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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 강활추출물이 천식억제 및 면역 조절효과에 대한 영향을 규명하고자 천식을 유발시킨 생쥐의 기관지폐포세척액에서 호산구․림프구를 관찰하고, IL-3, IL-5, IL-13, IgE 등을 ELISA방법으로 측정, 비교 분석하여 유의한 결과를 얻어 보고하는 바이다.
제안 방법
- 2 ㎖를 복강 내로 주사하여 전신감작을 시키고, 이후 3주째에는 생쥐를 마취한 후 OVA (500 μg/ ㎖) 100 ㎕를 기도 투여(IT : intra trachea)하였다. 4～8주째까지는 분무기를 이용하여 2.5 ㎎/㎖ OVA/PBS 40㎕를 8～12주째까지는 5 ㎍/㎖의 OVA/ PBS 40 ㎕를 air compressor를 이용하여 20분간 주 3회 노출시켰다. 이때 정상군은 PBS 만을 주사, 흡입시켰다.
- OVA/alum로 전신 감작 시킨 4～12주째까지 매일 1회 200 ㎎/㎏ 농도로 oral zonde needle를 사용하여 경구투여 하였다.
- 18 ㎕ Taq polymerase (5 U/㎕)를 첨가한 다음 최종 부피가 30 ㎕ 되도록 멸균증류수를 가하고 predenaturation; 95℃, 5분, denaturation; 74℃, 5분, annealing; 55℃, 1분, elongation; 72℃, 1분을 25 cycle한 뒤 postelongation을 72℃에서 3분 동안의 조건으로 PCR을 수행하였다. 각 PCR products는 20 ㎕씩 1.2% agarose gel에 loading하여 50 V 조건에서 30 분간 전기영동하여 분석하였다.
- 각 실험군의 생쥐에서 떼어낸 폐 조직을 homogenizer 를 이용하여 분쇄한 후 RNAzol B (Tel-Test, USA)를 이용하여 total RNA를 추출하였다. 추출한 RNA는 Diethyl Pyrocarbonate (DEPC)를 처리한 20 ㎕의 증류수에 용해시켜 정량하고, RNA를 확인하기 위하여 RNA 4 ㎍을 EtBr이 들어있는 formaldehyde buffer와 섞어 70℃에서 10 분간 denaturation 시킨 후, formaldehyde를 넣은 1.
- 생쥐에서 분리한 폐포세척액에서 각 cytokine량을 측정하기 위해 IL-4, IL-5, IL-13, IgE을 ELISA Kit를 사용하여 측정하였다. 각각의 cytokine 및 면역글로블린에대한 항체를 coating 완충용액에 희석하여 microwell에 100 ㎕씩 분주하여 4℃에서 overnignt 하였다.
- 실험 마지막 날, 생쥐를 희생시킨 후 표피를 열고, DMEM 배양액 1 ㎖를 넣은 주사기를 기관지에 삽입하고 끈으로 묶어 고정한 후 3회 순환시켜 분리한 후 RBC lysis (Sigma, USA)용액을 37℃에서 5분 동안 처리하여 적혈구를 용해시키고 다시 배지로 세척한 후 0.04% trypan blue로 염색한 후 세포 수를 측정하였다. 나머지폐포세척액은 냉장하였다가 cytokine과 면역글로블린 측정에 사용하였다.
- 실험은 7마리를 한 군으로 하여 정상군(nomal group : 천식을 유발하지 않고 증류수만 투여한 군), 대조군(control group : 천식을 유발시키고 증류수 투여한 군), 실험군 I (NR I : 천식을 유발하지 않고 강활투여군), 실험군 II (NR II : 천식을 유발시키고 강활투여군)으로나누었다.
- 역전사 반응은 준비된 total RNA 3 ㎍에 해당하는 양을 75℃에서 10분 동안 denaturation시키고, 이 denaturated total RNA 3 ㎍에 2.5 ㎕의 10 mM dNTPs, 1 ㎕의 random sequence hexanucleotides (25 pM/25 ㎕), RNA inhibitor로서 1uL의 RNAsin (20 U/㎕), 1 ㎕의 100 mM DTT 및 4 ㎕의 5 × RT buffer (250 mM Tris-Cl, pH 8.3, 375 mM KCl, 15 mM MgCl 2 )를 혼합한 후, 1 ㎕의 M-MLV RT(200 U/㎕)를 첨가한 뒤 DEPC 처리된 증류 수를 더하여 최종 부피가 20 ㎕L가 되도록 하였다.
- 이 침전물(pellet)에 증류수를 가하여 원래의 양으로 용해한 후 100 μg OVA을 0.2 ㎖를 복강 내로 주사하여 전신감작을 시키고, 이후 3주째에는 생쥐를 마취한 후 OVA (500 μg/ ㎖) 100 ㎕를 기도 투여(IT : intra trachea)하였다.
- 추출한 RNA는 Diethyl Pyrocarbonate (DEPC)를 처리한 20 ㎕의 증류수에 용해시켜 정량하고, RNA를 확인하기 위하여 RNA 4 ㎍을 EtBr이 들어있는 formaldehyde buffer와 섞어 70℃에서 10 분간 denaturation 시킨 후, formaldehyde를 넣은 1.5 % agarose gel에 loading dye와 함께 loading 하여 그 양을 확인하였다.
대상 데이터
- Table 2. Effect of NR Extract on Lung Weight in Mice with OVA-induced Asthmatic Mouse Lung Weight C57BL/6 mice were injected, inhaled and sprayed with OVA for 12 weeks (3 times a week) for asthma sensitization and challenge. The mice in the prophylaxis / treatment group were treated with NR extract for the later 8 weeks (3 times / week).
- Table 2. Effect of NR Extract on Lung Weight in Mice with OVA-induced Asthmatic Mouse Lung Weight C57BL/6 mice were injected, inhaled and sprayed with OVA for 12 weeks (3 times a week) for asthma sensitization and challenge. The mice in the prophylaxis / treatment group were treated with NR extract for the later 8 weeks (3 times / week).
- Chicken egg albumin (Sigma, USA) Aluminum potassium sulfate (Sigma, USA), Diethyl pyrocarbonate (Sigma, USA), Isopropanol (Sigma, USA), RBC lysis solution (Sigma, USA), Ethidium bromide (Sigma, USA), Dulbecco’s phosphate buffered saline (Sigma, USA), D-phosphate buffer saline (Sigma, USA) Chloroform (Sigma, USA), RPMI-1640 (Sigma, USA), Collagenase (Sigma, USA), Dulbecco’s Modified Eagle Medium Gibco, USA), Fetal bovine serum (Gibco, USA), RNAzolB (Tel-Test, USA), Taq polymerase (TaKaRa, Japan), Deoxynucleotide triphosphate (TaKaRa, Japan), Moloey Murine Leukemia TaKaRa, Japan), Virus Reverse (TaKaRa, Japan), Transcriptase (TaKaRa, Japan), M-MLV RT RNase (TaKaRa, Japan), Moloey Murine Leukemia Virus Reverse (TaKaRa, Japan), Transcriptase ; M-MLV RT RNase (TaKaRa, Japan), inhibitor (TaKaRa, Japan), Agarose (FMC, USA), IL-5 ELISA KIT (Biosource, USA), IL-4 ELISA KIT (Biosource, USA), IL-13 ELISA KIT (R＆D Systems Shibayagi, Japan), IgE ELISA KIT (R＆D Systems Shibayagi, Japan)에서 사용하였다.
- Rotary evaporator (Eyela, Japan), Spectrophotometer (Shimazu, Japan), Centrifuge (Sigma, USA),. Primus 96 thermocycler system (MWG Biotech, Germany), Ice maker (Vision과학, Korea), Homogenizer (OMNi, USA), Plate shaker (Lab-Line, USA), Digital thickness gauge (Mitutoyo Corp, Japan), Cytological Centrifuge (Hanil, Korea), Bio-freezer (Sanyo, Japan), Elisa Reader (Molecular devices, USA), Air compressor (Tamiya, Japan), 열탕 추출기(Daewoong, Korea), Pulverizer (Rong tsong, Taiwan) 에서 사용하였다.
- 본 연구에서 사용된 실험동물은 자성인 4～5주령의 C57BL/6 mouse를 대한실험센터에서 공급받아 실험 당일 까지 고형사료(항생제 무첨가, 삼양재료)와 물을 충분히 공급하고, 실온 22±2℃를 유지하여 2주일간 실험실 환경에 적응시킨 후 실험에 사용하였다.
- 실험에 사용된 강활(Notopterygii Rhizoma ; NR)은경동시장에서 구입하여 중부대학교 본초학교실에서 감정한 후 정선하여 4℃에서 냉장 보관하면서 시료로 사용하였다.
- 이 20 ㎕의 반응 혼합액을 잘 섞은 뒤 원심분리하여 37℃ 항온 수조에서 60분 동안 반응시켜 first-strand cDNA를 합성한 다음, 95℃에서 10분 동안 방치하여 M-MLV RT를 불활성화시키고 즉시 얼음으로 옮겼다. 합성이 완료된 firststrand cDNA는 PCR(Polymerase Chain Reaction)에 사용 하였다.
- 확인한 RNA는 Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)에 사용하였다.
데이터처리
- 본 실험에서 얻은 결과를 Student’s t-test (JAVA, Bonferroni Ver 1.1)로 분석하여 p값을 구하였다.
이론/모형
- PCR은 Primus 96 Legal PCR system(MWG, Germany)을 이용하여 수행하였다. 반응은 이미 합성된 1 uL의 first-strand cDNA를 주형으로 사용하였다.
성능/효과
- 1. OVA 유발한 천식모델에서 강활추출물을 투여한 결과, lung weight의 무게와 lung 내의 total cells 수, BALF 내의 leukocyte와 eosinophils의 수가 유의하게 감소하였다
- 3. 강활추출물에 의해 control군에 비해 TNF-α, IL-5, IL-4 및 IL-13 등의 mRNA발현이 감소하였다.
- BALF에서 IL-13의 level를 측정한 결과, OVA로 천식을 유도한 control군에 비하여 NR Ⅱ군에서는 IL-13이 유의하게 감소하였다(Fig. 1).
- BALF에서 IgE의 level을 측정한 결과, OVA으로 천식을 유발한 control군에 비하여 NR Ⅱ군에서 IgE가 유의하게 감소하였다(Fig. 2).
- 2. IL-4, IL-5, IL-13, IgE는 BALF에서 control군에 비하여 강활추출물을 투여군에서 유의하게 감소하였다.
- IL-5는 Th2세포 및 활성화와 비만세포에 의해 생산되며 호산구의 성장과 분화를 자극하고 성숙한 호산구를 활성화 시키고 세포내의 과립 분비를 유도하는 것으로알려져 있는데8), 본 실험에서 BALF에서 IL-5의 level을측정한 결과, OVA로 천식 유도한 control군에 비하여 NR Ⅱ군에서 IL-5가 유의하게 감소하였다(Fig. 1).
- Table 3에서와 같이 OVA로 천식을 유도한 control군에 비하여 NR Ⅱ군의 폐 세척액 내의 eosinophils 수가 유의하게 감소하였다(Table 3).
- 기도 안은 점액물질로 인하여 기도 폐쇄를 보이고, 기도벽은 호산구, 림프구 등의 염증세포가 침착되어 붓게되므로 무게가 증가하는데, control군에 비하여 NR Ⅱ군에서는 lung weight가 유의하게 감소한 것으로 보아 강활추출물이 천식억제에 효과가 있을 것으로 사료된다.
- 따라서 BALF에서 OVA로 천식을 유도한 대조군에 비하여 NR Ⅱ군의 IL-4의 수치가 감소한 것으로 보아 강활추출물이 면역조절에 영향을 끼친다고 판단된다.
- 따라서 BALF에서 OVA로 천식을 유발군에 비하여 NRⅡ군에서 IgE 수치가 감소한 것을 보아 강활추출물이 면역조절에 영향을 끼친다고 판단된다.
- 따라서 control군에서 eosinophils 수가 증가한 것으로 보아 천식 유발 된 것을 확인할 수 있고, NR Ⅱ군에서는 eosinophils 수가 감소한 것으로 보아 강활추출물이 천식을 억제하는 데 영향을 끼치는 것으로 판단된다(Table 3).
- , 이는 폐 자체의 염증과 관련하여 감염에 저항하기 위해 BALF 내 total leukocyte 수가 증가했음을 의미한다. 본 실험 결과 OVA로 천식을 유도한 대조 군에 비하여 NR Ⅱ군의 폐 세척액 내의 총 leukocyte 수가 유의하게 감소하였다(Table 3).
- 본 실험에서 BALF에서 IL-4의 level을 측정한 결과, OVA로 천식 유도한 대조군에 비하여 NR Ⅱ군에서는 IL-4가 유의하게 감소하였다(Fig. 1).
- 천식 유발과 관련된 여러 cytokine 들의 mRNA 발현을 관찰한 결과, OVA로 천식을 유발한 control군에 비하여 NR Ⅱ군에서의 TNF-α, IL-5, IL-4, IL-13 등의 mRNA 발현이 감소한 것을 보아 강활추출물이 면역조절에 영향을 끼친다고 판단된다(Fig. 3).
- 천식이 유발되면 기관지 및 기관의 염증으로 인해 각종 면역세포 증가와 다소 유관하여 폐의 무게가 증가하는 것으로 알려져 있는데 6), 본 실험 결과 OVA로 천식을 유도한 control군에 비하여 NR Ⅱ군의 lung weight가 유의하게 감소하였다(Table 2).
- 천식이 유발된 대조군에 비하여 NR Ⅱ군에서는 leukocyte 의 수가 유의하게 감소한 것으로 보아 강활추출물이 천식을 억제시키는 것으로 생각되었다.
- 천식이 유발된 대조군에 비하여 NR Ⅱ군에서는 총 세포 수가 유의하게 감소한 것으로 보아 강활추출물이 천식 억제에 효과가 있을 것으로 사료된다.
후속연구
- 이상의 결과로 보아 강활추출물이 면역조절작용을 통한 천식의 억제하는 효과가 있을 것으로 생각되며, 향후 다양한 병리적 인자 및 약물에 대한 심도있는 연구가 필요할 것으로 사료된다.
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