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문제 정의
- 국화과(Compositae)에 속하는 식물들은 쌍떡잎식물 가운데 가장 진화된 식물로 전 세계에 956속 2만여 종이 분포하고, 한국에는 현재 390여 종이 알려져 있다[11,20]. 국화과에는 한약재로 사용되고 있는 많은 식물들이 포함되어 있는데, 본 연구에서는 그 중에서 항미생물 활성이 있는 것으로 이미 보고된 누로(절굿대)와 대계(엉겅퀴) 추출물의 mycobacteria에 대한 항균력을 시험하였다.
- 대계(엉겅퀴)의 추출물이 mycobacteria에 대한 항균력을 가지고 있음을 확인하였기 때문에, 본 연구에 사용된 엉겅퀴의 계통분류학적 분류를 위하여 ITS1, 5.8S rRNA 및 ITS2 DNA 염기서열을 밝혀서 사용하고자 하였다. 따라서 PCR의 template로 사용하기 위하여 엉겅퀴의 건조된 뿌리로부터 genomic DNA를 추출하려 시도하였다.
- Mycobacterium 속에 속하는 세균들은 원칙적으로 모두가 인류에 병원균이며, 세포벽에 다량의 mycolic acid를 함유하는 등 여러 가지 독특한 특징들을 공유하고 있다. 따라서 본 연구에서는 여러 다른 미생물들에 대해서 항미생물 활성이 있는 것으로 알려진 누로 및 대계의 추출물이 Mycobacterium 속의 세균들인 Mycobacterium smegmatis 및 Mycobacterium fortuitum의 증식을 억제하는 능력이 있는지를 시험해 보았다. 만일 이 두 종의 식물들로부터 mycobacteria의 증식을 억제하는 물질이 발견된다면 새로운 결핵 치료제로 개발될 가능성이 있기 때문이다.
제안 방법
- PCR 반응은 DNA template 18 ng, ITS1 primer 2.5 pmol, ITS4 primer 2.5 pmol, dNTPs mixture 2 μl (10 nM each) 그리고 DyNAzyme EXT DNA polymerase (New England BioLabs) 1 μl (1 U)를 포함하는 50 μl의 반응액에서 진행하였다.
- 누로와 대계 추출물을 여러 가지 다른 농도로 희석하여 M. smegmatis 및 M. fortuitum에 대한 항균력을 filter disc를 사용하여 측정하였다. 그 결과, 누로 추출액은 희석여부와 관계없이 inhibition zone이 전혀 관찰되지 않았다.
- 8S rRNA 및 ITS2 DNA 염기서열을 밝혀서 사용하고자 하였다. 따라서 PCR의 template로 사용하기 위하여 엉겅퀴의 건조된 뿌리로부터 genomic DNA를 추출하려 시도하였다. 그러나 여러 가지 방법들을 시도해 보았으나 평균 크기가 1 kb를 넘는 DNA를 추출할 수가 없었다.
- 건조된 엉겅퀴의 뿌리로부터 genomic DNA를 추출하려 시도 하였으나 고분자량의 DNA를 추출하는 데에 실패하였다. 따라서 건조된 엉겅퀴의 잎으로부터 genomic DNA를 추출하였다. 막자사발로 분쇄한 건조된 엉겅퀴 잎 30 mg을 OMEGA Bio-Tek (www.
- 따라서 본 연구에서는 누로와 대계 추출물이 mycobacteria의 증식을 억제하는 능력이 있는지를 확인하고, 억제 능력이 있는 것으로 나타난 대계(엉겅퀴)의 ITS1, 5.8S rRNA 및 ITS2의 염기서열을 밝혀내어 비교분석을 수행하였다.
- 따라서 건조된 엉겅퀴의 잎으로부터 genomic DNA를 추출하였다. 막자사발로 분쇄한 건조된 엉겅퀴 잎 30 mg을 OMEGA Bio-Tek (www.omegabiotek.com)의 EZNATM SQ Plant DNA Kit를 사용하여 genomic DNA를 정제하였다.
- 흰색의 colony들 중에서 3개를 선택하고, 이들로부터 plasmid DNA를 추출하고, agarose gel electrophoresis를 통해서 예상되는 크기의 insert DNA가 포함되어있는 것을 확인한 후, 염기서열 분석을 수행하였다. 염기서열 분석을 위해서는 T3 및 T7 promoter primers를 사용하여 양쪽 strand를 모두 분석하여 서로 비교하였다. 염기서열 분석은 (주)바이오닉스(서울특별시 구로구 구로 3동 235번지)에 의뢰하였다.
- 염기서열 분석은 (주)바이오닉스(서울특별시 구로구 구로 3동 235번지)에 의뢰하였다. 염기서열의 비교분석은 GenBank의 BLAST 및 ClustalW1.83를 통해서 수행하였다.
- 외국에서는 엉겅퀴의 분류에 분자유전학적인 방법을 많이 사용하고 있는 것을 고려하면 국내산 엉겅퀴들의 분자유전학적인 자료를 확보하여 연구를 하는 것이 시급하다고 할 수 있다[5,23]. 이 경우에 ITS1과 ITS2의 염기서열을 분석하여 서로 비교하는 것이 일반적인 방법인데, 본 연구에서는 강원도 정선 지역에 자생하는 엉겅퀴의 ITS1과 ITS2의 염기서열을 분석하여 GenBank의 BLAST를 통해 분석하였다.
- PCR에는 proofreading 기능을 가지고 있는 DyNAzyme EXT DNA polymerase를 사용함으로써 DNA 합성 반응 중에 error가 발생하는 것을 최소화 하였다. 이렇게 얻어진 PCR 산물을 Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega Corp.)으로 정제하였다.
- 메탄올 추출물의 희석하지 않은 원액 50 μl, 1/2로 희석된 액 50 μl 그리고 1/4로 희석된 액 50 μl를 각각 직경이 8 mm인 filter disc에 떨어뜨리고 건조시켰다. 이렇게 준비된 filter disc를 세균이 도말된 agar plate에 떨어뜨리고, 37℃에서 세균들을 배양하며 inhibition zone의 형성 여부를 관찰하였다. 이때에 추출물이 포함되지 않은 methanol도 50 μl를 filter disc에 떨어뜨리고 건조시켜서 control로 사용하였다.
- 1, lane C). 이와 같이 얻어진 PCR 산물을 pBluescript plasmid에 cloning하여서 DNA sequencing을 수행하였다. 그 결과 733 bp의 염기서열이 밝혀졌고(Fig.
- 절굿대와 엉겅퀴의 건조된 식물체를 A11 basic analytical mill (IKA Works, Inc.)을 이용하여 15-30 초 동안 분쇄하였다. 분쇄된 식물체 0.
- 위와 같이 정제된 PCR 산물을 ethanol을 사용하여 침전시키고, 정제된 DNA는 SmaⅠ으로 절단된 pBluescript SK Ⅱ plasmid와 섞어서 ligation 반응을 진행시킨 후, Escherichia coli DH5α competent cell을 transformation 시키는 데에 사용하고, transformed cells는 ampicillin (10 μg/ml)을 함유하는 MacConkey agar plate에 도말하였다. 흰색의 colony들 중에서 3개를 선택하고, 이들로부터 plasmid DNA를 추출하고, agarose gel electrophoresis를 통해서 예상되는 크기의 insert DNA가 포함되어있는 것을 확인한 후, 염기서열 분석을 수행하였다. 염기서열 분석을 위해서는 T3 및 T7 promoter primers를 사용하여 양쪽 strand를 모두 분석하여 서로 비교하였다.
대상 데이터
- Mycobacterium fortuitum 및 Mycobacterium smegmatis는 Middlebrook 7H9 medium에서 하루 정도 배양하였다. 이것을 1/10의 같은 medium으로 희석한 후, 희석된 배양액 1 ml를 Middlebrook 7H9 agar에 spreading하고, 액체가 보이지 않을 때까지 공기로 건조시켰다.
- 본 연구에 사용된 절굿대와 엉겅퀴는 강원도 정선 지역에서 채취된 것들을 사용하였다. 항균력 시험에는 Mycobacterium smegmatis mc2155 균주 및 Mycobacterium fortuitum ATCC 19542 균주를 사용하였다.
- 염기서열 분석을 위해서는 T3 및 T7 promoter primers를 사용하여 양쪽 strand를 모두 분석하여 서로 비교하였다. 염기서열 분석은 (주)바이오닉스(서울특별시 구로구 구로 3동 235번지)에 의뢰하였다. 염기서열의 비교분석은 GenBank의 BLAST 및 ClustalW1.
- 본 연구에 사용된 절굿대와 엉겅퀴는 강원도 정선 지역에서 채취된 것들을 사용하였다. 항균력 시험에는 Mycobacterium smegmatis mc2155 균주 및 Mycobacterium fortuitum ATCC 19542 균주를 사용하였다.
성능/효과
- 또한 Song과 Kim에 의하면 한국산 엉겅퀴속에 대해서는 도감상의 간단한 형태적 기재가 이루어져 있을 뿐 체계적인 연구에 따른 분류는 전혀 되어 있지 않아서 분포 종수에서도 큰 차이를 보여주고 있다고 되어 있다[22]. GenBank에 염기서열이 등록된 C. crispus는 Spain에서 채취된 것이고, C. defloratus는 독일에서 채취된 것임을 감안하면, 본 연구에서 사용된 엉겅퀴, 즉 강원도 정선 지역에 자생하는 엉겅퀴가 이들 유럽종과 대단히 가깝다는 것을 알 수 있다. 현재 한반도에서는 C.
- 따라서 Carduus spp. JS가 한반도에 귀화해서 자생하는 C. crispus의 변종일 수가 있고, 아니면 한반도에서의 존재가 아직까지 보고되지 않은 또 다른 유럽종인 C. defloratus의 변종일 가능성도 있고, 또한 이들 두 종간의 교잡종일 가능성도 있다. 현재 국내의 엉겅퀴에 대한 유전학적인 자료가 전무한 상태이기 때문에 좀 더 많은 자료가 알려져야 Carduus spp.
- 반응조건은 94℃에서 2 분간 한 cycle, 그리고 94℃에서 30 초, 53℃에서 30 초, 72℃에서 1 분씩 30 cycle을 진행시킨 후, 최종적으로 72℃에서 5 분간 유지시켰다. PCR에는 proofreading 기능을 가지고 있는 DyNAzyme EXT DNA polymerase를 사용함으로써 DNA 합성 반응 중에 error가 발생하는 것을 최소화 하였다. 이렇게 얻어진 PCR 산물을 Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega Corp.
- 3에 나타내었다. 결과를 보면 Carduus 속과 Cirsium 속은 확연하게 서로 다른 그룹을 형성하고 있는 것을 볼 수 있다. 따라서 Bremmer의 우려에도 불구하고 현재까지는 형태에 의존한 분류와 분자유전학적 분류결과가 서로 잘 일치하고 있다고 볼 수 있다[2].
- 이와 같이 얻어진 PCR 산물을 pBluescript plasmid에 cloning하여서 DNA sequencing을 수행하였다. 그 결과 733 bp의 염기서열이 밝혀졌고(Fig. 2), 이 염기서열을 GenBank에 등록하였다(accession number GU188570). 그 결과, 한국에 자생하는 엉겅퀴로서는 최초로 본 연구에 사용된 엉겅퀴의 ITS1, 5.
- fortuitum에 대한 항균력을 filter disc를 사용하여 측정하였다. 그 결과, 누로 추출액은 희석여부와 관계없이 inhibition zone이 전혀 관찰되지 않았다. 그러나 대계의 희석하지 않은 추출액의 경우는 inhibition zone의 직경이 약 14 mm, 1/2로 희석한 경우는 약 12 mm, 그리고 1/4로 희석한 경우는 약 10 mm로 나타났다.
- 2), 이 염기서열을 GenBank에 등록하였다(accession number GU188570). 그 결과, 한국에 자생하는 엉겅퀴로서는 최초로 본 연구에 사용된 엉겅퀴의 ITS1, 5.8S rRNA 및 ITS2의 염기서열이 GenBank에 등록되게 되었다. 진핵생물들의 종(species) 수준에서의 분자유전학적(phylogenetic) 분류를 위해서는 ITS1과 ITS2의 염기서열을 주로 사용하는데, 현재 국내의 엉겅퀴의 경우에는 이러한 자료가 알려져 있는 것이 없기 때문에 국내 자생종들과의 추가적인 비교분석은 수행할 수가 없었다.
- 그리고 본 연구에 사용된 엉겅퀴와 분자유전학적으로 가까운 종들은 Cirsium속의 식물들이 아닌 Carduus속의 식물들이기 때문에, mycobacteria에 대한 항균물질의 screening은 Carduus속의 식물들로부터 시작하는 것이 유리하지 않는가 하고 판단된다.
- 에 의하면 통상 엉겅퀴라고 불리는 식물들 간에도 그 유효성분에 있어서의 차이가 크다는 것이 밝혀졌다[10]. 따라서 건조되어 시중에서 약초로 사용되는 한약재들 중에서 genomic DNA의 염기서열을 밝혀서 식물 종을 확인한 다음에 사용하지 않는다면, 그 약효가 서로 확연하게 다를 수 있음을 본 연구에서 추가로 확인할 수 있었다. 물론 형태를 근거로 종(species) 간의 분류를 할 수도 있으나, 종간의 분류에 이용되는 형태적인 기준이 모호하거나, 이러한 기준이 되는 특성들이 식물의 영양상태나 생육환경에 영향을 받을 가능성을 배제할 수가 없기 때문에, 종이나 변종 간의 구분을 위해서는 국내 자생 엉겅퀴의 체계적인 분자유전학적 자료가 더욱 필요하다고 생각된다.
- 그러나 여러 가지 방법들을 시도해 보았으나 평균 크기가 1 kb를 넘는 DNA를 추출할 수가 없었다. 따라서 엉겅퀴의 건조된 잎을 사용하여 genomic DNA를 추출하려 시도하였는데, 이 경우는 평균 분자량이 10 kb를 훨씬 넘는 DNA를 성공적으로 얻을 수 있었다(Fig. 1, lane B).
- 본 연구에서 사용된 엉겅퀴의 ITS1, 5.8S rRNA 및 ITS2의 염기서열을 사용하여 BLAST analysis를 수행한 결과, 염기서열이 완전히 일치하는 생물체는 아직까지 GenBank에 보고된 적이 없고, 가장 유사한 식물은 Carduus crispus 및 Carduus defloratus로서, 본 연구에 사용된 엉겅퀴의 DNA는 이들 식물들의 DNA와 각각 3개 및 4개씩의 염기가 다른 것으로 나타났다. 따라서 정확한 명칭이 정해질 때까지 본 연구에 사용된 엉겅퀴의 명칭을 Carduus spp.
- 엉겅퀴의 genomic DNA를 사용하여 PCR을 수행한 후, 그 산물을 agarose gel로 분석한 결과, 대략 700 bp 정도의 PCR 산물을 확인할 수가 있었다(Fig. 1, lane C). 이와 같이 얻어진 PCR 산물을 pBluescript plasmid에 cloning하여서 DNA sequencing을 수행하였다.
- 그러나 대계의 희석하지 않은 추출액의 경우는 inhibition zone의 직경이 약 14 mm, 1/2로 희석한 경우는 약 12 mm, 그리고 1/4로 희석한 경우는 약 10 mm로 나타났다. 즉, 대계 추출액의 경우는 농도에 따라서 inhibition zone의 크기가 정비례하는 것을 관찰할 수 있었고, 따라서 대계 추출액이 M. smegmatis 및 M. fortuitum에 대한 항균력을 가지고 있음을 확인할 수 있었다. 대계 추출물이 함유되지 않은 control에서는 inhibition zone이 전혀 관찰되지 않았다.
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