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문제 정의
- 본 연구에서는 天麻 에탄올추출물이 腦組織出血에 의한 뇌부종에 미치는 영향을 관찰함과 아울러 뇌부종 형성에 관여하는 주요인자인 AQPs 발현에 대한 영향을 관찰하고자 하였다. 腦組織出血은 실험동물의 뇌 선조체 (striatum) 내에 콜라겐 분해효소 (collagenase)를 주사하는 방법으로 유발하였고, 天麻 에탄올추출물을 경구투여한 후 뇌부종과 뇌조직 수분함량, 신경세포의 세포부종에 대한 영향을 관찰하였으며, 뇌부종 발생에 관여하는 인자인 AQP4, AQP1 및 AQP9 발현의 변화를 면역조직화학염색으로 관찰한 바 유의한 결과를 얻어 이에 보고하는 바이다.
- 이러한 신경세포 및 뇌손상에 대한 다양한 in vitro 및 in vivo 연구를 통하여 天麻의 신경세포 보호효능이 연구 보고되었지만 뇌출혈에 대한 연구보고는 없었다. 그러므로 본 연구에서는 天麻 에탄올추출물이 腦組織出血에 의한 뇌부종에 미치는 영향을 관찰함과 아울러 뇌부종 형성에 관여하는 주요인자로서 water channel인 AQPs 발현에 대한 영향을 관찰하고자 하였다.
- 본 연구에서는 天麻 에탄올추출물이 腦組織出血에 의한 뇌부종에 미치는 영향을 관찰함과 아울러 뇌부종 형성에 관여하는 주요인자인 AQPs 발현에 대한 영향을 관찰하고자 하였다. 腦組織出血은 실험동물의 뇌 선조체 (striatum) 내에 콜라겐 분해효소 (collagenase)를 주사하는 방법으로 유발하였고, 天麻 에탄올추출물을 경구투여한 후 뇌부종과 뇌조직 수분함량, 신경세포의 세포부종에 대한 영향을 관찰하였으며, 뇌부종 발생에 관여하는 인자인 AQP4, AQP1 및 AQP9 발현의 변화를 면역조직화학염색으로 관찰한 바 유의한 결과를 얻어 이에 보고하는 바이다.
- AQP4-null mice는 저나트륨 혈증 (hyponatremia)으로 인한 뇌부종이 감소되어 사망률이 낮아지는 것과 국소뇌허혈과 세균성 뇌막염에서 세포독성 뇌부종이 억제되는 것을 보고한 연구들을 통하여 AQP4가 BBB의 투과성을 항진시키고 뇌실질 내로 수분이동을 증가시키는 작용을 하며 세포독성 부종에 관여한다는 것이 밝혀졌다37). 이러한 결과들에 의하여 AQP4 발현 억제제가 세포독성 뇌부종 치료제 개발의 목표가 되었다. 한편으로 AQP4-null mice에서 세포간질액 (interstitial fluid)이 과도하게 증가한 혈관성 부종의 경우 세포간질액의 제거가 지연된다는 연구보고들을 통하여 AQP4 발현 활성제는 혈관성 뇌부종을 억제하는 작용을 할 것으로 추정된다39).
제안 방법
- AQP4, AQP1 및 AQP9 발현의 측정을 위한 영상분석 및 측정방법은 위의 신경세포 크기 측정 7-2와 동일한 과정으로, hematoma 주변부와 대뇌피질 및 외포 (external capsule)의 동일한 일정면적 (105 μ m2) 내에서 ImageJ software (ver. 1.41)를 사용하여 양성반응을 나타낸 면적의 비율을 측정하여 자료로 사용하였다.
- AQP4와 GFAP 및 AQP4와 Lectin의 이중 면역형광염색을 위하여 조직처리 및 기본적인 면역조직화학 염색방법은 위의 기술과 동일하며, primary antibody로 anti-rabbit AQP4 1:200 (SC-20812, SantaCruz, USA), anti-mouse GFAP 1:100 (G3893, Sigma-Aldrich, USA) 및 FITCconjugated tomato lectin 1:100 (L0401, Sigma-Aldrich, USA)를 사용하였다. Secondary antibody는 AQP4에 대하여 Cy5-conjugated goat anti- rabbit 1:200 (ab6564, abcam, UK)를, GFAP에 대하여는 FITC-conjugated goat anti-mouse 1:100 (ab6785, abcam, UK)을 사용하였다.
- Cresyl violet 염색된 뇌조직의 영상을 광학현미경 (BX51, Olympus, Japan)에 장착된 CCD camera (DP70, Olympus, Japan)를 통하여 영상분석시스템에 저장하고, ImageJ software (ver. 1.41)를 사용하여 신경세포의 크기를 측정하였다. 그 영상분석 과정을 간단히 기술하면 다음과 같다.
- 뇌조직은 cryocut으로 20 μ m 두께의 관상절편으로 제작하여 염색에 사용하였다. Cresyl violet 염색은 뇌조직을 실온에서 1.0 % (w/v) cresyl violet acetate 용액에 2분간 염색하고, 농도별 ethanol 용액으로 탈수한 다음 봉입하여 조직표본을 제작하였다.
- 그 영상분석 과정을 간단히 기술하면 다음과 같다. ImageJ에서 측정 대상의 영상을 불러온 다음 영상을 8-bit의 흑백영상으로 변환하고 적정의 grey level threshold를 입력하여 흑백영상으로부터 threshold 값 이상의 optical density를 나타내는 신경세포 area를 결정하였다. 선정된 pixel들이 구성하는 area 중 300 μm2 이상과 30 μ m2이하의 area들 즉, 신경세포 이외의 불필요한 area들을 제거하고, 각각의 pixel area를 측정하였다.
- 天麻가 腦組織出血의 뇌부종과 뇌부종 생성의 주요인자인 aquaporin 발현에 미치는 영향을 관찰하기 위하여, 실험동물의 뇌 내에 collagenase를 주입하여 腦組織出血에 의한 뇌부종을 유발하고, 天麻 에탄올추출물을 경구투여한 후 뇌부종과 뇌조직 수분함량, 신경세포의 세포부종 등에 대한 영향을 관찰하였으며, 뇌부종 발생에 관여하는 인자인 AQP4, AQP1 및 AQP9 발현의 변화를 면역조직화학염색으로 관찰하여 다음과 같은 결과를 얻었다.
- 腦組織出血 유발과 天麻 에탄올추출물 투여 3일 후에 실험동물을 pentobarbital sodium의 복강주사로 깊게 마취한 다음 개흉하고 심장을 통하여 0.05 M phosphate buffered saline (PBS)과 4 % paraformaldehyde로 충분히 관류하였다. 이후 뇌를 적출한 다음 24시간 정도 post-fixation하고, sucrose 용액에 담가 침전시켰다.
- 腦組織出血 유발과 天麻 에탄올추출물 투여 3일후에 실험동물을 과용량의 pentobarbital sodium 복강주사로 희생시킨 후 즉시 단두하고 뇌를 적출한 다음 뇌로부터 소뇌와 뇌간을 제거하고 정중선을 따라 정상측과 ICH유발측 대뇌반구를 분리하였다. 腦組織出血이 유발된 대뇌반구의 무게를 전자저울로 측정하고, 120 ℃의 mechanical convection oven (DMC121, Daeil Engineering Co.
- 腦組織出血 유발을 위한 수술과정은 electronic temperature controller (CMA150, CMA, Sweden)를 통하여 정상체온 (37±0.5 ℃)이 유지되는 상태에서, 2 % isoflurane을 포함한 70 % N2O와 30 % O2 gas의 흡입마취 하에서 이루어졌으며, 필요한 경우 추가적으로 pentobarbital sodium (50 mg/kg)을 복강주사 하였다.
- 腦組織出血 유발과 天麻 에탄올추출물 투여 3일후에 실험동물을 과용량의 pentobarbital sodium 복강주사로 희생시킨 후 즉시 단두하고 뇌를 적출한 다음 뇌로부터 소뇌와 뇌간을 제거하고 정중선을 따라 정상측과 ICH유발측 대뇌반구를 분리하였다. 腦組織出血이 유발된 대뇌반구의 무게를 전자저울로 측정하고, 120 ℃의 mechanical convection oven (DMC121, Daeil Engineering Co., Korea)에서 24시간 동안 건조한 다음 건조중량을 측정하여 그 무게 차이의 비율을 수분함량 자료로 사용하였다.
- 마취와 두정부의 피부절개 및 두개골의 천공 과정은 시행하였으나 뇌조직 내에 collagenase를 주입하지 않은 정상대조군 (Sham)과 위의 과정과 같은 사전준비 수술에 이어 뇌 선조체에 collagenase를 주입하여 腦組織出血을 유발한 대조군 (ICH) 및 대조군과 같이 腦組織出血을 유발한 다음 3일간 天麻 에탄올추출물을 경구투여한 天麻투여군 (ICH+GR)으로 나누었다. 각 군의 실험동물은 각각 18마리씩 총 54마리로, 뇌부종 측정과 뇌조직 수분함량 측정 및 뇌조직의 면역조직화학염색용으로 사용하였다.
- 그러므로 본 연구결과에서 腦組織出血에 의한 뇌부종과 뇌조직 수분함량을 유의하게 감소시키고, 대뇌피질 신경세포의 세포독성 부종을 억제하는 효능을 나타낸 天麻가 AQP4 및 AQP1, AQP9 발현에는 어떠한 영향을 미치는지 면역조직화학염색을 통하여 관찰하였다. 그 결과, 腦組織出血이 유발된 대뇌반구에서 hematoma 주변부의 혈관 근처에서 강한 AQP4 양성반응을 나타내는 세포들이 많이 관찰되었으며, 대뇌피질에서도 혈관 주위에 강한 AQP4 양성반응이 관찰되었다.
- 다음 3,3'-diaminobenzidine tetrachloride (DAB, Sigma-Aldrich, USA)에서 1-2분간 발색 반응시키고, 수세한 다음 탈수, 봉입하여 조직표본을 제작하였다.
- Primary antibody는 anti-AQP4 1:500 (SC-20812, SantaCruz, USA), anti-AQP1 1:500 (SC-20810, SantaCruz, USA) 및 anti-AQP9 1:500 (AQP91-A, ADI, USA)를 사용하였으며, PBS와 Triton X-100을 섞은 용액으로 희석한 후 4 ℃에서 overnight으로 반응시켰다. 다음 biotinylated anti-rabbit secondary antibody 1:200 (Vector Labolatories, USA)에 실온에서 1시간동안 반응시키고, 조직을 PBS로 씻어내고, abidin-biotin immuno-peroxidase의 방법 (ABC Vectastain Kit)에 따라 각각 1시간씩 반응시켰다. 다음 3,3'-diaminobenzidine tetrachloride (DAB, Sigma-Aldrich, USA)에서 1-2분간 발색 반응시키고, 수세한 다음 탈수, 봉입하여 조직표본을 제작하였다.
- 두개골의 bregma로부터 전방으로 0.2 mm, 외측으로 3.5 mm 위치에 전기드릴을 사용하여 약 1 mm 직경의 두개골 천공을 만들고, 뇌정위고정장치에 장착된 hamilton 주사기 (26-gauge, 10 μ l, Hamilton, USA)를 뇌경막 (dura mater)으로부터 5.5 mm 깊이로 선조체에 삽입하였다.
- 또한 腦組織出血의 유발 방법에서 hematoma가 선조체 내에 생성되도록 collagenase를 주입하였으므로, 혈관성 부종이 유발되는 선조체의 hematoma 주변부와 세포독성 부종이 일어나는 대뇌피질에서 각각 신경세포의 크기를 관찰하였다. 그 결과, 腦組織出血에 의하여 hematoma 주변부의 신경세포는 Sham군에 비하여 약 14.
- 이러한 결과는 앞의 결과와 일치하게, 天麻는 BBB 손상에 의한 혈관성 부종에는 유의하지 못하지만, AQP4 발현을 억제하는 작용에 의하여 세포독성 부종을 유의하게 억제하는 효능이 있음을 재확인 하는 결과이다. 또한 본 연구를 통하여 혈관 주위에서 AQP4가 발현되는 세포가 혈관의 내피세포가 아니라 성상아교세포임을 이중 면역형광염색을 통하여 관찰하였다. 이는 특히 天麻가 성상아교세포의 기능에 유의한 영향을 줄 수 있다는 가능성을 제시하는 것으로 생각된다.
- 마취된 흰쥐의 머리를 뇌정위고정장치 (Stoelting, USA)에 고정한 다음 두정부의 정중선을 따라 피부를 절개하고 두개골이 드러나게 하였다. 두개골의 bregma로부터 전방으로 0.
- 腦組織出血에 대한 天麻의 효능을 관찰하기 위하여 실험군을 다음과 같이 구분하였다. 마취와 두정부의 피부절개 및 두개골의 천공 과정은 시행하였으나 뇌조직 내에 collagenase를 주입하지 않은 정상대조군 (Sham)과 위의 과정과 같은 사전준비 수술에 이어 뇌 선조체에 collagenase를 주입하여 腦組織出血을 유발한 대조군 (ICH) 및 대조군과 같이 腦組織出血을 유발한 다음 3일간 天麻 에탄올추출물을 경구투여한 天麻투여군 (ICH+GR)으로 나누었다. 각 군의 실험동물은 각각 18마리씩 총 54마리로, 뇌부종 측정과 뇌조직 수분함량 측정 및 뇌조직의 면역조직화학염색용으로 사용하였다.
- 선정된 pixel들이 구성하는 area 중 300 μm2 이상과 30 μ m2이하의 area들 즉, 신경세포 이외의 불필요한 area들을 제거하고, 각각의 pixel area를 측정하였다.
- 본 실험에 사용한 한약물은 天麻 (Gastrodiae rhizoma, GR)로 (주)허브메디에서 구입하였다. 세절한 天麻 400 g에 40 % ethanol 3,000 ml를 가하여 실온에서 5일간 추출하였으며, 여과액을 rotary evaporator로 감압 농축 후 동결건조 하여 216.7 mg/g의 추출물을 얻어 수율은 21.7 % 이었다. 실험동물의 1회 투여량은 흰쥐 체중 100 g 당 28.
- 7 % 이었다. 실험동물의 1회 투여량은 흰쥐 체중 100 g 당 28.9 mg을 2 ml의 온수에 녹여 腦組織出血 유발 3시간 후부터 1일 1회 3일간 경구투여 하였다.
- 腦組織出血 유발과 天麻 에탄올추출물 투여 3일후에 실험동물을 과용량의 pentobarbital sodium 복강주사로 희생시켰다. 즉시 단두하고 뇌를 적출한 다음 흰쥐용 brain matrix (ASI, USA)를 사용하여 2 mm 두께의 뇌조직 절편을 만들고, digital camera로 촬영한 다음 ImageJ software (ver. 1.41)를 사용하여 각각의 뇌 절편으로부터 정중선을 기준으로 ICH유발측과 정상측의 대뇌반구 면적을 측정하고, 정상측 대뇌반구 면적에 대한 ICH유발측 대뇌반구의 면적비율로 뇌부종 비율을 계산하였다.
- Secondary antibody는 AQP4에 대하여 Cy5-conjugated goat anti- rabbit 1:200 (ab6564, abcam, UK)를, GFAP에 대하여는 FITC-conjugated goat anti-mouse 1:100 (ab6785, abcam, UK)을 사용하였다. 형광염색된 뇌조직은 confocal laser-scanning microscopy (LSM510 META, CarlZeiss, Germany)를 사용하여 관찰하였다.
대상 데이터
- 뇌조직은 cryocut으로 20 μ m 두께의 관상절편으로 제작하여 염색에 사용하였다.
- 본 실험에 사용한 한약물은 天麻 (Gastrodiae rhizoma, GR)로 (주)허브메디에서 구입하였다. 세절한 天麻 400 g에 40 % ethanol 3,000 ml를 가하여 실온에서 5일간 추출하였으며, 여과액을 rotary evaporator로 감압 농축 후 동결건조 하여 216.
- 실험동물은 샘타코 (Samtako, Korea)에서 구입한 11주령, 약 300 g 전후의 Sprague-Dawley계 수컷 흰쥐를 사용 하였다. 흰쥐는 온도 (21-23 ℃), 습도 (40-60 %), 조명 (12시간 명/암)이 자동적으로 유지되는 사육실에서 무균음수와 사료를 자유롭게 공급하며 사육되었고, 실험실 환경에 1주 이상 적응시킨 후 사용하였다.
- 선정된 pixel들이 구성하는 area 중 300 μm2 이상과 30 μ m2이하의 area들 즉, 신경세포 이외의 불필요한 area들을 제거하고, 각각의 pixel area를 측정하였다. 총 500 개의 신경세포 크기를 측정하여 그 평균을 자료로 사용하였다.
데이터처리
- 측정된 모든 자료는 Student's t-test를 사용하여 대조군 (ICH)과 天麻투여군 (ICH+GR) 사이에서 P<0.05의 유의수준으로 검정되었다.
성능/효과
- 1. 天麻 에탄올추출물은 腦組織出血로 인한 뇌부종을 유의하게 감소시켰다.
- 2. 天麻 에탄올추출물은 腦組織出血로 인하여 증가된 뇌조직 수분함량을 유의하게 감소시켰다.
- 3. 天麻 에탄올추출물은 腦組織出血로 인한 대뇌피질 신경세포 세포부종을 유의하게 감소시켰다.
- 4. 天麻 에탄올추출물은 腦組織出血로 인하여 대뇌피질과 외포에서 증가된 AQP4 양성반응을 유의하게 억제하였다.
- 5. 天麻 에탄올추출물은 腦組織出血로 인하여 glia limitans externa에서 증가된 AQP9 양성반응을 유의하게 억제하였다.
- A significant decrease of brain edema % resulted from administration of ethanol extract of GR (ICH+GR), compared with that of ICH control group (*, P<0.05; n=6).
- AQP1의 발현은 기존의 연구보고들과 일치하게 맥락총에서만 강한 발현을 보였고, ICH에 의한 hematoma 주변부에서도 발현이 관찰되지 않았다. 또한 天麻투여에 의하여도 AQP1 발현의 변화가 관찰되지 않았다.
- AQP9의 발현 역시 기존의 연구보고들과 일치하게 glia limitans interna와 externa에서 강한 발현을 보였고, 天麻투여군은 glia limitans externa의 AQP9 발현을 유의하게 억제하였다. 이러한 결과는 天麻가 뇌척수액의 삼투질농도에 유의한 영향을 미치는 것을 추정하게 한다.
- 腦組織出血이 유발된 대뇌반구에서 hematoma 주변부와 맥락총에서 AQP1 발현을 면역조직화학염색을 통하여 관찰한 결과, Sham군은 모두에서 양성반응을 관찰할 수 없었다. ICH 대조군에서도 hematoma 주변부에서는 AQP1 양성반응을 관찰할 수 없었고 (Fig. 6-A-1), 맥락총에서는 매우 강한 AQP1 발현이 관찰되었다 (Fig. 6-A-3, arrow). 天麻투여군 역시 hematoma 주변부에서는 AQP1 양성반응을 관찰할 수 없었고 (Fig.
- 腦組織出血이 유발된 대뇌반구에서 hematoma 주변부, 대뇌피질, 외포 및 맥락총의 AQP4 발현을 면역조직화학염색을 통하여 관찰한 결과 Sham군은 모두에서 양성반응을 관찰할 수 없었다. ICH 대조군은 hematoma 주변부의 혈관 근처에서 강한 AQP4 양성반응을 나타내는 세포들이 많이 관찰되었으며 (Fig.
- 腦組織出血이 유발된 대뇌반구의 대뇌피질 혈관 주위에서 발현되는 AQP4 발현의 세포 종류와 위치를 관찰하기 위하여, AQP4와 성상아교세포 지표인 GFAP의 이중 면역형광염색 결과, 혈관 주위에서 GFAP가 발현된 성상아교세포 (Fig. 5-A, green)와 AQP4 발현 (Fig. 5-A, red)이 일치하였다. 또한 AQP4와 혈관내피세포 지표인 lectin의 이중 면역형광염색 결과, lectin에 immuno-labeling된 혈관내피세포 (Fig.
- 腦組織出血이 유발된 대뇌반구의 수분함량을 측정한 결과 Sham군은 79.34±0.14 %의 수분함량을 나타내었고, ICH 대조군은 80.94±0.27 %로 腦組織出血에 의하여 현저한 수분함량의 증가가 관찰되었다.
- 또한 腦組織出血의 유발 방법에서 hematoma가 선조체 내에 생성되도록 collagenase를 주입하였으므로, 혈관성 부종이 유발되는 선조체의 hematoma 주변부와 세포독성 부종이 일어나는 대뇌피질에서 각각 신경세포의 크기를 관찰하였다. 그 결과, 腦組織出血에 의하여 hematoma 주변부의 신경세포는 Sham군에 비하여 약 14.0 %의 부종이 일어났으며, 대뇌피질의 layer V 신경세포에서는 약 21.9 %의 세포부종이 일어나는 것이 관찰되었다. 이에 비하여 天麻투여군은, 조직학적 관찰에서는 hematoma 주변부와 대뇌피질 layer V 모두에서 신경세포의 부종이 감소한 것을 관찰할 수 있었다.
- 그러므로 본 연구결과에서 腦組織出血에 의한 뇌부종과 뇌조직 수분함량을 유의하게 감소시키고, 대뇌피질 신경세포의 세포독성 부종을 억제하는 효능을 나타낸 天麻가 AQP4 및 AQP1, AQP9 발현에는 어떠한 영향을 미치는지 면역조직화학염색을 통하여 관찰하였다. 그 결과, 腦組織出血이 유발된 대뇌반구에서 hematoma 주변부의 혈관 근처에서 강한 AQP4 양성반응을 나타내는 세포들이 많이 관찰되었으며, 대뇌피질에서도 혈관 주위에 강한 AQP4 양성반응이 관찰되었다. 또한 hematoma가 생성된 선조체와 대뇌피질 사이의 회백질로 구성된 외포에서는 매우 강한 AQP4 양성반응 세포들이 관찰되었고, 맥락총에서도 강한 AQP4 양성반응이 관찰되었다.
- 대뇌피질에서 ICH 대조군은 2.93±0.22 %로 관찰되었으며, 天麻투여군은 1.28±0.11 %로 ICH 대조군에 비하여 P<0.001의 매우 유의성 있는 AQP4 양성반응의 감소가 관찰되었다 (Fig. 4-B).
- 대뇌피질의 layer V에서는 Sham군은 92.93±1.61 μm2을 나타내었고, ICH 대조군은 113.27±2.71 μm2으로 Sham군에 비하여 세포크기가 약 21.9 % 증가하였다.
- 5-A, red)이 일치하였다. 또한 AQP4와 혈관내피세포 지표인 lectin의 이중 면역형광염색 결과, lectin에 immuno-labeling된 혈관내피세포 (Fig. 5-B, green)와 AQP4 발현 (Fig. 5-B, red)이 일치하지 않는 것으로 보아 대뇌피질에서 발현되는 AQP4는 혈관 주위의 성상아교세포에서 발현되는 것으로 관찰되었다.
- 4-A-3, arrow). 또한 hematoma가 생성된 선조체와 대뇌피질 사이의 외포에서는 매우 강한 AQP4 양성반응 세포들이 관찰되었고 (Fig. 4-C-1, arrow), 맥락총에서도 강한 AQP4 양성반응이 관찰되었다 (Fig. 4-C-3, arrow). 이에 비하여 天麻투여군은 hematoma 주변부 (Fig.
- 그 결과, 腦組織出血이 유발된 대뇌반구에서 hematoma 주변부의 혈관 근처에서 강한 AQP4 양성반응을 나타내는 세포들이 많이 관찰되었으며, 대뇌피질에서도 혈관 주위에 강한 AQP4 양성반응이 관찰되었다. 또한 hematoma가 생성된 선조체와 대뇌피질 사이의 회백질로 구성된 외포에서는 매우 강한 AQP4 양성반응 세포들이 관찰되었고, 맥락총에서도 강한 AQP4 양성반응이 관찰되었다. 이에 비하여 天麻투여군은 hematoma 주변부와 맥락총에서는 AQP4 양성반응의 경향이 대조군과 차이가 없었으나 대뇌피질과 외포에서는 AQP4 양성반응이 감소한 것을 관찰할 수 있었다.
- 또한 외포에서 ICH 대조군은 6.92±0.67 %로 관찰되었으며, 이에 비하여 天麻투여군은 3.23±0.73 %로 ICH 대조군에 비하여 P<0.01의 유의성 있는 AQP4 양성반응의 감소가 관찰되었다 (Fig. 4-D).
- 본 연구결과들을 종합하면, 天麻는 腦組織出血에 의한 뇌부종을 억제하고, 뇌조직 수분함량을 감소시키는 효능이 있으며, BBB 손상에 의한 혈관성 뇌부종에는 유의하지 못하지만 신경세포의 세포독성 뇌부종을 억제하는 유의한 효능을 있는 것으로 생각된다. 또한 이러한 天麻의 세포독성 뇌부종의 억제효능은 water channel인 AQP4 발현을 억제하는 작용기전에 의한 것으로 추정된다.
- 위와 같은 세포부종의 변화를 정량적으로 관찰하기 위해 각각의 조직으로부터 신경세포의 크기를 측정한바, hematoma 주변부에서 Sham군은 77.42±1.38 μm2을 나타내었고, ICH 대조군은 88.26±1.93 μm2으로 Sham군에 비하여 세포크기가 약 14.0 % 증가하였다.
- 이러한 AQP1 양성반응 정도를 정량적으로 관찰하기 위하여 각각 조직의 일정면적 내에서 양성반응을 나타내는 면적비율을 측정한 바, hematoma 주변부에서 ICH 대조군은 0.61±0.15 %로 관찰되었으며, 天麻투여군은 0.78±0.10 %로 ICH 대조군에 비하여 변화가 없었다 (Fig. 6-B).
- 이러한 AQP4 양성반응 정도를 정량적으로 관찰하기 위해 각각 조직의 일정면적 내에서 양성반응을 나타내는 면적비율을 측정한 바, hematoma 주변부에서 ICH 대조군은 3.17±0.13 %로 관찰되었으며, 이에 비하여 天麻투여군은 3.04±0.10 %로 ICH 대조군에 비하여 변화가 없었다 (Fig. 4-B).
- 이러한 AQP9 양성반응 정도를 정량적으로 관찰하기 위하여 각각 조직의 일정면적 내에서 양성반응을 나타내는 면적비율을 측정한 바, glia limitans externa에서 ICH 대조군은 7.51±0.92 %로 관찰되었으며, 天麻투여군은 4.80±0.59 %로 ICH 대조군에 비하여 P<0.05의 유의성 있는 AQP9 발현의 감소가 관찰되었다 (Fig. 7-B).
- 이에 비하여 天麻투여군은 hematoma 주변부와 맥락총에서는 AQP4 양성반응의 경향이 대조군과 차이가 없었으나 대뇌피질과 외포에서는 AQP4 양성반응이 감소한 것을 관찰할 수 있었다. 이러한 결과는 앞의 결과와 일치하게, 天麻는 BBB 손상에 의한 혈관성 부종에는 유의하지 못하지만, AQP4 발현을 억제하는 작용에 의하여 세포독성 부종을 유의하게 억제하는 효능이 있음을 재확인 하는 결과이다. 또한 본 연구를 통하여 혈관 주위에서 AQP4가 발현되는 세포가 혈관의 내피세포가 아니라 성상아교세포임을 이중 면역형광염색을 통하여 관찰하였다.
- 이상의 결과로 보아, 天麻는 腦組織出血 상태에서 뇌부종과 신경세포의 세포독성 부종 억제효능이 있으며, 이는 water channel인 AQP4 발현을 억제하는 작용에 의한 것으로 생각된다.
- 7-A-3, arrow) 모두에서 강한 AQP9 양성반응이 관찰되었다. 이에 비하여 天麻투여군은 glia limitans externa에서는 현저히 약한 AQP9 양성반응이 관찰되었고 (Fig. 7-A-2, arrow), glia limitans interna에서도 약한 AQP9 양성반응을 나타내어 (Fig. 7-A-4, arrow), ICH 대조군에 비하여 AQP9 양성반응이 감소한 것을 관찰할 수 있었다.
- 또한 hematoma가 생성된 선조체와 대뇌피질 사이의 회백질로 구성된 외포에서는 매우 강한 AQP4 양성반응 세포들이 관찰되었고, 맥락총에서도 강한 AQP4 양성반응이 관찰되었다. 이에 비하여 天麻투여군은 hematoma 주변부와 맥락총에서는 AQP4 양성반응의 경향이 대조군과 차이가 없었으나 대뇌피질과 외포에서는 AQP4 양성반응이 감소한 것을 관찰할 수 있었다. 이러한 결과는 앞의 결과와 일치하게, 天麻는 BBB 손상에 의한 혈관성 부종에는 유의하지 못하지만, AQP4 발현을 억제하는 작용에 의하여 세포독성 부종을 유의하게 억제하는 효능이 있음을 재확인 하는 결과이다.
- 9 %의 세포부종이 일어나는 것이 관찰되었다. 이에 비하여 天麻투여군은, 조직학적 관찰에서는 hematoma 주변부와 대뇌피질 layer V 모두에서 신경세포의 부종이 감소한 것을 관찰할 수 있었다. 그러나 신경세포의 크기를 측정한 정량적 관찰에서는 hematoma 주변부에서는 통계적 유의성이 없었고, 대뇌피질 layer V에서는 유의성 있는 신경세포 크기의 감소가 인정되었다.
- 정상측 대뇌반구에 비교한 腦組織出血이 유발된 대뇌반구의 뇌부종 비율을 측정한 결과 Sham군은 1.8±0.2 %의 뇌부종이 나타났으며, ICH 대조군은 18.6±0.6 %로 腦組織出血에 의하여 현저한 뇌부종의 증가가 관찰되었다.
- 흰쥐의 뇌 선조체에 bacterial collagenase type VII를 주입하는 방법으로 腦組織出血과 이에 따른 뇌부종을 유발하고, 3일간 天麻의 에탄올추출물을 경구투여한 다음 뇌부종 정도를 측정한 본 실험의 결과, 天麻투여군은 대조군에 비하여 유의성 있는 뇌부종 비율의 감소를 나타내었다. 腦組織出血이 유발된 대뇌반구의 수분함량을 측정한 결과에서도 天麻투여군은 대조군에 비하여 유의성 있는 수분함량의 감소를 나타내었다.
후속연구
- 또한 glia limitans externa는 조직처리과정에서 손상이 쉽게 일어날 수 있는 부위이므로 염색과정상의 문제로도 생각할 수 있다. 이러한 점을 감안하면, AQP9 발현에 대한 天麻의 영향에 대해서는 좀 더 깊은 연구를 필요로 한다.
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