항산화물에 의한 천식 억제 효과를 확인하기 위하여 항산화정도를 알아볼 수 있는 DPPH, FRAP, hydroxyl radical 소거활성 실험을 high throughput-compatible chemical assay로 디자인하여 해바라기씨 추출물에 적용하여 보았다. 해바라기씨 추출물의 용매에 따른 항산화 효과 중 $H_2O_2$에 의한 산화스트레스에 의한 세포사멸을 DW추출물에서 강한 억제능력을 보였다. 이를 이용하여 마우스를 이용한 천식 동물모델에 적용하여 탁월한 천식 억제효과를 $CD4^+$세포, IL-4와 IL-13의 발현정도를 통해 알수 있었다. 해바라기씨 추출물은 천식에 탁월한 효과가 있는 것으로 in vitro 및 in vivo 실험으로 증명하였다.
항산화물에 의한 천식 억제 효과를 확인하기 위하여 항산화정도를 알아볼 수 있는 DPPH, FRAP, hydroxyl radical 소거활성 실험을 high throughput-compatible chemical assay로 디자인하여 해바라기씨 추출물에 적용하여 보았다. 해바라기씨 추출물의 용매에 따른 항산화 효과 중 $H_2O_2$에 의한 산화스트레스에 의한 세포사멸을 DW추출물에서 강한 억제능력을 보였다. 이를 이용하여 마우스를 이용한 천식 동물모델에 적용하여 탁월한 천식 억제효과를 $CD4^+$세포, IL-4와 IL-13의 발현정도를 통해 알수 있었다. 해바라기씨 추출물은 천식에 탁월한 효과가 있는 것으로 in vitro 및 in vivo 실험으로 증명하였다.
In order to investigate whether antioxidant biomaterials inhibits IL-4 and/or IL-13 expression in vitro and in vivo, we carried out antioxidant assays by enzyme or cell-based assays with Helianthus annuus extract. Antioxidant assays include DPPH, FRAP, hydroxyl radical assays. Helianthus annuus extr...
In order to investigate whether antioxidant biomaterials inhibits IL-4 and/or IL-13 expression in vitro and in vivo, we carried out antioxidant assays by enzyme or cell-based assays with Helianthus annuus extract. Antioxidant assays include DPPH, FRAP, hydroxyl radical assays. Helianthus annuus extract exhibited SOD scavenging activity, and had different patterns by each solvent extracted reaction. DW extract inhibited oxidative stress by $H_2O_2$ that induced apoptosis. We measured $CD4^+$ cell and IL-/13 cytokine expression in a classical mouse animal model. The result show that Helianthus annuus extract showed strung inhibition of immune response in the lung. These result suggest that Helianthus annuus extract can reduce inflammation induced by n mouse asthma model.
In order to investigate whether antioxidant biomaterials inhibits IL-4 and/or IL-13 expression in vitro and in vivo, we carried out antioxidant assays by enzyme or cell-based assays with Helianthus annuus extract. Antioxidant assays include DPPH, FRAP, hydroxyl radical assays. Helianthus annuus extract exhibited SOD scavenging activity, and had different patterns by each solvent extracted reaction. DW extract inhibited oxidative stress by $H_2O_2$ that induced apoptosis. We measured $CD4^+$ cell and IL-/13 cytokine expression in a classical mouse animal model. The result show that Helianthus annuus extract showed strung inhibition of immune response in the lung. These result suggest that Helianthus annuus extract can reduce inflammation induced by n mouse asthma model.
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문제 정의
본 연구는 천식과 관련하여 항산화능이 있는 해바라기씨 를 여러 가지 식품소재로부터 예비 스크리닝을 하였으며, 이러한 항산화능을 가진 해바라기씨가 천식에 얼마나 효과가 있는지를 알아보고자 in vitro assay는 물론 CD4+ T-cell과 cytokine인 IL-4, IL-13의 발현 정도를 천식 동물 모델을 이용하여 알아보고자 하였다.
최근 천식과 관련된 보고 중에 산화물이 천식유발의 한 원인이라는 보고가 있기 때문에 항산화활성을 보인 해바라기씨 추출물을 천식 동물모델을 이용하여 항천식 효과의 유무를 확인해 보았다. 천식 동물 모델을 이용하여 면역반응과 관련하여 해바라기씨 추출물의 효능을 알아보고자 하였다. 실험 결과 천식 유발 모델인 마우스 폐를 hematoxihne-eosin(HE)염색을 이용하여 확인 하였으며, CD4+ 세포와 사이토카인 IL-4, IL-13의 발현 여부를 확인해 보았다.
가설 설정
; DW, ♦; DMSO, ■;ethanol, ▲; methanol, *). C; Hydro radical activity of HAS showed high activity in ethanol and methanol extract.
제안 방법
Hydroxyl radical 소거 활성은 Fe" 와 H2O2가 반응하는 Fenton 반응을 이용하여 2-deoxyribose를 산화시켜 MDA (malondialdehyde) 로 분해시킬 때 나오는 MDA를 530 nm에 서 측정하여 활성을 알아보았다. 반응액으로는 50 mg FeSQ .
이후 DW로 수세 후 탈수과정을 거쳐 파라핀으로 포매를 하였다. 4-6 im로 절편 후 탈파라핀 과정을 거쳤으며, 염색은 hematoxilhne-eosin을 이용하여 염색을 한 후 현미경으로 관찰 하였다.
DPPH radical 소거활성능 측정은 이전에 보고된 방법을 응용하여 실험을 하였다. 각 추출물의 시료를 10 μL와 0.
Hydroxyl radical 활성 정도는 Fe2 와 H2O2 가 반응하는 Fenton's reaction에 의해 생성되어진 hydroxyl radical이 2-deoxyreibose를 산화시켜 분해된 malondialdehyde (MDA)를 530nm에서 측정하였다. 해바라기씨 추출물의 활성 정도는 methanol, ethanol, DW, DMSO의 순서로 활성을 나타 내었다.
1차 Antibody(l% BSA/PBST, 1:200)는 4°C에서 overnight 처리 후 washing 후 2차 Antibody(l% BSA/PBST, 1:500)를 1시간 동안 실온에서 처리하였다. washing 후 발색반응은 DAB(DAKO, Cat. 003222)를 이용하여 발색 후 mount 하였으며, 이후 현미경을 이용하여 관찰하였다.
파라핀 블록을 4-6 μm로 절편 후 slide wanner 37°C에서 overnight 하였다. xylene에 3번씩 10분 동안 탈파라핀 과정 을 거쳤으며, ethanol (100, 90, 80, 70%)에 농도별로 1분씩 xylene을 제거하였다. washing 후 peroxidase blocking 과정으로 3% HQz 15 분간 시행 후 blocking을 1% BSA/PBST로 30 분간 4°C에서 실시하였다.
항산화 실험의 경우 방법과 실험의 종류가 매우 다양하며, 빠른 시간에 할 수 있어 스크리닝(screening)시에 가장 많이 쓰이는 방법 중의 하나이다(20-22). 본 실험 또한 최초 스크리닝 시에는 1,000 여종의 농산물과 한약재를 항산화 방법을 이용하여 스크리닝 하였다. 이후 해바라기씨에 대한 효과를 바탕으로 cell-based assay를 실시하였다.
세포 사멸 반응은 수용성의 tetrazolium salt를 포함한 CCK-2 kit(Dojindo, Maryland, USA) 을 이용하여 세포의 미토콘드리아의 탈수소 효소(dehydrogenase)에 의해서 환원되는 fcsmazan의 양을 450 nm에서 측정하였다. 본 실험에서는 H2O2로 산화 스트레스를 주어서 세포사멸을 유도한다 음 세포의 생존율을 이용하여 각각의 후보물질(hit)이 가지는 활성을 측정하였다(5).
세포 사멸 반응은 수용성의 tetrazolium salt를 포함한 CCK-2 kit(Dojindo, Maryland, USA) 을 이용하여 세포의 미토콘드리아의 탈수소 효소(dehydrogenase)에 의해서 환원되는 fcsmazan의 양을 450 nm에서 측정하였다. 본 실험에서는 H2O2로 산화 스트레스를 주어서 세포사멸을 유도한다 음 세포의 생존율을 이용하여 각각의 후보물질(hit)이 가지는 활성을 측정하였다(5).
천식 동물 모델을 이용하여 면역반응과 관련하여 해바라기씨 추출물의 효능을 알아보고자 하였다. 실험 결과 천식 유발 모델인 마우스 폐를 hematoxihne-eosin(HE)염색을 이용하여 확인 하였으며, CD4+ 세포와 사이토카인 IL-4, IL-13의 발현 여부를 확인해 보았다. 면역염색을 통해 알아본 결과 천식 모델의 경우 허파조직에서 CD4+세포의 수가 조직전반에 걸쳐 나타나는 것을 알 수 있었다.
이는 추출 용매 의 화학적 특성과 관련이 있는 것으로 사료 되며, SH-SY5Y 세포주를 이용한 세포사멸 억제 실험에서는 DW 추출물에서 그 활성이 가장 높게 나왔다. 용매 자체의 독성은 그 양이 미미해 실험상에서는 나타나지 않았지만, DW 추출물의 경우 용매자체의 독성이 나타나지 않아 이후 실험을 DW 추출물을 이용하여 실험을 하였다.
본 실험 또한 최초 스크리닝 시에는 1,000 여종의 농산물과 한약재를 항산화 방법을 이용하여 스크리닝 하였다. 이후 해바라기씨에 대한 효과를 바탕으로 cell-based assay를 실시하였다. H2O2에 의해 산화스트레스에 의한 세포사멸과정 중에 나타 나는 억제효과를 알아본 결과, H2O2는 세포내에서 산화스트레스를 일으켜 세포사멸(apoptosis)을 유도한다.
천식 동물모델은 마우스를 이용한 것으로 Balb/c(@8 주 령)를 이용하였다. 천식 모델의 경우 Ovalbumin(OVA) 50 μg과 xylazine(l mg)을 PBS에 녹여 0, 6, 12일로 3회 복강 투여하였으며, 이후 에어로졸(aerosol)을 이용하여 생리식염수에 녹인 OVA(10 mg/mL)를 매일 마우스의 호흡기 에 2주간 분무를 하였다. 천식 비유발 모델의 경우 PBS를 복강 주사하였으며, 생리식염수만을 분무하였다.
최근 천식과 관련된 보고 중에 산화물이 천식유발의 한 원인이라는 보고가 있기 때문에 항산화활성을 보인 해바라기씨 추출물을 천식 동물모델을 이용하여 항천식 효과의 유무를 확인해 보았다. 천식 동물 모델을 이용하여 면역반응과 관련하여 해바라기씨 추출물의 효능을 알아보고자 하였다.
6, 300 mM) : 10 mM의 TPTZ (2, 4, 6-tripyridyl-s-triazine) : 20 mM의 RC&6H2O를 10 : 1 : 1의 비율로 섞어 실험직전에 만들어 사용을 하였다 반응액(190 μL)과 추출물 (10 μL)을 혼합한 후 100초 간격으로 약 15분간 590 nm에서 흡광도를 측정하였다. 환원력은 시간에 따른 상대비교를 하였으며, 재료별 활성정도는 15분 후의 값을 기준으로 하였다(18).
천식 비유발 모델의 경우 PBS를 복강 주사하였으며, 생리식염수만을 분무하였다. 효능 실 험군에서는 추출물을 aerosol을 분무하는 2주간 1 mL씩을 경구투여로 마우스에 처리를 하였다(19).
대상 데이터
본 실험에 사용된 재료인 해바라기씨는 시내 대형 농산물 전문 유통단지에서 구입하였다. 추출용매로 DW, DMSO, 에탄올(ethaigl), 메탄올(methanol) 등을 사용하였다.
천식모델을 확인하기 위해 마우스의 허파조직을 이용하였다. 절취된 조직은 4% paraformaldehyde(PBS, pH 7.
본 실험에 사용된 재료인 해바라기씨는 시내 대형 농산물 전문 유통단지에서 구입하였다. 추출용매로 DW, DMSO, 에탄올(ethaigl), 메탄올(methanol) 등을 사용하였다. 추출 용매에 따라 DW의 경우 60°C에서 24시간 동안의 열수 추출 과정을 거쳤으며, DMSO, 에탄올, 메탄올의 경우에는 24시간 동안 실온에서 shaking 과정을 거쳐 추출하 였다.
이론/모형
천식 동물모델은 마우스를 이용한 것으로 Balb/c(@8 주 령)를 이용하였다. 천식 모델의 경우 Ovalbumin(OVA) 50 μg과 xylazine(l mg)을 PBS에 녹여 0, 6, 12일로 3회 복강 투여하였으며, 이후 에어로졸(aerosol)을 이용하여 생리식염수에 녹인 OVA(10 mg/mL)를 매일 마우스의 호흡기 에 2주간 분무를 하였다.
성능/효과
DPPH (1, 1 -Diphenyl-2-picrylhydrazyl)는 매우 안정 한 firee radical로서 517nm에서 특징적 인 광흡수를 나타내는 보라색 화합물이다. DPPH가 가진 radical 은 알코올 등의 유기 용매에서 매우 안정하며 항산화 기 작 중 proton-radical scavenger에 의하여 탈색되기 때문에 항산화 활성을 육안으로 쉽게 관찰할 수 있을 뿐 아니라 광흡수가 되는 비율을 이용하여 antioxidant의 정도를 나타낼 수 있다 본 실험에서 해바라기씨 추출물의 활성은 methanol, DMSO, DW, ethanol 의 순서로 활성이 나타났다.
이후 해바라기씨에 대한 효과를 바탕으로 cell-based assay를 실시하였다. H2O2에 의해 산화스트레스에 의한 세포사멸과정 중에 나타 나는 억제효과를 알아본 결과, H2O2는 세포내에서 산화스트레스를 일으켜 세포사멸(apoptosis)을 유도한다. 실험결 과 해바라기씨 추출물에 의한 산화스트레스의 억제를 확인 할 수 있었다.
실험 결과 천식 유발 모델인 마우스 폐를 hematoxihne-eosin(HE)염색을 이용하여 확인 하였으며, CD4+ 세포와 사이토카인 IL-4, IL-13의 발현 여부를 확인해 보았다. 면역염색을 통해 알아본 결과 천식 모델의 경우 허파조직에서 CD4+세포의 수가 조직전반에 걸쳐 나타나는 것을 알 수 있었다. 반면 해바라기 추출물을 투여한 군에서 는 CD4+세포의 발현 빈도가 현저히 떨어지는 것을 알 수 있었다.
반면 해바라기 추출물을 투여한 군에서 는 CD4+세포의 발현 빈도가 현저히 떨어지는 것을 알 수 있었다. 사이토카인인 IL-4와 IL-13 또한 천식 모델에 비해 해바라기씨 추출물을 투여한 군에서 현저히 낮게 발현되는 것으로 나타났다. 맥문동(Liriopis tuber)은 천식과 면역과민 반응에 한방에서 주로 사용되는 약재로 동물모델 실험에서 본 실험과 비슷한 결과를 얻은 바가 있다(23).
H2O2에 의해 산화스트레스에 의한 세포사멸과정 중에 나타 나는 억제효과를 알아본 결과, H2O2는 세포내에서 산화스트레스를 일으켜 세포사멸(apoptosis)을 유도한다. 실험결 과 해바라기씨 추출물에 의한 산화스트레스의 억제를 확인 할 수 있었다. 활성 순서는 DW, DMSO, ethanol, methanol의 순서로 나타났으며, 특히 DW를 용매로 한 추출물에서 활성이 매우 높게 나타났다.
천식과 관련한 메커니즘은 아직 많은 연구가 필요한 시점이다. 한편 해바라기씨는 이전부터 한방에서 향일규라는 이름으로 많이 사용되어 왔으며, 본 연구결과 산화스트레스에 의한 세포사멸 보호 효과가 탁월하며, 천식모델에서 폐의 면역반응을 유도하는 CD4+ 세포와 IL-4, IL-13 사이토카인의 억제활성이 탁월하게 나타났다. 이와 관련하여 해바라기씨에 대한 성분분석과 함께 보다 많은 연구가 진행된다면 이를 이용한 기능성 천식 완화용 소재의 개발이 용이하리라 판단된다.
실험결 과 해바라기씨 추출물에 의한 산화스트레스의 억제를 확인 할 수 있었다. 활성 순서는 DW, DMSO, ethanol, methanol의 순서로 나타났으며, 특히 DW를 용매로 한 추출물에서 활성이 매우 높게 나타났다.
후속연구
한편 해바라기씨는 이전부터 한방에서 향일규라는 이름으로 많이 사용되어 왔으며, 본 연구결과 산화스트레스에 의한 세포사멸 보호 효과가 탁월하며, 천식모델에서 폐의 면역반응을 유도하는 CD4+ 세포와 IL-4, IL-13 사이토카인의 억제활성이 탁월하게 나타났다. 이와 관련하여 해바라기씨에 대한 성분분석과 함께 보다 많은 연구가 진행된다면 이를 이용한 기능성 천식 완화용 소재의 개발이 용이하리라 판단된다.
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