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문제 정의
- 楡根皮의 암 전이 억제 효과와 그 기전을 알아보고자 楡根皮 추출물의 세포독성과 carcinoma cells에 대한 전이 억제 효과 및 복강내 macrophage의 cytokines 와 NK cell활성에 미치는 영향에 대하여 관찰하여 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 이에 저자는 楡根皮의 암 전이 억제 효과와 그 기전을 알아보고자 楡根皮 추출물의 세포 독성과 carcinoma cells에 대한 전이 억제 효과 및 복강내 macrophage의 cytokines와 NK cell활성에 미치는 영향에 대하여 관찰하여 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
가설 설정
- . 이와 같은 효능을 지닌 楡根皮가 면역 활성을 통해 항암 효과를 가지고 있을 것이라는 가정 하에 이 연구를 실시하게 되었다.
제안 방법
- 20마리의 BALB/c 마우스를 NK cell 제거군과 비제거군에 각각 10마리씩 무작위 배정 후, NK cell 제거군은 종양 접종 3일전 및 1일전에 50배 희석된 anti-asialo GM1 항체를 마우스당 500㎕씩 총 2회 복강 주사하였다. NK cell 제거군과 비제거군 마우스 중 각각 5마리를 무작위로 선택하여 楡根皮 추출물 250㎍을 1일 1회 정맥주사 하고, 나머지는 동일한 용량과 방법으로 생리식염수를 정맥주사 하였다.
- BALB/c 마우스에 1% thioglycollate를 1㎖ 복강주사하고 3일 후에 경추 분리법으로 희생시킨 후, 복강에 RPMI-1640배지 10㎖을 주입하여 복강 내 세포 (peritoneal exudative cells:이하 PEC)를 수집하였다.
- 20마리의 BALB/c 마우스를 NK cell 제거군과 비제거군에 각각 10마리씩 무작위 배정 후, NK cell 제거군은 종양 접종 3일전 및 1일전에 50배 희석된 anti-asialo GM1 항체를 마우스당 500㎕씩 총 2회 복강 주사하였다. NK cell 제거군과 비제거군 마우스 중 각각 5마리를 무작위로 선택하여 楡根皮 추출물 250㎍을 1일 1회 정맥주사 하고, 나머지는 동일한 용량과 방법으로 생리식염수를 정맥주사 하였다. 정맥주사 2일 후, 각 마우스 당 2.
- 楡根皮 추출물의 종양 전이 억제 효과가 NK cell의 활성화에 의한 것인지 알아보기 위해 NK cell을 제거하는 antiasialo GM1 항체를 이용하여 실험하였다. NK cell 제거 과정없이 楡根皮 추출물 250㎍/㎖을 투여한 군에서는 아무런 처치도 하지 않은 대조군에 비해 유의하게 종양 전이 억제 효과가 나타났으나 anti-asialo GM1 항체를 처리하여 NK cell이 제거된 상태에서는 楡根皮 추출물 투여군과 대조군에서 종양 전이 억제 효과에 유의한 차이가 없었다.
- 楡根皮의 암전이 억제효과를 in vivo 에서 확인하기 위하여 5마리의 BALB/c 마우스에 楡根皮 추출물 10,50및 250㎍ 을 1일 1회 1일간 정맥주사 하였으며, 대조군은 동일한 용량과 방법으로 생리식 염수를 정맥주사 하였다.정맥주사 2일 후, 각 마우스 당 2.
- 배양 상등액에 유도 분비된 interleukin (이하 IL)-6, IL-10, IL-12 및 tumor necrosis factor (이하 TNF)-α의 측정은 각 cytokine에 대한 ELISA kit(Pharmingen, SanJose, CA, USA)를 사용하여 측정하였으며, 각 cytokines의 양은 각각에 대한 표준곡선에 대입하여 계산하였다.
- 2㎍/㎖까지 희석한 楡根皮 검액 100㎕를 각각 첨가하고 2일간 배양하였다. 배양 완료 2-4시간 전에 cell counting kit (Wako,Japan) 용액을 well당 10㎍/㎖ 첨가 후, 생존세포가 생산한 수용성 formazan의 양을 450㎚에서 흡광도를 측정하였으며, 세포독성 효과는 시료를 첨가하지 않는 대조군에 대한 백분율(%)로 표시하였다.
- 2㎍/㎖까지 희석한 楡根皮 검액 100㎕를 각각 첨가하고 2일간 배양하였다. 배양 완료 2-4시간 전에 cell counting kit (Wako,Japan) 용액을 well당 10㎍/㎖ 첨가 후, 생존세포가 생산한 수용성 formazan의 양을 450㎚에서 흡광도를 측정하였으며, 세포독성 효과는 시료를 첨가하지 않는 대조군에 대한 백분율(%)로 표시하였다.
- . 이에 상이한 농도의 楡根皮 추출물과 carcinoma cell, lymphoma cell, Hela cell, macrophage를 배양하여 세포 독성 여부를 알아보고, 복강 macrophage로부터 cytokine분비능을 조사하여 楡根皮의 면역계 자극 효과를 알아보았다.
- 접종 14일 후 경추분리법으로 마우스를 희생시킨 후 폐를 적출하여 Bouin's 용액에서 전이된 종양을 고정하고 종양의 군집 수를 측정하였다.
- 정맥주사 2일 후, 각 마우스 당 2.7×104 cells의 colon26-M3.1 carcinoma 세포주를 꼬리정맥에 정맥주사로 접종하였다.
- 정맥주사 2일 후, 각 마우스 당 2.7×104개의 colon26-M3.1 carcinoma 세포주를 꼬리정맥에 정맥주사로 접종하였다.
- 생후 6-8주령의 雌性 BALB/c 마우스를 (주)중앙실험동물 (Seoul, Korea)에서 분양 받아 사육조에 각 군별로 5마리씩 배정하였다. 정수된 물과 사료 (Samyang Co. Ltd., Incheon, Korea)를 자유 공급하였고, 온도 22℃, 습도 50% 및 12시간 간격으로 자동 조명되는 상태에서 스트레스를 받지 않도록 주의하여 무균상태로 사육하였다.
- 癥瘕는 養正積自除, 必先調養,使營衛充實, 若不消散,方可議下를 치료 원칙으로 한다. 특히 養正積自除의 치법으로 종양을 직접 공격하기보다 우리 몸의 正氣를 길러 병이 치료되도록 하는 방법을 우선으로 하였다. 癰疽는 外科疾患으로 托裏, 疏通, 行營衛 등의 치법을 시행한다6,7).
대상 데이터
- Colon26-M3.1 carcinoma cell의 배양은 7.5% FBS, vitamin, sodium pyruvate, non-essential amino acid 및 L-glutamine 이 함유된 EMEM 배지를, L5178Y-R lymphoma cells, Hela cells 및 macrophage의 배양은 7.5% FBS가 함유된 RPMI-1640 배지를 각각 이용하였으며 5% CO2, 95% 습도 및 37℃의 배양기 (Thermo, MA, USA) 에서 배양하였다.
- japonica의 건조된 根皮를 HPLC (Methanol. 50°C)로 추출하여 tube에 분주 후 45℃에서 감압 농축법으로 제조한 추출물 (CW04-039)을 구매하여 사용하였다.
- 생후 6-8주령의 雌性 BALB/c 마우스를 (주)중앙실험동물 (Seoul, Korea)에서 분양 받아 사육조에 각 군별로 5마리씩 배정하였다. 정수된 물과 사료 (Samyang Co.
- 종양세포의 배양을 위한 RPMI-1640 과 Eagle's minimal essential medium (이하 EMEM) 배지, fetal bovine serum (이하 FBS), vitamin, non-essential amino acid, L-glutamic acid 및 thioglycollate 등은 Gibco사 (Carlsbad, CA, USA)에서 구입하여 사용하였다.
데이터처리
- 실험군과 대조군의 비교는 Student’s t-test로 분석하였고, p<0.05 이하인 경우를 유의한 것으로 하였다.
성능/효과
- 0.98에서 250.00㎍/㎖의 농도까지 楡根皮 추출물을 투여한 군이 대조군에 비해 많은 양의 TNF-α를 분비하였고, 1000㎍/㎖의 농도에서는 LPS를 투여한 군보다 유의하게 높은 분비 효과를 보였다.
- 2. 암 전이 억제 효과를 보인 농도의 楡根皮 추출물 투여는 colon26-M3.1 carcinoma cell, L5178Y-R lymphoma cell 및 Hela cell에 細胞 毒性을 보이지 않았다.
- 3. 楡根皮 추출물 투여의 세포 독성 효과는 macrophage의 분비에 직접적인 영향을 끼치지 않았다.
- 4. 楡根皮 추출물 투여군은 대조군에 비하여 IL-6, IL-10 및 IL-12의 분비가 모든 농도에서 증가하였고 대체로 농도 의존적으로 증가하였다.
- 5. 楡根皮 추출물 투여군은 대조군에 비하여 TNF-α의 분비가 모든 농도에서 증가하였다.
- 6. NK cell의 존재 하에 楡根皮 추출물 투여군은 대조군에 비하여 유의하게 암 전이를 억제하였으나, NK cell이 제거된 상태에서는 암 전이 억제 효과가 없었다.
- Colon26-M3.1 carcinoma cell에 대한 楡根皮 추출물의 세포 독성 효과를 알아본 결과 8.2, 24.7, 74.1, 222.2㎍/㎖ 농도로 첨가하였을 때, cell growth는 거의 변화하지 않았으나, 666.7㎍/㎖에서 15.2%, 2000㎍/㎖에서 1.7%로 감소하였다. IC50은 400㎍/㎖이었다(Fig.
- Hela cells에 대한 楡根皮 추출물의 세포 독성 효과를 알아본 결과 0.9, 2.7, 8.2, 24.7, 74.1, 222.2㎍/㎖ 농도로 첨가하였을 때, Hela cells의 cell growth는 거의 변화하지 않았으나, 666.7㎍/㎖에서 1.18%, 2000㎍/㎖에서 3.04%로 감소하였다.
- L5178Y-R lymphoma cells에 대한 楡根皮 추출물의 세포 독성 효과를 알아본 결과 0.6, 2.4, 9.8, 39.1, 156.3㎍/㎖ 농도로 첨가하였을 때, cell growth는 거의 변화하지 않았으나, 625㎍/㎖에서 28.07%, 2500㎍/㎖에서 4.82%,10000㎍/㎖에서 0.48% 로 감소하였다. IC50은 380㎍/㎖이었다(Fig.
- Macrophage에 대한 楡根皮 추출물의 세포 독성 효과를 알아본 결과, 1.0, 3.9, 15.6, 62.5, 250㎍/㎖ 농도로 첨가하였을 때, macrophage의 cellgrowth는 거의 변화하지 않았으나, 1000㎍/㎖에서 41.4%, 4000㎍/㎖에서 12.7%로 감소하였다. IC50은 800㎍/㎖이었다(Fig.
- Macrophage의 IL-10 분비에 대한 楡根皮 추출물의 효과를 알아본 결과 대조군에서 14.0±19.8pg/㎖, 楡根皮 추출물 0.98, 3.90, 15.60, 62.50, 250.00㎍/㎖ 첨가 시 5.5±10.6, 30.5±46.0, 348.0±21.2, 568.0±7.1, 585.5±53.0pg/㎖로 IL-10 분비량이 증가하였다.
- Macrophage의 IL-12 분비에 대한 유근피 추출물의 효과를 알아본 결과 대조군에서는 2.6±1.4pg/㎖, 유근피 추출물 0.98, 3.90, 15.60, 62.50, 250.00, 1000.00㎍/㎖ 첨가 시 19.0±11.4, 37.8±15.2, 38.2±1.6, 50.2 ±18.5, 114.0±20.7, 276.7±60.4pg/㎖의 IL-12가 분비되어 농도 의존적으로 증가하는 경향을 보였다(Fig.8).
- Macrophage의 IL-6 분비에 대한 유근피 추출물의 효과를 알아본 결과 대조군에서 9.5±16.4pg/㎖로 나타났으며, 유근피 추출물 0.98, 3.90, 15.60, 62.50, 250.00, 1000.00㎍/㎖ 첨가 시 각각 11.9±19.7, 65.2 ±9.8, 127.8.
- Macrophage의 TNF-α 분비에 대한 유근피 추출물의 효과를 알아본 결과 대조군에서는 1.9±0.6pg/㎖, 유근피 추출물 0.98, 3.90, 15.60, 62.50, 250.00㎍/㎖ 첨가 시 3.1±1.6, 4.8±2.4, 3.1±0.0, 7.0±0.8, 9.8±7.9pg/㎖의 TNF-α가 분비되었고,1000㎍/㎖ 첨가 시 1154.2±122.6pg/㎖ 로 TNF-α 분비량이 증가하였다(Fig.9).
- 楡根皮 추출물의 종양 전이 억제 효과가 NK cell의 활성화에 의한 것인지 알아보기 위해 NK cell을 제거하는 antiasialo GM1 항체를 이용하여 실험하였다. NK cell 제거 과정없이 楡根皮 추출물 250㎍/㎖을 투여한 군에서는 아무런 처치도 하지 않은 대조군에 비해 유의하게 종양 전이 억제 효과가 나타났으나 anti-asialo GM1 항체를 처리하여 NK cell이 제거된 상태에서는 楡根皮 추출물 투여군과 대조군에서 종양 전이 억제 효과에 유의한 차이가 없었다. 따라서 楡根皮 추출물은 NK cell의 활성화를 통해 종양 전이를 억제하는 효과를 갖는다고 결론지을 수 있다.
- colon26-M3.1 carcinoma cell을 이용한 종양 전이 모델에 대한 楡根皮 추출물의 효과를 알아본 결과, 50㎍ 투여군과 250㎍ 투여군에서 유의성 있는 종양 전이 억제 효과를 보였다.
- . 楡根皮 추출물을 투여한 군에서 대조군보다 유의하게 높은 농도로 IL-6분비가 증가하여 楡根皮 추출물이 면역 기능을 활성하는 것으로 사료된다.
- 또한 TNF-α, IL-6, IFN-γ 와 같은 pro-inflammatory cytokine들이 과량 분비되어 IL-10과 같은 anti-inflammatory cytokine들과 균형을 잘 이루지 못하게 되면 숙주의 생존력에 크게 영향을 미친다는 보고가 있다31). 楡根皮 추출물을 투여한 군에서는 대조군보다 유의하게 높은 농도로 분비가 증가되었으나, 1000㎍/㎖의 농도에서는 LPS투여군보다 낮은 농도의 분비능을 보였다. 따라서 적정 농도의 楡根皮 추출물은 여러 cytokine의 생성 균형을 맞추는 역할에 기여한다고 생각된다.
- 楡根皮 추출물의 Macrophage cell에 대한 세포 독성 효과를 실험한 결과, 1∼250㎍/㎖의 농도에서는 세포 독성이 없었고, 1000㎍/㎖부터 cell growth가 41.4%로 줄어들어 세포 독성을 보였다.
- 楡根皮 추출물이 macrophage의 분비에 미치는 영향을 실험한 결과,1000㎍/㎖ 이상의 고농도에서 IL-6, IL-12및 TNF-α는 증가하였고, IL-10에서만 감소하는 경향을 보여 楡根皮 추출물의 세포 독성은 macrophage의 분비에 직접적인 영향을 끼치지 않는 것으로 사료된다.
- 마우스 모델에서 colon26-M3.1 carcinoma cell 전이에 미치는 영향을 알아보고자 10, 50, 250㎍의 楡根皮 추출물을 투여한 결과, 50㎍과 250㎍에서 종양 군집수가 각각 47.8±10.3개, 22.6±6.5개로 나타나 대조군의 85.0±11.5개에 비하여 통계적으로 유의하게 (p<0.01)감소하였다(Fig.1).
- 유근피 추출물의 Colon26-M3.1 carcinoma cell 전이 억제 효과를 NK cell 유무에 따라 알아본 결과 NK cell을 제거하지 않은 경우, 유근피 추출물 250㎍/㎖ 투여 시 전이된 종양의 개수는 14.8±4.7개로, 대조군의 41.8±12.3개에 비해 유의하게(p<0.05)감소하였다.
- 이상의 실험 결과에서 楡根皮는 암 전이 억제 효과를 지니고 있으며, 그 기전은 NK cell을 통한 면역 기능 활성화인것을 알 수 있었다. 楡根皮의 면역 활성, 항암 효과에 대한 연구 결과가 계속적으로 보고되고 있으므로 單方 혹은 복합처방의 형태로 효용성이 크다고 사료되며 임상에서의 실제적인 활용 및 추적 연구가 필요할 것으로 판단된다.
후속연구
- 이상의 실험 결과에서 楡根皮는 암 전이 억제 효과를 지니고 있으며, 그 기전은 NK cell을 통한 면역 기능 활성화인것을 알 수 있었다. 楡根皮의 면역 활성, 항암 효과에 대한 연구 결과가 계속적으로 보고되고 있으므로 單方 혹은 복합처방의 형태로 효용성이 크다고 사료되며 임상에서의 실제적인 활용 및 추적 연구가 필요할 것으로 판단된다.
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