여 MMP-1 유전자의 mRNA 발현이 증폭되는 것을 관찰하였는데, 이러한 사실을 바탕으로 UVA를 2분간 조사하여 collagen을 파괴하는 MMP-1의 발현과 오배자의 관계를 mRNA 발현과 단백질 발현에서 조사한 결과 자외선조사를 받지 않은 HS68 세포에 비하여 자외선조사를 받은 세포가 많은 양의 MMP-1을 발현하는 것을 관찰하였으며, 오배자가 UVA에 의하여 증가되는 MMP-1의 mRNA 발현을 우수하게 저해시키는 것을 관찰할 수 있었다.
- . 이러한 사실을 바탕으로 Elastase inhibition assay를 수행한 결과, 오배자가 Elastase 억제 활성이 우수하게 나타났으며 500, 1000(㎍/㎖)의 농도 의존적으로 Elastase를 억제효과가 유의한 것으로 나타났다.
- 이상으로 오배자가 피부의 탄력성을 저하시키고 주름을 유발하는 Elastase를 500 ㎍/㎖의 농도에서 현저히 억제할 뿐 아니라, UVA의 자극에 의해서 진피층에서 유도되는 MMP-1의 다량 발현에 대하여 mRNA level 뿐 아니라 단백질 level에서도 억제하고, 주요 전사인자인 c-fos 및 c-jun에 대한 전사억제 효과도 50 ㎍/㎖의 농도에서 보여주었다. 또 collagen을 보호하는 항 주름 효과와, 멜라닌을 생성하는데 있어 중추적인 역할을 하는 Tyrosinase는 역시 100 ㎍/㎖의 농도에서부터 500 ㎍/㎖까지 농도 의존적으로 억제하는 뛰어난 효능을 보여주었으며, 이러한 효과의 주요 분자들인 MiTF단백질과 tyrosinase 단백질, 그리고 육안적인 멜라닌세포의 억제 효과를 역시 100 ㎍/㎖의 농도에서 관찰할 수 있었다.
- 이상의 연구 결과로 오배자는 UVA에 의한 MMP-1의 활성 저해와 Elastase 억제 효과 뿐 아니라 멜라닌 생성을 유도하는 Tyrosinase 억제 효과를 지님을 분자생물학적으로 확인하였고, 이는 오배자가 주름억제와 미백의 효능을 지니는 기능성 소재로써 활용가치가 있음을 보여준다.
후속연구
- 을 이용하여 UVA를 노출시켜 RNA level에서의 c-Fos와 c-Jun의 변화를 관찰한 결과 아무런 변화를 보여주지 못하였다. MMP-1의 발현 과정 중 신호전달과정과 전사과정에서의 변화가 UVA에 의해서 있을 것이라고 생각되나 c-Fos와 c-Jun는 전사 인자이기 때문에 mRNA의 발현량으로는 실제 기능을 수행하는지 확인이 어렵다고 사료되었으며, 향후 EMSA assay를 통하여 c-Fos와 c-Jun이 실제 기능 수행에 있어 어떠한 변화가 있는지 관찰해 보아야 할 것으로 생각되었다.
- 이러한 실험결과를 미루어 볼 때, 오배자의 항 주름 뿐 아니라 미백 효과를 함께 가진 우수한 효능을 가진 주요 후보물질로 생각되어 지며, 미백, 항 주름을 한꺼번에 실험하고 미백에서도 또한 다른 실험적인 방법을 씀으로 인한 각 실험용량의 차이가 50 ㎍/㎖에서 500 ㎍/㎖로 다양하나 elastase activity 활성억제를 제외한 대부분의 실험에서 50 ㎍/㎖에서 100 ㎍/㎖의 용량에서 효과를 보여주어 유의성을 가질 수 있으며, 이러한 용량 등의 문제는 이미 유효성을 확인하였으므로 추후의 동물실험 등을 통해서 재확인할 필요가 있을 것으로 생각된다. 다양한 피부의 미백 및 항 주름제의 개발에 대한 다양한 노력이 기울어지고 있으나, 미백과 항 주름제의 동시개선 효과를 보이는 후보물질은 많지 않은 상태에서 오배자의 미백 및 항 주름에 동시에 미치는 효과는 매우 의미가 크다고 생각되며 실제 임상에서 적용될 가능성을 높이 가지고 있어 이에 대한 추가 실험이 반드시 필요할 것으로 생각된다.
- 또 collagen을 보호하는 항 주름 효과와, 멜라닌을 생성하는데 있어 중추적인 역할을 하는 Tyrosinase는 역시 100 ㎍/㎖의 농도에서부터 500 ㎍/㎖까지 농도 의존적으로 억제하는 뛰어난 효능을 보여주었으며, 이러한 효과의 주요 분자들인 MiTF단백질과 tyrosinase 단백질, 그리고 육안적인 멜라닌세포의 억제 효과를 역시 100 ㎍/㎖의 농도에서 관찰할 수 있었다. 이러한 실험결과를 미루어 볼 때, 오배자의 항 주름 뿐 아니라 미백 효과를 함께 가진 우수한 효능을 가진 주요 후보물질로 생각되어 지며, 미백, 항 주름을 한꺼번에 실험하고 미백에서도 또한 다른 실험적인 방법을 씀으로 인한 각 실험용량의 차이가 50 ㎍/㎖에서 500 ㎍/㎖로 다양하나 elastase activity 활성억제를 제외한 대부분의 실험에서 50 ㎍/㎖에서 100 ㎍/㎖의 용량에서 효과를 보여주어 유의성을 가질 수 있으며, 이러한 용량 등의 문제는 이미 유효성을 확인하였으므로 추후의 동물실험 등을 통해서 재확인할 필요가 있을 것으로 생각된다. 다양한 피부의 미백 및 항 주름제의 개발에 대한 다양한 노력이 기울어지고 있으나, 미백과 항 주름제의 동시개선 효과를 보이는 후보물질은 많지 않은 상태에서 오배자의 미백 및 항 주름에 동시에 미치는 효과는 매우 의미가 크다고 생각되며 실제 임상에서 적용될 가능성을 높이 가지고 있어 이에 대한 추가 실험이 반드시 필요할 것으로 생각된다.
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