[논문]배추 alternative oxidase 합성 유전자와 연관된 분자마커 개발

정예솔; 정상민

doi:10.5352/jls.2010.20.2.208

배추 alternative oxidase 합성 유전자와 연관된 분자마커 개발
Development of Molecular Markers for Alternative Oxidase Synthesis Genes in Brassica rapa L. 원문보기

생명과학회지 = Journal of life science, v.20 no.2 = no.118, 2010년, pp.208 - 212

정예솔 (동국대학교-서울 생명과학과) , 정상민 (동국대학교-서울 생명과학과)

초록
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작물의 수량과 품질은 저온 및 고온 스트레스에 영향을 받는 것으로 알려져 있다. 본 연구에서는 배추에서의 스트레스 저항성과 연관된 분자마커를 개발하기 위하여 저온에서의 스트레스 저항성에 영향을 미치는 것으로 알려져 있는 alternative oxidase (AOX) 합성 유전자 관련 분자 마커를 개발하였다. 총 15개의 AOX 합성 유전자와 관련된 Brassica rapa ESTs를 arabidopsis AOX 합성 유전자 염기서열을 이용하여 찾을 수 있었다. 이를 이용하여 고온에서 상대적으로 약한 '지부'품종과 상대적으로 강한 '권심' 사이에서 DNA 염기서열을 조사하여 4개의 ESTs에서 insertion 또는 deletion을 찾았고 PCR로 확인 가능한 4개의 공동우성 마커를 개발하였다. 본 연구에서 개발된 분자마커는 배추 작물에서 환경스트레스 저항성과 유전적 연관성을 확인하는데 유용하게 사용될 수 있다고 기대된다.

Abstract ▼ AI-Helper

The low and high temperature stress might affect the yield and quality of many crop species. Alternative oxidase (AOX) gene is known as factors related to stress resistance in plants. In order to develop molecular markers related to stress resistance in Chinese cabbage, fifteen ESTs sharing sequence similarity to arabidopsis AOX genes were found using Brassica rapa EST database from NCBI. The polymorphic DNA sequences using the ESTs were then screened between Chinese cabbage, 'Chiifu' and 'Kenshin'. We found four ESTs that have either insertion or deletion between the two cultivars. These polymorphic sites were then targeted for development of the four PCR based molecular markers. These molecular markers developed in this study could be useful for a test of their relationship with abiotic stress resistance in Chinese cabbage.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

앞서 연구된 벼에서의 AOX 관련 유전자에 대한 논문에 따르면, OsAOX1a가 저온 내성에 관련되며, QTL에 매우 조밀하게 존재해 서로 연관되어 있는 것을 밝혀냈다[1]. 따라서 본 연구에서는 배추작물에서 내냉성, 내서성 및 환경 스트레스 저항성 품종 육성에 사용할 수 있는 마커개발을 위해 배추의 AOX 합성 관련 EST를 대상으로 ‘지부’와 ‘권심' 사이에서 다형성을 보이는 4개의 분자 마커를 개발하였는데 이러한 마커 들은 연구자가 손쉽게 이용이 가능한 PCR 증폭 분자 마커이다. 이는 앞으로 배추작물의 AOX 유전자가 스트레스를 유발 하는 환경 하에서 어떤 세포기작을 이끌어 내는 지에 대한 연구와 환경 내성 형질과 어떤 연관관계를 가지는지를 조사하는데 중요한 자료로 활용될 수 있으며 또한 환경 스트레스 저항성 배추 품종을 개발하는데 있어서 중요한 육종 도구로써 사용될 수 있다고 생각된다.
이러한 경향에 맞춰 본 연구는 배추 내서성 육종에 적용이 가능한 스트레스 저항성 관련 분자마커개발을 위해 AOX 유전자와 관련된 다형성 분자 마커를 개발하였다. 이를 이용하여 장기적으로 저온 저항성에 직접적으로 연관된 DNA 마커 개발을 하여 환경 스트레스 저항성 배추품종개발에 기초연구 자료로 활용될 수 있다고 생각된다.

제안 방법

‘지부(Chiifu)’와 ‘권심(Kenshin)’의 염기서열을 비교하기 위해 각 EST에 그 양 끝 염기서열을 이용하여 포워드 프라이머와 리버스 프라이머를 각각 제작하였다(Table 1).
CTAB method를 이용하여 얻은 ‘지부’와 ‘권심’ DNA를 각각 디자인한 프라이머를 이용하여 PCR증폭을 하였다.
In/del이 있는 경우(예: AO8, AO9, AO11) in/del을 대상으로 가까운 주변 염기서열에서 프라이머를 제작하였다(Table 2). PCR 증폭되는 DNA 크기는 300 bp 이하가 될 수 있도록 프라이머 위치를 제한하여 상대적으로 작은 PCR 증폭 DNA 크기에서 in/del로부터 나타나는 염기서열 크기 차이를 관찰이 가능하도록 하였다(Figs. 2, 3). AO8과 AO11의 경우 ‘지부’ ‘권심’간 5 bp 차이를 보이므로 젤 전기영동 시 200 volt에서 2시간 이상의 충분한 시간으로 이동시켜야 젤 상에서의 크기 차이를 구분할 수 있다.
PCR 증폭을 해 얻은 DNA를 쏠젠트(주)에 염기서열분석을 의뢰하였다. 얻어진 염기서열분석 결과는 staden package 프로그램(http://staden.
1)를 보이는 EST DNA 증폭 밴드를 확인 하여 사용된 프라이머가 직접 분자 표지로 이용 가능함을 확인할 수 있었다. 아가로스 gel 상에서 DNA 크기 차이를 확인 할 수 없었던 나머지 AOX 관련 유전자 증폭 DNA는 염기서열 분석을 통해 insertion 또는 deletion (In/del) 및 SNP 다형성 유무를 확인하였다. 염기서열 분석은 쏠젠트(주)에 의뢰를 하였으며 얻어진 염기서열을 이용하여 SNP와 In/del 분석은 staden pakage program을 이용하여 수행했다.
애기장대의 AOX 합성 관련 유전자를 NCBI 데이터베이스를 이용하여 찾았다[4]. 애기장대에서 찾은 AOX 합성 관련 유전자의 염기서열을 이용하여 EST 데이터베이스를 이용해 검색을 하였으며, Brassica rapa로 제한을 두고, Brassica rapa가 아닌 것은 모두 제거를 하였다. 그 결과 얻은 ESTs를 서로 비교를 하였으며, 동일염기서열을 보이는 ESTs들은 제거하여 총 15개의 ESTs를 얻을 수 있었다(Table 1).
애기장대의 AOX 합성 관련 유전자를 NCBI 데이터베이스를 이용하여 찾았다[4]. 애기장대에서 찾은 AOX 합성 관련 유전자의 염기서열을 이용하여 EST 데이터베이스를 이용해 검색을 하였으며, Brassica rapa로 제한을 두고, Brassica rapa가 아닌 것은 모두 제거를 하였다.
아가로스 gel 상에서 DNA 크기 차이를 확인 할 수 없었던 나머지 AOX 관련 유전자 증폭 DNA는 염기서열 분석을 통해 insertion 또는 deletion (In/del) 및 SNP 다형성 유무를 확인하였다. 염기서열 분석은 쏠젠트(주)에 의뢰를 하였으며 얻어진 염기서열을 이용하여 SNP와 In/del 분석은 staden pakage program을 이용하여 수행했다. 이러한 AOX 합성 관련 유전자 염기서열 비교에서 세 개의 in/del이 추가로 발견되었다(Fig.
PCR 은 93°C에서 3분 후 93°C에서 30초, 50°C에서 1분, 68°C에서 3분 과정을 40회 반복하고, 72°C 7분 후 종료 또는 5°C에서 보관되었다. 증폭된 DNA는 2% 아가로스 gel에서 전기영동을 이용해 DNA 조각의 크기를 확인하였다.
한국배추게놈소재은행으로부터 분양받은 고온 스트레스에 약한 품종 ‘지부’와 비교적 강하다고 알려진 ‘권심’의 배추 종자를 발아시켜 키운 후 어린잎을 수확하고 CTAB method를 이용해 DNA를 추출하였다.

대상 데이터

증폭에 이용된 DNA는 15 ng이고 total volume은 15 μl로 10 mM dNTP 0.3 μl, 10× buffer는 1.5 μl, taq polymerase는 0.4 unit으로 0.08 μl, 100 μM의 Foward primer, Reverse primer 각각 1 μl, ‘지부’와 ‘권심’의 DNA는 15 ng을 사용하였다.

데이터처리

얻어진 염기서열분석 결과는 staden package 프로그램(http://staden.sourceforge.net/)을 이용하여 ‘지부’와 ‘권심’ 간 염기서열을 비교하였다.

성능/효과

염기 서열 분석을 위해 PCR 증폭을 위해 사용한 프라이머 목록은 Table 1과 같다. PCR 증폭 후 아가로스 gel 상에서 DNA 크기 차이(Fig. 1)를 보이는 EST DNA 증폭 밴드를 확인 하여 사용된 프라이머가 직접 분자 표지로 이용 가능함을 확인할 수 있었다. 아가로스 gel 상에서 DNA 크기 차이를 확인 할 수 없었던 나머지 AOX 관련 유전자 증폭 DNA는 염기서열 분석을 통해 insertion 또는 deletion (In/del) 및 SNP 다형성 유무를 확인하였다.
애기장대에서 찾은 AOX 합성 관련 유전자의 염기서열을 이용하여 EST 데이터베이스를 이용해 검색을 하였으며, Brassica rapa로 제한을 두고, Brassica rapa가 아닌 것은 모두 제거를 하였다. 그 결과 얻은 ESTs를 서로 비교를 하였으며, 동일염기서열을 보이는 ESTs들은 제거하여 총 15개의 ESTs를 얻을 수 있었다(Table 1). ‘지부(Chiifu)’와 ‘권심(Kenshin)’의 염기서열을 비교하기 위해 각 EST에 그 양 끝 염기서열을 이용하여 포워드 프라이머와 리버스 프라이머를 각각 제작하였다(Table 1).

후속연구

본 연구에서 개발한 Brassica rapa의 AOX 마커의 경우, 각기 다른 AOX유전자이지만 유사한 EST들이 많아 이를 마커로 개발하는데 어려움이 있었다. 다른 AOX ESTs에서 하나의 프라이머 페어를 사용해서 여러 개의 DNA 밴드가 증폭되는 경우는 추 후 클로닝을 통한 염기서열 분석을 수행하여 추가로 다형성을 확인하고 분자마커를 개발해야 할 필요성이 있는 것으로 생각된다.
본 연구에서 개발한 Brassica rapa의 AOX 마커의 경우, 각기 다른 AOX유전자이지만 유사한 EST들이 많아 이를 마커로 개발하는데 어려움이 있었다. 다른 AOX ESTs에서 하나의 프라이머 페어를 사용해서 여러 개의 DNA 밴드가 증폭되는 경우는 추 후 클로닝을 통한 염기서열 분석을 수행하여 추가로 다형성을 확인하고 분자마커를 개발해야 할 필요성이 있는 것으로 생각된다.
따라서 본 연구에서는 배추작물에서 내냉성, 내서성 및 환경 스트레스 저항성 품종 육성에 사용할 수 있는 마커개발을 위해 배추의 AOX 합성 관련 EST를 대상으로 ‘지부’와 ‘권심' 사이에서 다형성을 보이는 4개의 분자 마커를 개발하였는데 이러한 마커 들은 연구자가 손쉽게 이용이 가능한 PCR 증폭 분자 마커이다. 이는 앞으로 배추작물의 AOX 유전자가 스트레스를 유발 하는 환경 하에서 어떤 세포기작을 이끌어 내는 지에 대한 연구와 환경 내성 형질과 어떤 연관관계를 가지는지를 조사하는데 중요한 자료로 활용될 수 있으며 또한 환경 스트레스 저항성 배추 품종을 개발하는데 있어서 중요한 육종 도구로써 사용될 수 있다고 생각된다.
이러한 경향에 맞춰 본 연구는 배추 내서성 육종에 적용이 가능한 스트레스 저항성 관련 분자마커개발을 위해 AOX 유전자와 관련된 다형성 분자 마커를 개발하였다. 이를 이용하여 장기적으로 저온 저항성에 직접적으로 연관된 DNA 마커 개발을 하여 환경 스트레스 저항성 배추품종개발에 기초연구 자료로 활용될 수 있다고 생각된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	Brassica속은 어떤 작물을 포함하는가?	Brassica속은 씨앗을 이용한 오일, 야채, 및 조미료로 이용 되는 작물 등을 포함한다[8,10]. 그 중 배추, Brassica rapa L.
	Alternative oxidase는 어떤 역할을 한다고 추측되는가?	고온 또는 저온 스트레스가 작용하는 환경에서 활성산소종의 과다한 축적을 방지해 식물체의 활동을 개선하는 것으로 추측되는 기능성 유전자인 Alternative oxidase (AOX) gene은 식물에 있는 전자전달계의 일부분을 형성하는 효소이다[13,18]. AOX 유전자의 발현은 저온스트레스, 활성산소종, 그리고 병원체의 침입 등에 영향을 주는 것으로 알려져 있는데 아마도 산화 스트레스의 감소를 통해 환경 스트레스에 대한 내성 향상을 강화할 것으로 추측된다[12,19].
	배추의 AOX 합성 관련 EST를 대상으로 ‘지부’와 ‘권심' 사이에서 다형성을 보이는 4개의 분자 마커를 개발하였는데, 이는 앞으로의 연구에 어떤 도움을 줄 수 있을 것이라 생각되는가?	따라서 본 연구에서는 배추작물에서 내냉성, 내서성 및 환경 스트레스 저항성 품종 육성에 사용할 수 있는 마커개발을 위해 배추의 AOX 합성 관련 EST를 대상으로 ‘지부’와 ‘권심' 사이에서 다형성을 보이는 4개의 분자 마커를 개발하였는데 이러한 마커 들은 연구자가 손쉽게 이용이 가능한 PCR 증폭 분자 마커이다. 이는 앞으로 배추작물의 AOX 유전자가 스트레스를 유발 하는 환경 하에서 어떤 세포기작을 이끌어 내는 지에 대한 연구와 환경 내성 형질과 어떤 연관관계를 가지는지를 조사하는데 중요한 자료로 활용될 수 있으며 또한 환경 스트레스 저항성 배추 품종을 개발하는데 있어서 중요한 육종 도구로써 사용될 수 있다고 생각된다.

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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