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문제 정의
- 정확한 기원종 분류와 우수한 효능의 종 확인을 위해 비교가 필요하다. 따라서 본 연구에서는 掌葉大黃과 藥用大黃, 同屬近緣種인 高山大黃 (Rheum nobile Hook. f. et Thoms.)과 華北大黃(Rheum franzenbachii Muent.)의 항혈전 효능을 비교하기 위하여 혈전 반응에 대한 掌葉大黃(RPE), 藥用大黃(ROE), 高山大黃 (RNE), 華北大黃(RFE)의 물 추출물의 활성 비교 연구를 진행하였다. 이를 위해 혈전 용해 활성, 혈액 응고시간 지연효과, 혈소판 응집억제 활성 등에 대한 RPE, ROE, RNE, RFE의 항혈전 효능을 평가하였다.
- 이러한 성질을 가지는 protease를 혈전증 치료의 목적으로 장기간 또는 다량으로 사용할 경우에는 혈관벽이나 혈액성분 등 다른 단백질을 함께 용해하기 때문에 매우 심각한 부작용을 초래할 수 있다4-7). 따라서 본 연구에서는 항혈전 효능 검증을 하고자, 혈전 용해 활성을 검색하는 가장 기본적인 실험 방법인 fibrin plate법을 이용하여 fibrin의 용해 활성을 조사하였다. 다음으로 혈액 응고 cascade에 미치는 영향을 알아보기 위해 외인성 응고계의 PT와 내인성 응고계의 aPTT를 측정하여 지연 효과를 조사하였다.
- 시료의 혈액 응고 시간 지연 및 단축 효과를 확인하고자 시료가 aPTT와 PT에 미치는 영향을 조사하였다. 혈액응고 억제 활성 중 내인성 경로(intrinsic pathway)에 기인하는 활성트롬빈 플라스틴 시간 aPTT와 외인성 경로(extrinsic pathway)에 기인하는 프로트롬빈 시간 PT를 자동혈액응고 분석기 ACL-7000(Instrumentation Laboratory, Milano, Italy)를 사용하여 측정하였다.
제안 방법
- 혈액응고 억제 활성 중 내인성 경로(intrinsic pathway)에 기인하는 활성트롬빈 플라스틴 시간 aPTT와 외인성 경로(extrinsic pathway)에 기인하는 프로트롬빈 시간 PT를 자동혈액응고 분석기 ACL-7000(Instrumentation Laboratory, Milano, Italy)를 사용하여 측정하였다. SD rat을 원심분리 하여 얻은 platelet poor plasma(PPP)와 시료를 정해진 농도로 3:1의 비율로 섞어 37℃에서 5분간 미리 incubation 한 후 자동 혈액 응고 분석기와 ACL-assay reagent kit를 이용하여 시약과 반응시켜 응고될 때까지의 혈액 응고 시간을 측정하였다. 양성대조군으로는 PT는 heparin 11.
- 본 실험에 사용한 掌葉大黃, 藥用大黃, 高山大黃, 華北大黃은中國 甘肅와 四川에서 구입하여 한국한의학연구원 한약자원연구센터에서 검정하고 정선한 것을 사용하였다. 각각의 약재 200g 에 5배량의 물을 가한 다음 2시간씩 2회 환류 냉각 추출하여 여과한 후 농축하고 동결건조하여 그 분말을 얻었다. 시료의 농도는 동결 건조 분말의 중량을 기준으로 표시하였다.
- 華北大黃은 波葉大黃의 뿌리줄기로 瀉下力이 없는 大黃으로 나타나있다 11, 20). 그러므로 大黃 정품과 大黃 유사종간의 약리학적 차이를 과학적으로 증명할 필요가 있으며, 이에 본 연구에서는 大黃과 大黃 유사종 간의 항혈전 효과를 조사하여 掌葉大黃, 藥用大黃, 高山大黃, 華北大黃이 혈전반응에 미치는 영향에 대해 여러 실험을 통해 그 차이를 비교하였다. 본 연구에서는 掌葉大黃, 藥用大黃, 高山大黃, 華北大黃이 혈전용해, 응고시간(PT, aPTT), 혈소판 응집능 실험에서 응고시간을 측정하는 실험을 진행하였다21-22).
- 따라서 본 연구에서는 항혈전 효능 검증을 하고자, 혈전 용해 활성을 검색하는 가장 기본적인 실험 방법인 fibrin plate법을 이용하여 fibrin의 용해 활성을 조사하였다. 다음으로 혈액 응고 cascade에 미치는 영향을 알아보기 위해 외인성 응고계의 PT와 내인성 응고계의 aPTT를 측정하여 지연 효과를 조사하였다. 마지막으로 혈소판 응집에 대한 작용을 살펴보기 위해 혈소판 응집 억제 활성을 분석하였다.
- 다음으로 혈액 응고 cascade에 미치는 영향을 알아보기 위해 외인성 응고계의 PT와 내인성 응고계의 aPTT를 측정하여 지연 효과를 조사하였다. 마지막으로 혈소판 응집에 대한 작용을 살펴보기 위해 혈소판 응집 억제 활성을 분석하였다.
- 물과 사료는 자유롭게 섭취하도록 하였고 사육장 실내의 온도는 22±2℃, 습도는 50±10%, 조명은 12시간 명/암 주기가 되도록 조절하였다.
- 그러므로 大黃 정품과 大黃 유사종간의 약리학적 차이를 과학적으로 증명할 필요가 있으며, 이에 본 연구에서는 大黃과 大黃 유사종 간의 항혈전 효과를 조사하여 掌葉大黃, 藥用大黃, 高山大黃, 華北大黃이 혈전반응에 미치는 영향에 대해 여러 실험을 통해 그 차이를 비교하였다. 본 연구에서는 掌葉大黃, 藥用大黃, 高山大黃, 華北大黃이 혈전용해, 응고시간(PT, aPTT), 혈소판 응집능 실험에서 응고시간을 측정하는 실험을 진행하였다21-22). 이 중 PT를 제외하고는 공통적으로 4종의 大黃류에서 대조군과 비교하여 효과를 나타냄을 알 수 있었다.
- SD rat을 원심분리 하여 얻은 platelet poor plasma(PPP)와 시료를 정해진 농도로 3:1의 비율로 섞어 37℃에서 5분간 미리 incubation 한 후 자동 혈액 응고 분석기와 ACL-assay reagent kit를 이용하여 시약과 반응시켜 응고될 때까지의 혈액 응고 시간을 측정하였다. 양성대조군으로는 PT는 heparin 11.2 ㎍/ml, aPTT는 heparin 1.4 ㎍/ml와 비교하였다.
- 5 ㎕에 녹인 thrombin 용액 50 NIH units를 30분 이상 상온에 방치하여 고화시켰다. 양성대조군으로는 직경6 mm filter paper disc에 20% DMSO 10 ㎕에 2 ㎍, 1㎍, 0.5 ㎍의 plasmin을 각각 녹여 점적하여 fibrin plate 상에 놓고, 20% DMSO 50㎕에 약재시료 10 mg 녹인 것을 점적하여 사용하였으며, 37℃에서 15시간 동안 반응시킨 후 fibrin plate가 용해되어 형성된 투명환의 넓이를 측정하여 비교하였다.
- )의 항혈전 효능을 비교하기 위하여 혈전 반응에 대한 掌葉大黃(RPE), 藥用大黃(ROE), 高山大黃 (RNE), 華北大黃(RFE)의 물 추출물의 활성 비교 연구를 진행하였다. 이를 위해 혈전 용해 활성, 혈액 응고시간 지연효과, 혈소판 응집억제 활성 등에 대한 RPE, ROE, RNE, RFE의 항혈전 효능을 평가하였다.
- 2분 정도 baseline을 확인 후, 혈소판응집 촉진물질을 일정량 넣고 1200 rpm으로 교반하면서 37℃에서 최대 10분간 측정하였다. 혈소판 응집촉진물질은 ADP를 첨가하여 응집을 유도하였고, 대조군에 대한 응집억제 정도를 비교하였다.
- 시료의 혈액 응고 시간 지연 및 단축 효과를 확인하고자 시료가 aPTT와 PT에 미치는 영향을 조사하였다. 혈액응고 억제 활성 중 내인성 경로(intrinsic pathway)에 기인하는 활성트롬빈 플라스틴 시간 aPTT와 외인성 경로(extrinsic pathway)에 기인하는 프로트롬빈 시간 PT를 자동혈액응고 분석기 ACL-7000(Instrumentation Laboratory, Milano, Italy)를 사용하여 측정하였다. SD rat을 원심분리 하여 얻은 platelet poor plasma(PPP)와 시료를 정해진 농도로 3:1의 비율로 섞어 37℃에서 5분간 미리 incubation 한 후 자동 혈액 응고 분석기와 ACL-assay reagent kit를 이용하여 시약과 반응시켜 응고될 때까지의 혈액 응고 시간을 측정하였다.
대상 데이터
- 시료의 농도는 동결 건조 분말의 중량을 기준으로 표시하였다. 각각 실험에 사용된 시료는 혈전용해 20% dimethyl sulfoxide(DMSO, Sigma, Louis, MO, USA), PT와 APTT는 10% DMSO, 혈소판응집 5% DMSO에 녹여 실험에 사용하였다.
- 본 실험에 사용한 掌葉大黃, 藥用大黃, 高山大黃, 華北大黃은中國 甘肅와 四川에서 구입하여 한국한의학연구원 한약자원연구센터에서 검정하고 정선한 것을 사용하였다. 각각의 약재 200g 에 5배량의 물을 가한 다음 2시간씩 2회 환류 냉각 추출하여 여과한 후 농축하고 동결건조하여 그 분말을 얻었다.
- 실험에 사용한 8주령의 수컷 Spague-Dewley(SD) rat은(주)오리엔트바이오에서 구입하여 1주 이상 본 실험 사육장 환경에 적응시킨 후 사용하였다. 물과 사료는 자유롭게 섭취하도록 하였고 사육장 실내의 온도는 22±2℃, 습도는 50±10%, 조명은 12시간 명/암 주기가 되도록 조절하였다.
- 응고타임 실험에 사용된 혈액은 수컷 SD-rat을 동물사육실에서 1주일간 순화시킨 다음 ethyl ether로 마취하고, 항응고제 0.15 M sodium citrate(Vacutainer, Becton dicknson, UK)를 혈액과 1:9(v/v)의 비율이 되도록 주사기로 복대동맥으로부터 채혈하였다. Low speed centrifuge (Gyrozen, Incheon, Korea) 1000rpm에서 10분간 원심분리하여 상등액의 platelet rich plasma(PRP)는 버리고, 계속하여 3000rpm에서 10분간 원심분리하여 platelet poor plasma(PPP)를 얻어 실험에 사용하였다.
- 4)은 Gibco(Newyork, USA)에서 구입하였다. 응고타임에 사용된 calibration plasma, normal control, low abnormal control, PT-fibrinogen HS, SynthASil, calcium chloride 0.020 M, reference emulsion 시약은 Instrumentation Laboratory(Milano, Italy)로부터 구입하여 사용하였다. 혈소판응집 유발물질인 adenosine diphosphate(ADP)는 Chrono-Log(Havertown, USA)의 제품을 사용하였다.
- 혈소판 응집실험에 사용된 혈액은 수컷 SD-rat을 동물사육실에서 1주일간 순화시킨 다음 경동맥만 분리하여 polyethylene tube(Becton dicknson, UK)를 삽입해서 heparin coated tube(Green vac tube, Standardplus & medical Co., Ltd, St. Ingberg, Germany)로 옮겨 혈액을 담아 전혈을 사용하였다.
- 020 M, reference emulsion 시약은 Instrumentation Laboratory(Milano, Italy)로부터 구입하여 사용하였다. 혈소판응집 유발물질인 adenosine diphosphate(ADP)는 Chrono-Log(Havertown, USA)의 제품을 사용하였다.
- 혈전용해 실험에 사용한 시약은 fibrinogen from human plasma, thrombin from human plasma, plasmin from human plasma를 Sigma(Louis, MO, USA)에서 구입하였고, phosphate-bufffered saline(PBS, pH 7.4)은 Gibco(Newyork, USA)에서 구입하였다. 응고타임에 사용된 calibration plasma, normal control, low abnormal control, PT-fibrinogen HS, SynthASil, calcium chloride 0.
데이터처리
- 각 실험군 간의 차이는 Microsoft Office Excel의 Student's t-test를 사용하여 통계학적 분석을 수행하였으며, p < 0.05 값인 경우에 통계적으로 유의성이 있는 것으로 판정하였다.
- 모든 측정 결과는 3반복 이상의 독립적인 실험에서 도출된 대표값의 평균(mean)과 표준편차(standard deviation; SD)로 나타내었다. 각 실험군 간의 차이는 Microsoft Office Excel의 Student's t-test를 사용하여 통계학적 분석을 수행하였으며, p < 0.
성능/효과
- 2. 혈액 응고 시간 지연 및 단축 효과를 조사한 결과 高山大黃이 혈액 응고시간 지연효과가 가장 우수하였다. 高山大黃이 혈액이 응고되는 시간을 가장 많이 지연시켜 항혈전 효과를 나타내었다.
- 3. 혈소판의 응집에 따라 형성되는 두 전극 사이에 형성된 전기적 저항으로 혈소판 응집 억제능 실험을 시행한 결과 大黃 4종 모두 매우 뛰어난 응집억제 활성을 보여, 혈소판 응집을 억제하는데 있어서 大黃이 효과가 좋다는 것을 알수 있었다.
- 2에서 나타난 것처럼 PT의 경우 RPE, ROE, RFE는 각각 97%, 96%, 97%로 대조군보다 단축효과를 보였으며, RNE는 138%로 혈액 응고시간 지연효과가 가장 우수하였다. aPTT의 경우 Fig.3에서 나타난 것처럼 RPE, ROE, RFE는 각각 113%, 162%, 173%로 대조군보다 우수한 지연효과를 보였고, RNE은 483%로 가장 뛰어난 지연 활성을 보였다.
- 이상의 연구결과를 요약하면, 본 연구에 사용된 大黃 2종 약전수재종인 掌葉大黃, 藥用大黃과 유사종인 高山大黃, 華北大黃 중에서, 高山大黃이 탁월하게 혈전을 용해하며 응고시간 지연효과를 나타냈으며, 혈소판응집 억제능도 가장 뛰어난 것으로 나타났다. 현재 결과에서는 언급되지 않았지만 진행 중인 in vivo상에서 경구투여 500mg/ml의 농도로 진행해보았을 때 유의한 결과가 도출되었다26).
- 이와 같은 결과들을 바탕으로 본 연구에서는 大黃 4종을 비교하였을 때 高山大黃 물 추출물은 높은 항혈전 효과를 나타내었다. 이에 高山大黃 물 추출물은 혈전기작으로 인하여 생기는 많은 질환의 예방과 치료에 효과적으로 적용할 수 있을 것으로 사료된다.
- 혈소판의 응집에 따라 형성되는 두 전극 사이에 형성된 전기적 저항의 변화로 나타나는 혈소판 응집 억제능 실험을 시행한 결과 RPE, ROE, RNE, RFE가 Fig.4에 나타났듯이 각각 100%, 94%, 100%, 95%로 매우 뛰어난 응집억제 활성을 보였다.
- 혈액 응고 시간 지연 및 단축 효과를 확인하고자 RPE, ROE, RNE, RFE가 aPTT와 PT에 미치는 영향을 조사한 결과 Fig.2에서 나타난 것처럼 PT의 경우 RPE, ROE, RFE는 각각 97%, 96%, 97%로 대조군보다 단축효과를 보였으며, RNE는 138%로 혈액 응고시간 지연효과가 가장 우수하였다. aPTT의 경우 Fig.
- 혈전용해도 측정에 대해 RPE, ROE, RNE, RFE를 10 mg/ml로 처리하여 15시간 후 fibrin plate가 용해되어 형성된 투명환의 넓이를 측정하는 실험을 진행한 결과 Fig.1에서 나타난 것처럼 RPE, ROE, RNE, RFE가 각각 2.95 mm², 6.14 mm², 12.99 mm², 2.38 mm²로 대조군과 비교하여 RNE의 혈전용해도가 다른 RPE, ROE, RFE 3가지 추출물과 비교하였을 때 탁월한 효능을 나타냄을 알 수 있다.
- 1. 혈전용해도에 대해 高山大黃의 혈전용해도가 다른 3가지 추출물과 비교하였을 때 탁월한 효능을 나타냄을 알 수 있다.
후속연구
- 현재 결과에서는 언급되지 않았지만 진행 중인 in vivo상에서 경구투여 500mg/ml의 농도로 진행해보았을 때 유의한 결과가 도출되었다26). 따라서 高山大黃은 향후 혈전 질환의 치료제 개발에 효과적으로 이용될 수 있을 것이다. 이를 바탕으로 하여 향후 동물모델에서의 심도있는 효능 연구와 관련 작용기전에 대한 체계적인 연구, 구성성분의 분석 및 함량 분석을 토대로 한 유효성분 도출 연구 등이 필요하며, 각 추출물들의 적정 용량 산정 및 최적의 투여방법 개발, 안전성 평가 등의 연구도 지속적으로 이루어져야 할 것으로 사료된다.
- 이를 더욱 명확히 하기 위해서는 大黃 약전수재종과 高山大黃을 포함한 大黃 유사종간의 성분 비교 연구가 필요할 것으로 보인다. 또한 高山大黃의 항혈전 효과에 대한 작용기전과 항혈전 효과를 나타내는 유효 성분에 대한 추가적인 연구가 이루어져야할 것으로 사료된다.
- 그러나 大黃 유사종의 stilbenes 성분에는 차이가 있는 것처럼23), 그 성분 차이에 의해 大黃 유사종간에 항혈전 효과가 다르게 나타날 것으로 보인다. 이를 더욱 명확히 하기 위해서는 大黃 약전수재종과 高山大黃을 포함한 大黃 유사종간의 성분 비교 연구가 필요할 것으로 보인다. 또한 高山大黃의 항혈전 효과에 대한 작용기전과 항혈전 효과를 나타내는 유효 성분에 대한 추가적인 연구가 이루어져야할 것으로 사료된다.
- 따라서 高山大黃은 향후 혈전 질환의 치료제 개발에 효과적으로 이용될 수 있을 것이다. 이를 바탕으로 하여 향후 동물모델에서의 심도있는 효능 연구와 관련 작용기전에 대한 체계적인 연구, 구성성분의 분석 및 함량 분석을 토대로 한 유효성분 도출 연구 등이 필요하며, 각 추출물들의 적정 용량 산정 및 최적의 투여방법 개발, 안전성 평가 등의 연구도 지속적으로 이루어져야 할 것으로 사료된다.
- 이와 같은 결과들을 바탕으로 본 연구에서는 大黃 4종을 비교하였을 때 高山大黃 물 추출물은 높은 항혈전 효과를 나타내었다. 이에 高山大黃 물 추출물은 혈전기작으로 인하여 생기는 많은 질환의 예방과 치료에 효과적으로 적용할 수 있을 것으로 사료된다.
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