산수유를 항암 식품 소재로 활용하기 위하여 sarcoma-180 암세포에 대한 산수유 에탄올 추출물의 증식 억제 및 마우스에서의 수명 연장효과를 검토하였다. 산수유 에탄올 추출물을 10, 100, 300 및 $500\;{\mu}g/mL$ 농도로 24, 48 및 72시간 별로 sarcoma-180 암세포에 처리하여 암세포 증식억제 효과를 측정한 결과, 농도 및 시간 의존적으로 억제하였으며, $500\;{\mu}g/mL$ 농도에서 48시간 배양 시 60% 이상의 높은 암세포 증식 억제 효과를 나타내었다. 산수유 에탄올 추출물을 $100\;{\mu}g/mL$ 농도 이상으로 처리한 암세포에서는 대조군의 증식이 감소되었으며, 형태학적 변화도 관찰되었다. 또한 산수유 에탄올 추출물은 농도 의존적으로 핵을 응축하고 apoptotic bodies를 생성하였으며, 300 및 $500\;{\mu}g/mL$의 농도에서는 DNA fragmentation을 유도하였고 이러한 apoptosis 유도는 caspase-3 활성과 관련이 있었다. 산수유 에탄올 추출물을 sarcoma-180 암세포가 접종된 마우스 복강에 7일간 100 및 300 mg/kg/day의 농도로 연속적으로 투여하였을 때, 산수유 투여군의 수명이 대조군에 비하여 증가되었다. 따라서 이 결과를 종합하여 볼 때 산수유는 암 예방 기능성 소재로서 활용이 가능하리라 생각된다.
산수유를 항암 식품 소재로 활용하기 위하여 sarcoma-180 암세포에 대한 산수유 에탄올 추출물의 증식 억제 및 마우스에서의 수명 연장효과를 검토하였다. 산수유 에탄올 추출물을 10, 100, 300 및 $500\;{\mu}g/mL$ 농도로 24, 48 및 72시간 별로 sarcoma-180 암세포에 처리하여 암세포 증식억제 효과를 측정한 결과, 농도 및 시간 의존적으로 억제하였으며, $500\;{\mu}g/mL$ 농도에서 48시간 배양 시 60% 이상의 높은 암세포 증식 억제 효과를 나타내었다. 산수유 에탄올 추출물을 $100\;{\mu}g/mL$ 농도 이상으로 처리한 암세포에서는 대조군의 증식이 감소되었으며, 형태학적 변화도 관찰되었다. 또한 산수유 에탄올 추출물은 농도 의존적으로 핵을 응축하고 apoptotic bodies를 생성하였으며, 300 및 $500\;{\mu}g/mL$의 농도에서는 DNA fragmentation을 유도하였고 이러한 apoptosis 유도는 caspase-3 활성과 관련이 있었다. 산수유 에탄올 추출물을 sarcoma-180 암세포가 접종된 마우스 복강에 7일간 100 및 300 mg/kg/day의 농도로 연속적으로 투여하였을 때, 산수유 투여군의 수명이 대조군에 비하여 증가되었다. 따라서 이 결과를 종합하여 볼 때 산수유는 암 예방 기능성 소재로서 활용이 가능하리라 생각된다.
To develop Corni Fructus as a cancer preventive food material, the in vitro cytotoxicities and in vivo antitumor activities of various concentrations of 80% Corni Fructus ethanol extract (CFEE) were investigated using sarcoma-180 cancer cell. Viability was decreased and cell death rate was increased...
To develop Corni Fructus as a cancer preventive food material, the in vitro cytotoxicities and in vivo antitumor activities of various concentrations of 80% Corni Fructus ethanol extract (CFEE) were investigated using sarcoma-180 cancer cell. Viability was decreased and cell death rate was increased in both dose- and time-dependent manners in cells treated with CFEE at 10, 100, 300, and $500\;{\mu}g/mL$ concentrations for 24, 48, and 72 hr. Proliferation was also inhibited more than 60% in cells treated with CFEE at the $100\;{\mu}g/mL$ concentration for 48 hr. In addition, the morphology of cells treated with CFEE at the 100 and $500\;{\mu}g/mL$ concentrations was distorted with shrunken cell masses and lower cell numbers compared to the control cells. In the cells treated with CFEE, the formation of apoptotic bodies and nuclear condensation were observed in dose dependent manners. CFEE also increased DNA fragmentation values at the 100 and $500\;{\mu}g/mL$ concentrations. The apoptosis induced by CFEE was connected to the proteolytic activation of caspase-3. When CFEE was administered at 100 and 300 mg/kg, ip, for 7 consecutive days in mice inoculated with sarcoma-180 cancer cell, the life span of the mice was found to be longer than that of the control mice that did not receive the extract. These results suggest that Corni Fructus may be used as a potential cancer preventive food material.
To develop Corni Fructus as a cancer preventive food material, the in vitro cytotoxicities and in vivo antitumor activities of various concentrations of 80% Corni Fructus ethanol extract (CFEE) were investigated using sarcoma-180 cancer cell. Viability was decreased and cell death rate was increased in both dose- and time-dependent manners in cells treated with CFEE at 10, 100, 300, and $500\;{\mu}g/mL$ concentrations for 24, 48, and 72 hr. Proliferation was also inhibited more than 60% in cells treated with CFEE at the $100\;{\mu}g/mL$ concentration for 48 hr. In addition, the morphology of cells treated with CFEE at the 100 and $500\;{\mu}g/mL$ concentrations was distorted with shrunken cell masses and lower cell numbers compared to the control cells. In the cells treated with CFEE, the formation of apoptotic bodies and nuclear condensation were observed in dose dependent manners. CFEE also increased DNA fragmentation values at the 100 and $500\;{\mu}g/mL$ concentrations. The apoptosis induced by CFEE was connected to the proteolytic activation of caspase-3. When CFEE was administered at 100 and 300 mg/kg, ip, for 7 consecutive days in mice inoculated with sarcoma-180 cancer cell, the life span of the mice was found to be longer than that of the control mice that did not receive the extract. These results suggest that Corni Fructus may be used as a potential cancer preventive food material.
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문제 정의
따라서 본 연구에서는 산수유 에탄올 추출물의 sarcoma-180 암세포의 증식 억제 및 수명연장효과를 검토하였다.
제안 방법
24시간 이후에 각 well의 배양액을 제거한 후 산수유 에탄올 추출물(CFEE, 80% Corni Fructus ethanol extract)을 10, 100, 300 및 500 μg/mL 첨가하여 24, 48 및 72시간 동안 배양하고 암세포 증식을 혈구 계산반을 이용하여 세포를 counting 하였다(21).
Sarcoma-180 암세포 최종농도가 1×106 cells/mL가 되도록 희석하여 6 well plate에 분주한 다음 37℃, 5% CO2 incubator에서 24시간 배양한 후 산수유 에탄올 추출물을 300, 500 μg/mL 첨가하여 48시간 동안 배양하였다.
Sarcoma-180 암세포에 산수유 에탄올 추출물을 10, 100, 300 및 500 μg/mL 농도로 처리하여 48시간 반응시킨 후 위상차 현미경(LP-1, Leica, Wetzlar, Germany)을 이용하여 대조군과 시료처리군의 형태학적 변화를 비교 관찰하였다.
또한 산수유에탄올 추출물의 첨가 농도에 따른 sarcoma- 180 암세포의 형태학적 변화를 확인하기 위해 10, 100, 300 및 500 μg/mL 산수유 에탄올 추출물을 처리하여 48시간 반응 후 각 농도별 형태학적 변화를 위상차 현미경으로 관찰하였다(Fig. 2).
마우스 수명 연장 효과는 실험동물의 복강 내에 암세포를 주사하고 24시간이 경과한 후부터 7일간 연속적으로 대조군은 증류수를, 실험군은 산수유 에탄올 추출물을 100 및 200 mg/kg/body 농도로 200 μL씩을 복강에 주사한 후 30일간 생존여부를 관찰하였다.
마우스의 sarcoma-180 암세포에 대한 항암효과를 측정하기 위하여 mouse 복강에 sarcoma-180 암세포를 주입하여 복수암을 유발시키고, 24시간 후 산수유 에탄올 추출물을 100 및 200 mg/kg/day로 7일간 복강에 투여하여 30일 동안 생존율을 조사한 결과는 Table 1과 같다. 즉 산수유 에탄올 추출물을 처리하지 않은 대조군은 20.
실험에 사용한 동물은 ICR mice(Damool Science, Daejeon, Korea)로 3주령의 체중 13∼16 g인 개체를 사용하였으며 실험동물용 페렛사료(Damool Science)로 사육하였고 동물 실험실 온도는 23±2℃, 습도 50±5%를 유지하였으며 12시간 간격의 light-dark cycle을 유지하였다. 물은 자유롭게 섭취시켰으며 실험군에 따라 8마리씩 1군으로 분류하여 사용하였다.
반응이 종료된 dish에서 회수한 암세포를 PBS로 3회 세척 후 상등액을 제거한 암세포에 50μL lysis buffer를 첨가하여 용해하고, caspase-3(DEVD-pNA)와 함께 37℃에서 2시간 간격으로 incubation 한 후 microplate reader로 405 nm에서 흡광도를 측정하여 활성정도를 확인하였다(24).
배양이 종료된 well에서 회수한 암세포를 PBS로 3회 세척하고 2 μg/mL Hoechst(bis-benzimide)를 첨가하여 실온에서 20분 동안 염색한 후 다시 PBS(phosphate buffered saline)로 세척하고 형광현미경으로 암세포를 관찰하였다(22).
산수유 에탄올 추출물에 의한 sarcoma-180 암세포의 사멸이 caspase 활성에 의존하여 유도되는 지 검토하기 위하여 caspase-3 활성을 측정한 결과(Fig. 5), 농도 의존적으로 caspase-3 활성을 유도하였다. 즉 산수유 에탄올 추출물은 sarcoma-180 암세포의 사멸 기전을 caspase-3 활성에 의존하여 유도됨을 알 수 있었다.
산수유 에탄올 추출물을 10, 100, 300 및 500 μg/mL 농도로 처리하여 24시간 동안 배양한 후 핵의 형태학적 변화를 관찰한 결과, Fig. 3과 같았다.
산수유 에탄올 추출물을 처리한 sarcoma-180 암세포에서 apoptosis가 진행될 때 암세포에서 나타나는 DNA의 분절화를 정량적으로 분석하기 위해 Cell death detection ELISAplus kit(Roche, Mannheim, Germany)를 이용하였다. Sarcoma-180 암세포 최종농도가 1×106 cells/mL가 되도록 희석하여 6 well plate에 분주한 다음 37℃, 5% CO2 incubator에서 24시간 배양한 후 산수유 에탄올 추출물을 300, 500 μg/mL 첨가하여 48시간 동안 배양하였다.
산수유 에탄올 추출물의 암세포 사멸효과가 apoptosis에 의해 유도되는 지를 검토하기 위하여 hoechst 염색을 이용한 핵의 형태변화 및 DNA 절편을 관찰하였다. 산수유 에탄올 추출물을 10, 100, 300 및 500 μg/mL 농도로 처리하여 24시간 동안 배양한 후 핵의 형태학적 변화를 관찰한 결과, Fig.
실험동물의 복강 내에서 7～10일간 배양된 sarcoma-180 암세포를 복강에 RPMI1640 배지를 투여하고 복수와 함께 취하여 원심분리(1200 rpm, 5 min, 4℃)하여 암세포를 분리 하였다. 분리된 암세포에서 red blood cell lysis buffer를 10 mL 첨가하고 원심분리 하여 혈액을 제거한 다음 RPMI1640 배지 10 mL로 부유시켜 재차 원심분리 하여 상등액을 제거하였다.
즉, monolayer로 배양한 sarcoma-180 암세포를 0.25% trypsin-EDTA 용액 1 mL을 처리하여 single cell로 만든 후 배양액으로 최종농도가 2×106 cells/mL가 되도록 희석하여 10 cm dish에 분주한 다음 37℃, 5% CO2 incubator에서 24시간 배양한 후 산수유 에탄올 추출물을 10, 100 및 300 μg/mL 첨가하여 48시간 동안 배양하였다.
최종 농도가 2×106 cells/mL이 되도록 암세포 부유액을 만들어 200 μL씩을 복강에 주사하여 복수암을 유발하였다.
대상 데이터
본 실험에 사용된 산수유는 2007년 10월에 전남 구례군 산동면에서 수확한 후 씨를 제거한 건조과실을 구입하여 본 실험에 사용하였다. 산수유 에탄올 추출물은 전보(20)와 동일한 방법으로 추출하였다.
본 실험에 사용한 sarcoma-180 암세포는 한국세포주은행(KCLB)로부터 분양받아 RPMI 1640 배지(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 첨가하여 37℃, 5% CO2 incubator (HERA cell 150, Heraeus, Hanau, Germany)에서 계대배양하면서 실험에 사용하였다.
실험에 사용한 동물은 ICR mice(Damool Science, Daejeon, Korea)로 3주령의 체중 13∼16 g인 개체를 사용하였으며 실험동물용 페렛사료(Damool Science)로 사육하였고 동물 실험실 온도는 23±2℃, 습도 50±5%를 유지하였으며 12시간 간격의 light-dark cycle을 유지하였다.
데이터처리
*Significant differences were compound with the control at p<0.05 by Student t-test.
Significant differences were compound with the control at *p<0.05 by Student t-test.
각 군 간의 통계적 유의성에 대한 검증은 Student's t-test를 이용하여, p-value가 0.05 미만일 때 통계적으로 유의성이 있다고 판단하였다.
실험결과는 3반복에 대한 평균 및 표준편차로 표시하였으며, 각 실험군을 대조군에 대한 백분율에 나타내었다. 각 군 간의 통계적 유의성에 대한 검증은 Student's t-test를 이용하여, p-value가 0.
이론/모형
Caspase-3의 활성은 Colorimetric assay kit(BioVison, CA, USA)로 제조사의 방법에 따라 측정하였다. 즉, monolayer로 배양한 sarcoma-180 암세포를 0.
성능/효과
한편 Kim 등(26)은 산수유로부터 분리한 ursolic acid를 인체 폐암세포 및 유방암세포에 100 μg/mL 농도로 처리한 결과 이들 암세포 증식을 90% 이상 억제하였다고 보고한 바 있다. 본 실험에서 산수유 에탄올 추출물의 높은 암세포 증식억제효과는 산수유 에탄올 추출물에 함유되어 있는 다양한 생리활성물질들과 연관성이 있다고 본다.
산수유 에탄올 추출물의 sarcoma-180 암세포증식 억제여부 검토를 위하여 산수유 에탄올 추출물을 sarcoma-180암세포에 10, 100, 300 및 500 μg/mL의 농도로 처리하여 24, 48 및 72시간 배양시킨 후에 trypan blue assay를 이용하여 측정한 결과 농도 의존적으로 암세포증식을 억제하였으며, 특히 500 μg/mL 농도에서 48시간 배양 시 60% 이상의 높은 암세포 증식 억제 효과를 나타내었다(Fig. 1).
즉 sarcoma-180 암세포에 산수유 에탄올 추출물을 300 및 500 μg /mL의 농도로 처리하였을 때, 각각 흡광도 값이 2.61, 2.78로 대조군의 1.28에 비해 높게 나타나는 것을 미루어 보아 sarcoma-180 암세포에 산수유 에탄올 추출물을 처리하였을 때 DNA 분절화에 따른 apoptosis가 일어남을 알 수 있었다(Fig. 4).
즉 대조군 암세포의 핵은 손상 없이 일정한 반면, 산수유 에탄올 추출물을 300 μg/mL 이상 농도로 처리하였을 때 핵이 손상되어 절편 되었으며, apoptosis의 특징 중 하나인 apoptotic bodies를 관찰할 수 있었다.
5), 농도 의존적으로 caspase-3 활성을 유도하였다. 즉 산수유 에탄올 추출물은 sarcoma-180 암세포의 사멸 기전을 caspase-3 활성에 의존하여 유도됨을 알 수 있었다.
마우스의 sarcoma-180 암세포에 대한 항암효과를 측정하기 위하여 mouse 복강에 sarcoma-180 암세포를 주입하여 복수암을 유발시키고, 24시간 후 산수유 에탄올 추출물을 100 및 200 mg/kg/day로 7일간 복강에 투여하여 30일 동안 생존율을 조사한 결과는 Table 1과 같다. 즉 산수유 에탄올 추출물을 처리하지 않은 대조군은 20.3일에 모두 폐사하였으나, 산수유 에탄올 추출물을 100 및 300 mg/kg/day 농도로 처리한 군에서는 생존일수가 각각 26.3(29.3%) 및 28.3(39.3%)일로 농도 의존적인 마우스의 수명연장효과를 나타내었다.
후속연구
본 연구 결과를 종합할 때, 산수유 에탄올 추출물은 in vitro와 in vivo에서 항암효과를 나타내었으며, 앞으로 이에 대한 좀 더 많은 연구가 진행된다면 산수유를 항암과 관련된 기능성식품 원료로 활용할 가능성이 있을 것으로 생각된다.
이 세포는 1914년 미국의 Croker 연구소에서 Zuckerberg(18)가 처음으로 발견하였으며, 마우스의 액와 부위에서 자연 발생된 종양으로서 복수암으로 전환시켜 종양연구에 많이 사용하고 있다(19). 앞으로 산수유를 암 예방 소재로 활용하기 위해서는 더욱 많은 항암효과에 관한 연구들이 진행되어야 할 것이다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
한약재로 사용된 산수유와 관련하어 한방자료에 기록된 내용은?
예로부터 산수유는 우리나라를 비롯하여 중국과 일본 등에서 중요한 한약재로 많이 사용되어져 왔다(4). 산수유는 그 맛이 시고 성질은 따뜻하며, 다뇨증, 요통, 이명, 폐결핵 등의 치료제로 사용되어 왔으며, 그 과실은 자양, 강장, 음위, 이조에 약효가 있고, 간경화, 신경에 좋고, 이뇨작용, 혈압강하작용, 항암 및 항균작용 등의 약리작용이 있다고 한방자료에 기록되어 있다(5). 산수유의 주요 화학 성분은 gallic acid, malic acid, tartaric acid, ursolic acid, morroniside, loganin, sweroside 등과 같은 배당체, tellimagrandin 1,2, 1,2,3-tri-O-galloyl-β-D-glucose, 1,2,6-tri-O-galloyl-β-D-glucose, 1,2,3,6-tetra-O-galloyl-β-D-glucose, gemin D, 탄닌 성분으로 cornusiin A-G, 2,3-di-O-galloyl-D-glucose, 1,7-di-O-galloyl-D-sedoheptullose 등이 보고되고 있다(6,7).
산수유란?
산수유(Corni Fructus)는 층층나무과에 속하는 산수유나무(Cornus officinalis)의 과육으로, 가을에 성숙한 붉은색 열매의 씨를 제거한 건조한 과육을 산수유라 한다(3). 예로부터 산수유는 우리나라를 비롯하여 중국과 일본 등에서 중요한 한약재로 많이 사용되어져 왔다(4).
산수유의 주요 화학 성분에는 무엇이 있는가?
산수유는 그 맛이 시고 성질은 따뜻하며, 다뇨증, 요통, 이명, 폐결핵 등의 치료제로 사용되어 왔으며, 그 과실은 자양, 강장, 음위, 이조에 약효가 있고, 간경화, 신경에 좋고, 이뇨작용, 혈압강하작용, 항암 및 항균작용 등의 약리작용이 있다고 한방자료에 기록되어 있다(5). 산수유의 주요 화학 성분은 gallic acid, malic acid, tartaric acid, ursolic acid, morroniside, loganin, sweroside 등과 같은 배당체, tellimagrandin 1,2, 1,2,3-tri-O-galloyl-β-D-glucose, 1,2,6-tri-O-galloyl-β-D-glucose, 1,2,3,6-tetra-O-galloyl-β-D-glucose, gemin D, 탄닌 성분으로 cornusiin A-G, 2,3-di-O-galloyl-D-glucose, 1,7-di-O-galloyl-D-sedoheptullose 등이 보고되고 있다(6,7). 또한 산수유의 주요 생리활성에 대한 연구로는 산수유 종자의 항당뇨 효과(8), 물 추출물의 항히스타민 효과(9), 부종억제효과(10), 납에 의한 조직손상 억제(11), 정자 운동성 증가에 미치는 효과(12), 항균효과(13), 티로시나제 저해작용(14) 및 항산화 효과(15,16) 등이 보고되고 있으나, 항암효과에 관한 연구는 세포 독성 효과(17)에 관한 연구들만 진행되고 있을 뿐 체계적인 연구가 미흡한 실정이다.
참고문헌 (28)
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