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문제 정의
- 본 연구에서는 환경 중 수질시료에 대하여 설폰아미드계 항생제 5종, 아세틸화 대사체 4종 및 글루코로나이드 대사체 1종에 대한 분석방법을 확립하고, 한강 유역의 하수처리장 및 축산폐수처리장 방류수 시료 8건을 분석하여 실제시료에 대한 적용성을 평가하였다.
제안 방법
- 1. 환경 중 극미량 존재하는 설폰아미드계 항생제 및 대사체를 동시에 분석하기 위하여 HLB 카트리지를 사용한 추출방법과 액체크로마토그래피/텐덤질량분석기(LC/ESI-MS/MS)를 이용한 기기분석방법을 확립하였다.
- 3,11-14,16-20 본 연구에서는 다양한 카트리지의 추출효율을 비교하고, 실제 환경시료에서 추출 효율을 높이기 위해 시료의 pH을 조절하여 환경시료의 설폰아미드계 항생제와 대사체에 대한 동시분석 방법을 확립하였다. 또한 확립된 분석방법의 유효성 검증 및 실제 시료에 대한 적용성을 평가하였다.
- LC/ESI-MS/MS는 Thermo사 (San Jose, CA, USA)의 Thermo Finnigan Surveyor HPLC와 결합된 TSQ Quantum Ultra 탠덤 질량분석기를 사용하였다. 스캔모드에서 각 분석대상 물질의 질량 스펙트럼을 확인하여 선구 이온(precursor ion)을 선택하고, 최적의 생성이온(product ion) 조건을 확인한 후 선택반응모니터링(SRM) 방법을 사용하여 분석하였다.
- 설폰아미드계 항생제 및 대사체의 LC/ESI-MS/MS 분석조건은 Table 2와 같다. N1-glucuronide 대사체를 제외한 분석대상 설폰아미드계 항생제 및 대사체는 양이온 모드에서 분석하였고, N1-glucuronide 대사체인 sulfamethoxazole-N1-glucuronide 경우 음이온 모드에서 분석하였다.
- 각 분석대상 물질의 pH에 따른 카트리지와의 상호작용을 비교하기 위하여, 증류수 500 mL에 일정 농도의 표준용액을 희석한 후 3.5 M H2SO4와 1 M NaOH 를 사용하여 시료의 pH를 각각 3, 7, 10으로 만든 후 HLB 카트리지에서 시료의 pH에 따른 회수율을 비교하였다. 그 결과, 분석대상물질이 전하를 가지지 않는 pH 3(산성조건)에서 우수한 회수율(70~90%)을 확인할 수 있었다(Fig.
- 값을 고려한 카트리지의 선택이 회수율에 영향을 미친다. 따라서 본 연구에서는 효과적인 동시추출방법을 확립하기 위하여, 비극성 상호작용으로 중성형태의 분석대상물질을 흡착시키는 C18 카트리지, 친수성 및 친지질성 상호작용으로 분석대상물질을 흡착시키는 HLB 카트리지, 양이온 교환 메커니즘으로 양이온 형태의 분석대상물질을 흡착시키는 MCX 카트리지 및 HLB 카트리지와 MCX 카트리지를 연결한 탠덤카트리지 방법을 이용하여 Fig. 2와 같이 추출효율 비교실험을 수행하였다.3,11
- 3,11-14,16-20 본 연구에서는 다양한 카트리지의 추출효율을 비교하고, 실제 환경시료에서 추출 효율을 높이기 위해 시료의 pH을 조절하여 환경시료의 설폰아미드계 항생제와 대사체에 대한 동시분석 방법을 확립하였다. 또한 확립된 분석방법의 유효성 검증 및 실제 시료에 대한 적용성을 평가하였다. 분석 대상 설폰아미드계 항생제 및 대사체의 분자구조 및 특성은 Table 1과 같다.
- 본 연구에서 확립한 분석방법의 실제시료에 대한 적용성을 검토하기 위하여 한강 유역의 하수처리장 방류수 시료(A~G) 7건 및 축산폐수처리장 방류수 시료(H) 1건에 대한 설폰아미드계 항생제 및 대사체의 잔류농도를 조사하였다.
- 분석방법의 방법검출한계를 구하기 위하여 증류수 500 mL에 표준물질(기기검출한계의 10배 농도)을 첨가한 후 시료와 동일하게 7회 반복실험을 하였다. 측정값에 3.
- Sulfamethoxazole-N1-glucuronide의 경우, 카르복실기가 존재하기 때문에 양성자 1개가 분리된 [M-H]−가 유사 분자이온(pseudo-molecular ion)으로 생성되며, 그 외 분석대상물질의 경우 아민기에 양성자가 1개 첨가된 [M+H]+가 유사분자이온으로 이온화 되는 경향을 나타낸다. 스캔 모드에서 각 분석대상물질의 질량 스펙트럼을 확인하여 선구이온을 선택하고, 충돌에너지를 조절하여 최적의 생성이온 조건을 확인한 후 선택반응모니터링 방법을 사용하여 분석하였다. 정확한 정성 및 확인을 위해 3개의 특성이온을 선택하였으며, 그 중 감도가 가장 높은 이온을 정량이온으로 사용하였다.
- LC/ESI-MS/MS는 Thermo사 (San Jose, CA, USA)의 Thermo Finnigan Surveyor HPLC와 결합된 TSQ Quantum Ultra 탠덤 질량분석기를 사용하였다. 스캔모드에서 각 분석대상 물질의 질량 스펙트럼을 확인하여 선구 이온(precursor ion)을 선택하고, 최적의 생성이온(product ion) 조건을 확인한 후 선택반응모니터링(SRM) 방법을 사용하여 분석하였다. 설폰아미드계 항생제 및 대사체의 LC/ESI-MS/MS 분석조건은 Table 2와 같다.
- 시료 500 mL를 취하여 각 분석대상물질의 정제용 내부표준물질(sulfamethazine-13C6, N4-acetylsulfadiazine-d4, N4-acetylsulfamerazine-d4, N4-acetylsulfamethazine-d4, N4-acetylsulfamethoxazole-d4, N4-acetylsulfathiazole-d4) 250 ng을 첨가한 후, pH 3이 되도록 3.5 M 황산으로 조절하고 시료 특성에 따라 부유물질을 멤브레인 필터로 여과하였다. Oasis HLB (200 mg, 6 cc) 카트리지에 50 mM 개미산-메탄올 용액 3 mL, 50 mM 개미산-아세톤 용액 3 mL 및 5% 메탄올 수용액을 순차적으로 통과시켜 활성화하고, 시료를 10 mL/min의 속도로 적재하였다.
- 잔사에 100 ng의 내부 표준물질(terbutylazine-2-hydroxy)을 첨가하고 메탄올로 500 µL가 되도록 희석한 다음, 0.45 µm 실린지필터로 여과하였으며 2 mL 갈색 바이알에 옮겨 LC/ESI-MS/MS로 분석하였다.
- 절대 회수율(absolute recovery)은 증류수 500 mL에 표준물질의 농도가 0.5 ng/mL가 되도록 첨가한 후 본 연구에서 제시한 전처리를 거친 값과 시료 전처리를 거치지 않은 표준물질의 피이크 면적을 비교하여 구하였다. 분석 결과 회수율은 66%~115% 범위였으며, 상대표준편차(RSD)는 5~17%이었다.
- 스캔 모드에서 각 분석대상물질의 질량 스펙트럼을 확인하여 선구이온을 선택하고, 충돌에너지를 조절하여 최적의 생성이온 조건을 확인한 후 선택반응모니터링 방법을 사용하여 분석하였다. 정확한 정성 및 확인을 위해 3개의 특성이온을 선택하였으며, 그 중 감도가 가장 높은 이온을 정량이온으로 사용하였다.
- 환경시료 중 미량으로 존재하는 분석대상물질의 매질에 의한 방해 효과를 최소화하고 감도를 향상시키기 위하여 LC/ESI-MS/MS를 이용하여 분석하였다. Sulfamethoxazole-N1-glucuronide의 경우, 카르복실기가 존재하기 때문에 양성자 1개가 분리된 [M-H]−가 유사 분자이온(pseudo-molecular ion)으로 생성되며, 그 외 분석대상물질의 경우 아민기에 양성자가 1개 첨가된 [M+H]+가 유사분자이온으로 이온화 되는 경향을 나타낸다.
대상 데이터
- 대사체 N4-acetylsulfadiazine, N4-acetylsulfamerazine, N4-acetylsulfamethazine, N4-acetylsulfamethoxazole, sulfamethoxazole-N1-glucuronide와 정제용 내부표준물질인 N4-acetylsulfadiazine-d4, N4-acetylsulfamerazine-d4, N4- acetylsulfamethazine-d4, N4-acetylsulfamethoxazole-d4, sulfamethoxazole-N1-glucuronide-d4는 Toronto Research Chemicals사 (North York, Canada)에서 구입하여 사용하였으며, sulfamethazine-13C6은 Cambridge Isotope laboratories (Andover, MA, USA)제품을 사용하였다. 내부표준물질(ISTD)로 사용한 terbutylazine-2-hydroxy 는 Riedel-de Haen사(Seelze, Germany)의 고순도 시약을 사용하였다. 메탄올, 아세토니트릴, 증류수, 황산은 J.
- 분석대상 설폰아미드계 항생제인 sulfadiazine, sulfamerazine, sulfamethazine, sulfamethoxazole은 Sigma-Aldrich사 (St Louis, MO, USA), sulfathiazole은 Riedel-de Haen사 (Seelze, Germany)의 제품을 사용하였다. 대사체 N4-acetylsulfadiazine, N4-acetylsulfamerazine, N4-acetylsulfamethazine, N4-acetylsulfamethoxazole, sulfamethoxazole-N1-glucuronide와 정제용 내부표준물질인 N4-acetylsulfadiazine-d4, N4-acetylsulfamerazine-d4, N4- acetylsulfamethazine-d4, N4-acetylsulfamethoxazole-d4, sulfamethoxazole-N1-glucuronide-d4는 Toronto Research Chemicals사 (North York, Canada)에서 구입하여 사용하였으며, sulfamethazine-13C6은 Cambridge Isotope laboratories (Andover, MA, USA)제품을 사용하였다. 내부표준물질(ISTD)로 사용한 terbutylazine-2-hydroxy 는 Riedel-de Haen사(Seelze, Germany)의 고순도 시약을 사용하였다.
- 내부표준물질(ISTD)로 사용한 terbutylazine-2-hydroxy 는 Riedel-de Haen사(Seelze, Germany)의 고순도 시약을 사용하였다. 메탄올, 아세토니트릴, 증류수, 황산은 J.T. Baker사(NJ, USA)의 HPLC 등급 시약을 사용하였으며, 개미산(formic acid)과 암모니아수(25%)는 Sigma-Aldrich사(St Louis, MO, USA)의 제품을 사용하였다. 표준물질과 내부표준물질은 메탄올을 이용하여 1 mg/mL의 농도로 만든 후 -20℃ 냉장고에 저장하였고, 실험시 필요한 농도를 메탄올로 희석하여 사용하였다.
- 분석대상 설폰아미드계 항생제인 sulfadiazine, sulfamerazine, sulfamethazine, sulfamethoxazole은 Sigma-Aldrich사 (St Louis, MO, USA), sulfathiazole은 Riedel-de Haen사 (Seelze, Germany)의 제품을 사용하였다. 대사체 N4-acetylsulfadiazine, N4-acetylsulfamerazine, N4-acetylsulfamethazine, N4-acetylsulfamethoxazole, sulfamethoxazole-N1-glucuronide와 정제용 내부표준물질인 N4-acetylsulfadiazine-d4, N4-acetylsulfamerazine-d4, N4- acetylsulfamethazine-d4, N4-acetylsulfamethoxazole-d4, sulfamethoxazole-N1-glucuronide-d4는 Toronto Research Chemicals사 (North York, Canada)에서 구입하여 사용하였으며, sulfamethazine-13C6은 Cambridge Isotope laboratories (Andover, MA, USA)제품을 사용하였다.
- 추출에 사용한 Oasis HLB (200 mg, 6 cc), Oasis MCX (150 mg, 6 cc), Se-pak C18 카트리지는 Waters사(Milford, MA, USA)에서 구입하여 사용하였고, 카트리지 매니폴더는 Supelco사(Bellefonte, PA, USA)의 제품을 사용하였다.
성능/효과
- 2. 본 연구에서 제안된 분석방법에 대한 유효성 확인 실험 결과, 방법검출한계(MDL)은 0.0009~0.187µg/L의 범위였으며, 회수율은 66~115%, 상대표준편차와 정확도는 각각 20%이내 및 ±10% 이내로 관찰되었다.
- 3. 실제시료분석을 통한 분석방법의 적용성 검토를 위하여 하수처리장 및 축산폐수처리장 방류수 8개를 분석한 결과 4종의 설폰아미드계 항생제와 1종의 대사체가 관찰되었으며, 대사체는 흔적량으로 검출되었다.
- -glucuronide 대사체의 회수율이 25%로 동시분석에 적합하지 않은 것으로 판단된다. HLB 카트리지와 텐덤(HLB+MCX) 카트리지 방법 모두 회수율은 60~90% 범위였으나, 실험에 소요되는 시간, 카트리지 및 용매 사용량 등을 종합적으로 고려하였을 때, HLB 카트리지를 이용한 추출과정이 더 효율적인 것으로 판단된다(Fig. 3).
- 각 카트리지별 회수율 실험결과 C18 카트리지를 사용하였을 경우 대부분의 분석대상물질이 낮은 회수율을 나타냈으며, MCX 카트리지의 경우 N1-glucuronide 대사체의 회수율이 25%로 동시분석에 적합하지 않은 것으로 판단된다. HLB 카트리지와 텐덤(HLB+MCX) 카트리지 방법 모두 회수율은 60~90% 범위였으나, 실험에 소요되는 시간, 카트리지 및 용매 사용량 등을 종합적으로 고려하였을 때, HLB 카트리지를 이용한 추출과정이 더 효율적인 것으로 판단된다(Fig.
- 5 M H2SO4와 1 M NaOH 를 사용하여 시료의 pH를 각각 3, 7, 10으로 만든 후 HLB 카트리지에서 시료의 pH에 따른 회수율을 비교하였다. 그 결과, 분석대상물질이 전하를 가지지 않는 pH 3(산성조건)에서 우수한 회수율(70~90%)을 확인할 수 있었다(Fig. 4). 이러한 결과는 pKa1 값이 1.
- 또한, 동일 농도에서 Bias ((Bias=(참값−측정값/참값)×100%)를 측정한 결과 정확도는 ±10%범위였다.
- 5 ng/mL가 되도록 첨가한 후 본 연구에서 제시한 전처리를 거친 값과 시료 전처리를 거치지 않은 표준물질의 피이크 면적을 비교하여 구하였다. 분석 결과 회수율은 66%~115% 범위였으며, 상대표준편차(RSD)는 5~17%이었다. 또한, 동일 농도에서 Bias ((Bias=(참값−측정값/참값)×100%)를 측정한 결과 정확도는 ±10%범위였다.
- 총 5종의 설폰아미드계 항생제 중에서 4종이 검출되었으며, 검출된 시료의 농도범위는 0.008~2.153 ng/mL이었다. Sulfathiazole의 경우 축산폐수처리장 방류수에서 2.
후속연구
- 4. 아울러, 본 연구에서 정립한 설폰아미드계 항생제 및 대사체 분석방법은 환경 중 잔류 농도 모니터링과 대상물질의 거동 및 영향 조사에 활용될 수 있을 것으로 생각된다.
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