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문제 정의
- 본 연구는 경북 김천시 인근의 자생 돌더덕의 추출물을 이용하여 산화적 스트레스에 대한 항산화 활성을 확인하였으며, 이를 마우스 항천식 모델[20]을 이용하여 돌더덕의 천식억제 효과를 알아보고자 하였다.
- 최근 천식과 관련된 보고 중에 산화물이 천식유발의 중요한 원인이며, 이의 점진적인 증사는 자가면역질환을 증가시키는 것으로 보고하고 있다. 항산화 활성을 보인 더덕 추출물이 항천식 활성 여부를 마우스 모델을 이용한 동물실험을 통해 알아보고자 하였다. 실험 결과 천식 유발 모델인 마우스 폐를 hematoxylin-eosin (HE) 및 PAS 염색을 이용하여 확인 하였으며, 허파조직에서 histamine, IL-31, MMP9의 발현 여부를 면역염색을 통해 알아보았다.
제안 방법
- 4-6 μm로 절편 후 탈파라핀 과정을 거쳤으며, 염색은 hematoxilline-eosin을 이용하여 염색을 한 후 현미경으로 관찰하였다.
- Cu2+이온의 전자를 받아들여 Cu+로 되는 것을 이용한 방법으로 0.25 mL CuCl2 용액(0.01 M), 0.25 mL CH3COONH4 buffer 용액(1 m)에 돌더덕추출물을 농도별로 처리한 후 상온에서 30 분간 반응 후 흡광도 450 nm에서 더덕 추출물에 의한 Cu2+의 감소정도를 확인하였다[4].
- 1차 Antibody (1% BSA/PBST, 1:200)는 4℃에서 overnight 처리 후 washing 후 2차 Antibody (1% BSA/PBST, 1:500)를 1시간 동안 실온에서 처리하였다. washing 후 발색반응은 DAB (Dako, Cat. 003222)를 이용하여 발색 후 mount 하였으며, 이후 현미경을 이용하여 관찰하였다.
- 파라핀 블록을 4-6 μm로 절편 후 slide warmer 37 ℃에서 overnight 하였다. xylene에 3번씩 10분 동안 탈파라핀 과정을 거쳤으며, ethanol (100, 90, 80, 70%)에 농도별로 1분씩 xylene을 제거하였다. washing 후 peroxidase blocking 과정으로 3% H2O2 15분간 시행 후 blocking을 1% BSA/PBST로 30 분간 4℃에서 실시하였다.
- 돌더덕 추출물을 이용하여 항산화 활성을 DPPH, FRAP,Cupper 실험을 이용하여 확인하였으며, 마우스를 이용한 동물모델에서 항천식 활성을 확인하였다. DPPH (1,1-Diphenyl2-picrylhydrazyl)는 매우 안정한 free radical로서 517 nm에서 특징적인 광흡수를 나타내는 보라색 화합물인데, DPPH를 가진 radical은 알코올 등의 유기용매에서 매우 안정하며 항산화 기작 중 proton-radical scavenger에 의하여 탈색되기 때문에 항산화 활성을 육안으로 쉽게 관찰할 수 있을 뿐 아니라, 광흡수가 되는 비율을 이용하여 antioxidant의 정도를 나타낼 수 있다.
- 4-6 μm로 절편 후 탈파라핀 과정을 거쳤으며, 염색은 hematoxilline-eosin을 이용하여 염색을 한 후 현미경으로 관찰하였다. 동일한 절편을 이용하여 점액질을 확인하기f 위해 PAS 염색을 실시하였다. 조직 채취 전에 마우스의 혈액을 채취하였으며, serum에서 IL-13의 양을 ELISA kit을 이용하여 측정하였으며, 조직 시료를 활용하여 전체 세포수를 카운팅하였고, 핵의 모양을 판별하여 eosinophil의 수를 판별하였다.
- 5A). 또한, 염증이 유도된 부분에 다양한 종류의 면역세포들의 이동이 있는데 이와 관련 조직 내 세포와 알레르기 반응에 관여하는 eosinophil의 수를 카운트 하여 보았다. 허파 조직 내 전체 세포의 수는 천식 유도시 천식을 유도하지 않은 그룹에 비해 약 6.
- lanceolata)은 경상북도 김천시 대항면 운수리 소재의 야산(약 800 m)에 자생하는 더덕으로 약15~20년생으로 추정되며, 이의 voucher specimen은 경북대 식품효소생물공학연구실에 보관 중(2014-Cl)이며, 이의 진위여부는 경북대학교 생물학과 및 대구약전골목의 대훈약업사의 전문가에 의하여 확인하였다. 먼저, 뿌리부분을 절단하고 3차례 수세한 후 분쇄기(homogenizer, Hanil Co., Seoul, Korea)를 이용하여 파쇄 후, 원심분리기(Hanil Co., Seoul, Korea)를 이용하여 3,000x g에서 15분간 원심분리하였으며, 그 상층액의 원액을 membrane filter (0.8 mm, Milipore, Billerica, MA, USA)를 이용하여 제균하여 실험에 사용하였다.
- 항산화 활성을 보인 더덕 추출물이 항천식 활성 여부를 마우스 모델을 이용한 동물실험을 통해 알아보고자 하였다. 실험 결과 천식 유발 모델인 마우스 폐를 hematoxylin-eosin (HE) 및 PAS 염색을 이용하여 확인 하였으며, 허파조직에서 histamine, IL-31, MMP9의 발현 여부를 면역염색을 통해 알아보았다. 실험 결과 천식 모델의 경우 혈관 주변의 airway 조직에서 천식을 유도하지 않은 군에 비해 다수의 cell이 확인 되었으며, 반면 더덕 추출물을 처리한 군에서는 세포의 밀집 정도가 크게 감소되는 것을 알 수 있었다.
- 동일한 절편을 이용하여 점액질을 확인하기f 위해 PAS 염색을 실시하였다. 조직 채취 전에 마우스의 혈액을 채취하였으며, serum에서 IL-13의 양을 ELISA kit을 이용하여 측정하였으며, 조직 시료를 활용하여 전체 세포수를 카운팅하였고, 핵의 모양을 판별하여 eosinophil의 수를 판별하였다.
- 천식 동물모델에 사용된 마우스에서 혈액을 추출하여 ELISA를 통한 IL-13의 양을 측정하였다. IL-13은 자가면역질환을 증가시키는 cytokine으로 천식이 유도된 경우 크게 증가하는 것으로 알려져 있다.
- 천식모델의 경우 ovalbumin (OVA) 50 μg과 xylazine (1 mg)을 phosphate-buffered saline (PBS)에 녹여 0, 6, 12일로 3회 복강 투여하였으며, 에어로졸(aerosol)을 이용하여 생리식염수에 녹인 OVA (10mg/mL)를 매일 마우스의 호흡기에 2주간 분무하였다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용된 돌더덕(C. lanceolata)은 경상북도 김천시 대항면 운수리 소재의 야산(약 800 m)에 자생하는 더덕으로 약15~20년생으로 추정되며, 이의 voucher specimen은 경북대 식품효소생물공학연구실에 보관 중(2014-Cl)이며, 이의 진위여부는 경북대학교 생물학과 및 대구약전골목의 대훈약업사의 전문가에 의하여 확인하였다. 먼저, 뿌리부분을 절단하고 3차례 수세한 후 분쇄기(homogenizer, Hanil Co.
- 천식 동물모델은 Balb/c (7 wk, male, Samtaco Korea, Osan, Korea)를 구입하여 사용하였으며, 경북대학교 동물실험윤리위원회의 가이드라인에 의거하여 승인(2013-0064-1)을 받아 동물사육사에서 실시하였다. 천식모델의 경우 ovalbumin (OVA) 50 μg과 xylazine (1 mg)을 phosphate-buffered saline (PBS)에 녹여 0, 6, 12일로 3회 복강 투여하였으며, 에어로졸(aerosol)을 이용하여 생리식염수에 녹인 OVA (10mg/mL)를 매일 마우스의 호흡기에 2주간 분무하였다.
데이터처리
- 각 실험에 이용된 그룹 간 통계처리결과는 엑셀프로그램을 사용하여 SD (standard deviation) 값을 구하여 산정하여 error bar로 산정하였으며, student t-test의 검정에 값으로 p<0.05 수준의 값을 산정하였다.
성능/효과
- 1B). Cu2+-reducing ability는 Cu2+이 Cu+로 되는 것을 이용하여 환원력을 알아보는 것으로 이의 활성 또한 돌더덕 추출물의 농도에 따라 활성이 증가하는 것을 알 수 있었다(Fig. 1C). 항산화 실험의 경우, 이를 확인하는 방법과 실험의 종류는 매우 다양하다.
- 1A). FRAP 활성은 화합물의 환원력(ferric reducing ability)을 측정하는 것으로 ferric tripyridyltriazine (FeⅢ-TPTZ)가 환원제 (antioxidant)에 의해서 파란색의 ferrous tripyridyltriazine(FeⅡ-TPTZ)로 될 때 흡광도를 측정하여 환원력을 알아보는 것으로 본 실험에서는 DPPH 활성과 동일하게 돌더덕 추출물의 농도에 따라 증가하는 것으로 나타났다(Fig. 1B). Cu2+-reducing ability는 Cu2+이 Cu+로 되는 것을 이용하여 환원력을 알아보는 것으로 이의 활성 또한 돌더덕 추출물의 농도에 따라 활성이 증가하는 것을 알 수 있었다(Fig.
- 실험 결과 천식 모델의 경우 혈관 주변의 airway 조직에서 천식을 유도하지 않은 군에 비해 다수의 cell이 확인 되었으며, 반면 더덕 추출물을 처리한 군에서는 세포의 밀집 정도가 크게 감소되는 것을 알 수 있었다. PAS 염색은 염증 정도를 확인 할 수 있는 방법으로 더덕 추출물을 처리한 군에서 천식을 유도한 군에 비해 염색정도가 크게 감소하는 것을 알 수 있었다(Fig. 3).
- 따라서 빠른 시간에 수행할 수 있어서 스크리닝(screening)시에 가장 많이 쓰이는 방법 중 3가지를 사용하였다. 그 결과, 3가지 방법 모두에서 돌더덕 추출물이 우수한 항산화 활성을 가지는 것을 확인 할 수 있었다(Fig. 1C). 돌더덕 추출물을 섭취시킨 마우스의 혈액에서 산화스트레스를 억제하는 SOD(superoxide dismutase)의 활성이 증가했다는 보고가 있으며[11], 더덕 껍질에서의 성분 분석 및 항산화 활성에 관한 보고[10] 등이 있는데, 본 연구에서는 야생 돌더덕 추출물을 이용하여 DPPH, FRAP, CUPRAC 실험을 통한 항산화 활성을 알아본 결과, 농도에 따른 항산화 활성이 증가하는 경향을 발견하였다.
- 면역 조직화학 염색을 통해 histamine, IL-31 (interleukin31), MMP-9 (matrix metalloproteinase-9)의 발현을 허파조직에서 확인한 결과 histamine은 천식을 유도한 경우 airway 상피에서 크게 증가하는 것을 알 수 있었으며, IL-31은 상피로 침투한 세포로부터 확인할 수 있었다. MMP-9 positive 세포는 천식을 유도한 경우 airway와 이 주변부의 조직에서 다수 나타나는 것을 확인 할 수 있었다.
- DPPH (1,1-Diphenyl2-picrylhydrazyl)는 매우 안정한 free radical로서 517 nm에서 특징적인 광흡수를 나타내는 보라색 화합물인데, DPPH를 가진 radical은 알코올 등의 유기용매에서 매우 안정하며 항산화 기작 중 proton-radical scavenger에 의하여 탈색되기 때문에 항산화 활성을 육안으로 쉽게 관찰할 수 있을 뿐 아니라, 광흡수가 되는 비율을 이용하여 antioxidant의 정도를 나타낼 수 있다. 본 실험에서 돌더덕 추출물의 활성은 추출물의 처리 농도에 따라 농도의존적으로 증가하는 것을 알 수 있었다(Fig.1A). FRAP 활성은 화합물의 환원력(ferric reducing ability)을 측정하는 것으로 ferric tripyridyltriazine (FeⅢ-TPTZ)가 환원제 (antioxidant)에 의해서 파란색의 ferrous tripyridyltriazine(FeⅡ-TPTZ)로 될 때 흡광도를 측정하여 환원력을 알아보는 것으로 본 실험에서는 DPPH 활성과 동일하게 돌더덕 추출물의 농도에 따라 증가하는 것으로 나타났다(Fig.
- 이외에도 더덕의 주성분 중 하나인 사포닌에 의해 염증억제 효과를 보고한 연구결과도 있다[13]. 본 연구에서 돌더덕 추출물을 이용하여 마우스 천식 모델에 적용한 결과, 허파 내에서의 염증 억제 활성을 확인할 수 있었으며, 염증 마커 중의 하나인 histamine, IL-31, MMP-9의 발현이 억제되는 것을 알 수 있었다.
- 또한 B 세포의 활성 억제 및 염증을 유도하는 다양한 마커에 대한 연구가 진행 중에 있다. 본 연구에서 사용한 돌더덕은 예로부터 호흡기 질환에 이용이 되어 그 효능이 익히 알려져 있으며, 실험적으로 천식이 유도된 마우스에서 IL-13의 발현이 감소되는 것을 확인할 수 있었으며, 허파 내 면역세포의 침투억제는 물론 염증을 유도하는 histamine, 면역세포 마커인 IL-31, 세포의 운동성에 관여하는 ECM (extracellular matrix)의 MMP9의 발현이 감소되는 것을 알 수 있었다. 이와 관련하여 돌더덕에 대한 성분분석과 함께 보다 많은 연구가 진행된다면 이를 이용한 기능성 천식 완화용 소재의 개발이 용이하리라 판단된다.
- 5B). 세포의 형태를 바탕으로 확인한 eosinophil의 숫적 비교는 천식유도군에 비해 약 71% 감소하는 것을 확인하였다(Fig. 5C).
- 실험 결과 천식 유발 모델인 마우스 폐를 hematoxylin-eosin (HE) 및 PAS 염색을 이용하여 확인 하였으며, 허파조직에서 histamine, IL-31, MMP9의 발현 여부를 면역염색을 통해 알아보았다. 실험 결과 천식 모델의 경우 혈관 주변의 airway 조직에서 천식을 유도하지 않은 군에 비해 다수의 cell이 확인 되었으며, 반면 더덕 추출물을 처리한 군에서는 세포의 밀집 정도가 크게 감소되는 것을 알 수 있었다. PAS 염색은 염증 정도를 확인 할 수 있는 방법으로 더덕 추출물을 처리한 군에서 천식을 유도한 군에 비해 염색정도가 크게 감소하는 것을 알 수 있었다(Fig.
- IL-13은 자가면역질환을 증가시키는 cytokine으로 천식이 유도된 경우 크게 증가하는 것으로 알려져 있다. 천식 유도군에서 약 2.5배 증가하는 IL-13을 확인 할 수 있었으며, 돌더덕 추출물을 처리한 경우 크게 감소되는 것을 알 수 있었다(Fig. 5A). 또한, 염증이 유도된 부분에 다양한 종류의 면역세포들의 이동이 있는데 이와 관련 조직 내 세포와 알레르기 반응에 관여하는 eosinophil의 수를 카운트 하여 보았다.
- 또한, 염증이 유도된 부분에 다양한 종류의 면역세포들의 이동이 있는데 이와 관련 조직 내 세포와 알레르기 반응에 관여하는 eosinophil의 수를 카운트 하여 보았다. 허파 조직 내 전체 세포의 수는 천식 유도시 천식을 유도하지 않은 그룹에 비해 약 6.4배 증가하는 것으로 나타났으며, 돌더덕 추출물을 처리한 경우 천식유도군에 비해 약 61% 정도 감소하는 것으로 나타났다(Fig. 5B). 세포의 형태를 바탕으로 확인한 eosinophil의 숫적 비교는 천식유도군에 비해 약 71% 감소하는 것을 확인하였다(Fig.
후속연구
- 본 연구에서 사용한 돌더덕은 예로부터 호흡기 질환에 이용이 되어 그 효능이 익히 알려져 있으며, 실험적으로 천식이 유도된 마우스에서 IL-13의 발현이 감소되는 것을 확인할 수 있었으며, 허파 내 면역세포의 침투억제는 물론 염증을 유도하는 histamine, 면역세포 마커인 IL-31, 세포의 운동성에 관여하는 ECM (extracellular matrix)의 MMP9의 발현이 감소되는 것을 알 수 있었다. 이와 관련하여 돌더덕에 대한 성분분석과 함께 보다 많은 연구가 진행된다면 이를 이용한 기능성 천식 완화용 소재의 개발이 용이하리라 판단된다.
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