산수유(Cornus officianalis) 에탄올 추출물의 항산화, 항돌연변이 활성 및 암세포 성장 억제 효과 Antioxidative, Antimutagenic, and Cytotoxic Activities of Ethanol Extracts from Cornus officianalis원문보기
본 연구에서는 산수유에탄올 추출물의 항산화능, 항돌연변이 및 항암활성을 분석하여 새로운 생리활성 물질의 탐색과 고부가가치의 기능성식품으로서의 이용 가능성을 알아 보고자 하였다. 산수유 에탄올 추출물의 전자공여능은 농도 의존적으로 증가하여 500 ppm의 농도에서는 합성항산화제인 BHT보다 높았고 천연항산화제인 L-ascorbic acid와 유사하였다. 뿐만 아니라, S. Typhimurium TA100에 대해 산수유 에탄올 추출물은 직접돌연변이원인 4-NQO 사용 시 항돌연변이 효과가 우수한 것으로 나타났다. 또한, 산수유 에탄올 추출물은 $700{\mu}g/plate$ 첨가하였을 때 인체 간암 세포와 자궁경부암 세포의 증식을 모두 78% 이상 억제하였다. 산수유 에탄올 추출물은 비교적 높은 함량의 폴리페놀과 플라보노이드를 함유하고 있어, 이들 물질이 항산화와 항암효과에 영향을 미칠 것으로 사료되었다. 그러나 산수유에는 비타민 C를 비롯한 다른 항산화 성분도 함유되어 있으므로 이들의 항산화성도 추출물의 항산화력에 영향을 주었을 것으로 생각된다. 결론적으로, 산수유 에탄올 추출물은 항산화능과 항돌연변이 활성이 있었으며 인체 간암세포, 자궁경부암 세포 및 대장암 세포에 대해 항암 활성이 있는 것으로 나타나 기능성식품의 소재로서의 이용 가능성을 보여주었다.
본 연구에서는 산수유 에탄올 추출물의 항산화능, 항돌연변이 및 항암활성을 분석하여 새로운 생리활성 물질의 탐색과 고부가가치의 기능성식품으로서의 이용 가능성을 알아 보고자 하였다. 산수유 에탄올 추출물의 전자공여능은 농도 의존적으로 증가하여 500 ppm의 농도에서는 합성항산화제인 BHT보다 높았고 천연항산화제인 L-ascorbic acid와 유사하였다. 뿐만 아니라, S. Typhimurium TA100에 대해 산수유 에탄올 추출물은 직접돌연변이원인 4-NQO 사용 시 항돌연변이 효과가 우수한 것으로 나타났다. 또한, 산수유 에탄올 추출물은 $700{\mu}g/plate$ 첨가하였을 때 인체 간암 세포와 자궁경부암 세포의 증식을 모두 78% 이상 억제하였다. 산수유 에탄올 추출물은 비교적 높은 함량의 폴리페놀과 플라보노이드를 함유하고 있어, 이들 물질이 항산화와 항암효과에 영향을 미칠 것으로 사료되었다. 그러나 산수유에는 비타민 C를 비롯한 다른 항산화 성분도 함유되어 있으므로 이들의 항산화성도 추출물의 항산화력에 영향을 주었을 것으로 생각된다. 결론적으로, 산수유 에탄올 추출물은 항산화능과 항돌연변이 활성이 있었으며 인체 간암세포, 자궁경부암 세포 및 대장암 세포에 대해 항암 활성이 있는 것으로 나타나 기능성식품의 소재로서의 이용 가능성을 보여주었다.
The antioxidative, antimutagenic and cytotoxic activities of ethanol extract from Cornus officianalis have been studied. The antioxidant activity of the ethanol extract was measured by 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) method. The inhibition effects on the mutagenicity in Salmonella Typhimurium T...
The antioxidative, antimutagenic and cytotoxic activities of ethanol extract from Cornus officianalis have been studied. The antioxidant activity of the ethanol extract was measured by 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) method. The inhibition effects on the mutagenicity in Salmonella Typhimurium TA100 were evaluated by Ames test and cancer cell inhibitory effects in Hep3B cell and HeLa cell were tested by MTT assay. Cornus officianalis had an important free radical-scavenging activity towards the DPPH radical. At a concentration of 500 ppm, the DPPH radical-scavenging activity of Cornus officianalis was similar to that of L-ascorbic acid. None of the extracts produced a mutagenic effect on S. Typhimurium TA100. The ethanol extract from Cornus officianalis showed about 77% of inhibition at 500 ppm on the mutagenicity induced by 4-nitroquinoline-1-oxide. The extract from Cornus officianalis showed strong cytotoxicity against Hep3B and HeLa cells, with inhibition of 83 and 78% at a dose of $700{\mu}g$/plate, respectively. Moreover, the ethanol extracts had 34.33 mg H.E/g of polyphenols and 5.67 mg Q.E/g of flavonoids, respectively. Therefore, the present study showed antioxidative, antimutagenic and anticancer potential of the ethanol extract from Cornus officianalis.
The antioxidative, antimutagenic and cytotoxic activities of ethanol extract from Cornus officianalis have been studied. The antioxidant activity of the ethanol extract was measured by 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) method. The inhibition effects on the mutagenicity in Salmonella Typhimurium TA100 were evaluated by Ames test and cancer cell inhibitory effects in Hep3B cell and HeLa cell were tested by MTT assay. Cornus officianalis had an important free radical-scavenging activity towards the DPPH radical. At a concentration of 500 ppm, the DPPH radical-scavenging activity of Cornus officianalis was similar to that of L-ascorbic acid. None of the extracts produced a mutagenic effect on S. Typhimurium TA100. The ethanol extract from Cornus officianalis showed about 77% of inhibition at 500 ppm on the mutagenicity induced by 4-nitroquinoline-1-oxide. The extract from Cornus officianalis showed strong cytotoxicity against Hep3B and HeLa cells, with inhibition of 83 and 78% at a dose of $700{\mu}g$/plate, respectively. Moreover, the ethanol extracts had 34.33 mg H.E/g of polyphenols and 5.67 mg Q.E/g of flavonoids, respectively. Therefore, the present study showed antioxidative, antimutagenic and anticancer potential of the ethanol extract from Cornus officianalis.
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문제 정의
따라서 본 연구에서는 산수유 에탄올 추출물의 항산화능, 항돌연변이 및 항암 활성을 분석하여 새로운 생리활성 물질의 탐색과 고부가가치의 기능성 식품으로서의 이용 가능성을 알아보고자 하였다. 이를 위해 산수유 에탄올 추출물의 항산화능을 측정하고, Ames test를 이용하여 돌연변이 유발 억제능을 검색하였다.
따라서 본 연구에서는 산수유 에탄올 추출물의 항산화능, 항돌연변이 및 항암 활성을 분석하여 새로운 생리활성 물질의 탐색과 고부가가치의 기능성 식품으로서의 이용 가능성을 알아보고자 하였다. 이를 위해 산수유 에탄올 추출물의 항산화능을 측정하고, Ames test를 이용하여 돌연변이 유발 억제능을 검색하였다.
제안 방법
Ames 실험계에서 산수유 에탄올 추출물의 돌연변이 유발 억제 효과를 직접 돌연변이원인 sodium azide와 4-NQO를 사용하여 염기쌍 치환 변이주인 Salmonella Typhimurium TA100으로 실험하였다. 직접 돌연변이원은 세포내 DNA 정보 발현에 직접적으로 이상을 일으켜 돌연변이를 유발시키는 물질이다.
5 mM histidine/biotin이 포함된 top agar 2 mL를 첨가하고 3초간 섞은 후 minimal glucose agar plate에 중층하여 암소에서 굳혔다. 그 뒤 plates를 37℃ incubator(SW90B, Sangwoo Scientific Co., Korea)에서 48시간 배양하여 복귀돌연변이 colony 수를 측정하였다. 항돌연변이능은 아래와 같은 식에 의해 산출하였다.
15 μg/plate)는 DMSO에 녹여 사용하였다. 돌연변이원의 사용량은 예비실험을 통해 dose response test를 실시하여 최적의 농도를 확인하여 사용하였다.
이를 위해 산수유 에탄올 추출물의 항산화능을 측정하고, Ames test를 이용하여 돌연변이 유발 억제능을 검색하였다. 또한 MTT assay를 이용하여 Hep3B cell과 HeLa cell에 대한 암세포 증식 억제 효과를 비교하여 항암 효과를 살펴보았다.
산수유 에탄올 추출물은 건조 시료를 분쇄한 후, 100 g에 70% 에탄올(2 L)을 가하여 실온에서 12시간 추출한 후 여과지(Advantec. Toyo No.2)로 여과하는 과정을 5회 반복하였다.
실험 전 master plate에 배 양한 균주를 nutrient broth에 접종하여 37℃에서 약 14～16 시간 동안 진탕 배양한 후 1～2×109 cells/mL의 밀도가 되도록 희석하여 사용하였다. 실험에 사용하기 전에 시료의 돌연변이 유발실험을 실시하여 돌연변이능이 나타나지 않는 범위 내에서 시료의 농도를 결정하였다. 모든 실험은 2번 반복하여 실험하였다.
따라서 본 연구에서는 산수유 에탄올 추출물의 항산화능, 항돌연변이 및 항암 활성을 분석하여 새로운 생리활성 물질의 탐색과 고부가가치의 기능성 식품으로서의 이용 가능성을 알아보고자 하였다. 이를 위해 산수유 에탄올 추출물의 항산화능을 측정하고, Ames test를 이용하여 돌연변이 유발 억제능을 검색하였다. 또한 MTT assay를 이용하여 Hep3B cell과 HeLa cell에 대한 암세포 증식 억제 효과를 비교하여 항암 효과를 살펴보았다.
전자공여능은 측정된 흡광도 값으로부터 먼저 Inhibition concentration(%)＝(1－시료첨가구의 O.D/시료무첨가구의 O.D)×100을 구한 다음 Y＝aX＋b 방정식을 작성하여 다음의 식으로 IC50 값을 구하였다.
Salmonella Typhimurium TA100 균주를 한국 세포주은행(KCLB)에서 분양 받아 돌연변이 및 항돌연변이능을 측정하였다. 정기적으로 이들 균주의 histidine 요구성, deep rough(rfa) 돌연변이, uvrB 돌연변이와 R factor 등의 유전 형질을 확인하였다. 이들 균주는 액체질소에 보관하면서 사용하였다.
대상 데이터
세포 배양액으로는 10% fetal bovine serum(FBS), 1% penicillin-K-streptomycin이 첨가된 MEM을 사용하였다. 37℃, 5% CO2 incubator에서 세포가 70～80% 자라나는 3～4일 간격으로 계대배양하면서 실험에 사용하였다.
Salmonella Typhimurium TA100 균주를 한국 세포주은행(KCLB)에서 분양 받아 돌연변이 및 항돌연변이능을 측정하였다. 정기적으로 이들 균주의 histidine 요구성, deep rough(rfa) 돌연변이, uvrB 돌연변이와 R factor 등의 유전 형질을 확인하였다.
돌연변이 유발물질로는 직접돌연변이 물질인 sodium azide와 4-NQO를 사용하였다. Sodium azide(1.
본 실험에 사용된 암세포주는 인체 간암세포인 Hep3B cell lines과 인체 자궁암세포인 HeLa cell lines이며, 한국세포주은행(KCLB)에서 2007년 8월에 분양받아 사용하였다. 세포 배양액으로는 10% fetal bovine serum(FBS), 1% penicillin-K-streptomycin이 첨가된 MEM을 사용하였다.
본 실험에 사용한 산수유 열매는 대구 약령시 한약방에서 음건된 형태로 시판되는 국내산 한약규격품을 구입하였다.
본 실험에 사용된 암세포주는 인체 간암세포인 Hep3B cell lines과 인체 자궁암세포인 HeLa cell lines이며, 한국세포주은행(KCLB)에서 2007년 8월에 분양받아 사용하였다. 세포 배양액으로는 10% fetal bovine serum(FBS), 1% penicillin-K-streptomycin이 첨가된 MEM을 사용하였다. 37℃, 5% CO2 incubator에서 세포가 70～80% 자라나는 3～4일 간격으로 계대배양하면서 실험에 사용하였다.
, Japan)로 농축한 후, 동결 건조하였다. 추출 시료는 0.1 M sodium acetate buffer(pH 5.5)에 녹여 DPPH 라디칼 소거능 측정을 위한 시료로 사용하였고, DMSO에 용해시켜 Ames test를 위한 시료로 사용하였다. 시료는 -20℃에서 냉동보관하며 실험에 사용하였다(12).
데이터처리
2)Values in the same column with the different case letters are significantly different (p<0.05) by Duncan's multiple range test.
Values in the same cell line with the different upper case letters (A～E) and with lower case letters (a～e) are significantly different (p<0.05) by Duncan's multiple range test, respectively.
각 실험군의 평균치간의 차이의 유의성은 분산분 석(ANOVA)을 실시한 후 p<0.05 수준에서 Duncan's multiple range test로 검정하였다.
또한 돌연변이능 측정에서 시료와 양성대조군 간의 평균 차이를 검정하기 위해 Student's t-test를 사용하였다.
이론/모형
Maron과 Ames(14)의 방법에 따라 Ames test를 실시하였으며 pre-incubation법으로 산수유 열매의 돌연변이 및 항돌연변이 활성을 측정하였다. 실험 전 master plate에 배 양한 균주를 nutrient broth에 접종하여 37℃에서 약 14～16 시간 동안 진탕 배양한 후 1～2×109 cells/mL의 밀도가 되도록 희석하여 사용하였다.
1. The electron donating ability of ethanol extract from Cornus officianalis using the DPPH assay. Mean with the different letters are significantly different (p<0.
산수유 에탄올 추출물의 전자공여능은 Blois(13)의 방법에 의하여 측정되었다. 각 농도별로 0.
산수유 추출물의 암세포 성장억제 효과를 측정하기 위해 Carmichael 등(15)의 방법에 따라 MTT assay를 실시하였다. 암세포를 96 well plate에 1×104 cells/well이 되게 180 μL 씩 분주하고 37℃, 5% CO2 배양기에서 24시간 동안 배양하였다.
총폴리페놀 함량 측정은 Folin-Ciocalteu(FC)법(16)에 따라 시행되었다. 즉, 증류수 5 mL와 시료 1 mL, FC reagent 0.
총플라보노이드 함량 측정은 Moreno 등(17)의 방법에 따라 행하였다. 10% aluminum nitrate 0.
성능/효과
그러나 산수유에는 비타민 C를 비롯한 다른 항산화 성분도 함유되어 있으므로 이들의 항산화성도 추출물의 항산화력에 영향을 주었을 것으로 생각된다. 결론적으로, 산수유 에탄올 추출물은 항산화능과 항돌연변이 활성이 있었으며 인체 간암세포, 자궁경부 암 세포 및 대장암 세포에 대해 항암 활성이 있는 것으로 나타나 기능성식품의 소재로서의 이용 가능성을 보여주었다.
Kim 등(4)의 연구에서 산수유 메탄올 추출물은 1000 ppm 의 농도에서 67%의 전자공여능을 나타내었다. 그리고 산수유 에탄올 추출물의 IC50 값은 154 ppm으로 산수유 메탄올 추출물의 IC50 값인 189.3 ppm보다 낮아(18) 본 실험의 에탄올 추출물이 더 높은 항산화 활성을 보였다. 높은 DPPH 라디칼 소거능을 보이는 물질에는 폴리페놀처럼 구조 중에 hydroxyl group을 포함하며 DPPH 라디칼과 반응하기에 적합한 입체 구조를 가지는 화합물이 존재한다고 알려져 있다 (19).
7%로 나타났다(Table 3). 따라서 본 실험 결과, 산수유 에탄올 추출물은 S. Typhimurium TA100에 대해 직접돌연변이원 4-NQO 에 대한 항돌연변이 효과가 우수한 것으로 나타났다.
높은 DPPH 라디칼 소거능을 보이는 물질에는 폴리페놀처럼 구조 중에 hydroxyl group을 포함하며 DPPH 라디칼과 반응하기에 적합한 입체 구조를 가지는 화합물이 존재한다고 알려져 있다 (19). 따라서 본 실험에서 산수유 에탄올 추출물이 높은 DPPH 라디칼 소거능을 보인 것도 산수유 추출물에 포함된 폴리페놀류 및 플라보노이드 화합물과 연관이 있을 것으로 사료된다.
4%)보다 높은 항산화 활성을 보였다. 또한 천연항산화제로 알려진 L-ascorbic acid는 저농도에서 높은 전자공여능을 나타내어 초기 항산화 활성은 시료들 중 가장 높았으나, 농도가 높아질수록 산수유 에탄올 추출물의 전자공여능이 증가하여 300 ppm부터는 L-ascorbic acid와 유의한 차이가 없었다.
또한, 산수유 에탄올 추출물은 700 μg/plate 첨가하였을 때 인체 간암 세포와 자궁경부암 세포의 증식을 모두 78% 이상 억제하였다.
항돌연변이원은 질병과 유전독성물질에 의해 유도되는 돌연변이를 차단하여 암의 예방에 기여하 므로 매우 중요하다(28). 본 실험 결과, 산수유 에탄올 추출물은 직접돌연변이원인 4-NQO에 대하여 강한 항돌연변이 활성뿐 아니라 암세포에 대한 성장 억제 효과 또한 높게 나타나 암을 예방할 수 있는 기능성 소재로서의 가능성을 보여주었다.
본 연구에서 산수유 에탄올 추출물은 다른 일부 생약재들에 비해 비교적 높은 함량의 폴리페놀과 플라보노이드를 함유하고 있으며 이는 산수유의 항산화능, 항돌연변이 및 항암 활성에 영향을 미칠 것으로 사료되었다. 그러나 동결건조한 산수유의 성분 분석 시 6.
산수유 에탄올 추출물의 전자공여능은 농도 의존적으로 증가하여 500 ppm의 농도에서는 합성항산화제 인 BHT보다 높았고 천연항산화제인 L-ascorbic acid와 유사하였다. 뿐만 아니라, S. Typhimurium TA100에 대해 산수유 에탄올 추출물은 직접돌연변이원인 4-NQO 사용 시 항돌연변이 효과가 우수한 것으로 나타났다. 또한, 산수유 에탄올 추출물은 700 μg/plate 첨가하였을 때 인체 간암 세포와 자궁경부암 세포의 증식을 모두 78% 이상 억제하였다.
산수유 에탄올 추출물의 전자공여능은 농도 의존적으로 증가하였다. 산수유 에탄올 추출물은 200 ppm 농도까지는 합성 항산화제인 BHT(64.3%)와 비슷한 전자공여능을 나타 내었고, 300 ppm 이상의 농도에서는 BHT(73.4%)보다 높은 항산화 활성을 보였다. 또한 천연항산화제로 알려진 L-ascorbic acid는 저농도에서 높은 전자공여능을 나타내어 초기 항산화 활성은 시료들 중 가장 높았으나, 농도가 높아질수록 산수유 에탄올 추출물의 전자공여능이 증가하여 300 ppm부터는 L-ascorbic acid와 유의한 차이가 없었다.
산수유 에탄올 추출물은 간암 세포와 자궁암 세포의 증식을 농도 의존적으로 억제하였다. 산수유 에탄올 추출물을 700 μg/plate 첨가 시 간암 세포와 자궁암 세포의 성장을 각각 83과 77.
8% 저해하였다. 산수유 에탄올 추출물은 두 가지 암세포 중에서 간암 세포인 Hep3B 세포에 대한 항암 활성이 더 큰 것으로 나타났다.
직접 돌연변이원은 세포내 DNA 정보 발현에 직접적으로 이상을 일으켜 돌연변이를 유발시키는 물질이다. 산수유 에탄올 추출물은 본 실험 농도인 0.5, 1, 5 mg/mL에서는 돌연변이를 유발하지 않았으나 (Table 1) sodium azide와 4-NQO와 같은 돌연변이원은 대조군에 비해 복귀돌연변이의 숫자를 유의하게 증가시켰다.
산수유 에탄올 추출물을 700 μg/plate 첨가 시 간암 세포와 자궁암 세포의 성장을 각각 83과 77.8% 저해하였다.
본 연구에서는 산수유 에탄올 추출물의 항산화능, 항돌연 변이 및 항암활성을 분석하여 새로운 생리활성 물질의 탐색과 고부가가치의 기능성식품으로서의 이용 가능성을 알아 보고자 하였다. 산수유 에탄올 추출물의 전자공여능은 농도 의존적으로 증가하여 500 ppm의 농도에서는 합성항산화제 인 BHT보다 높았고 천연항산화제인 L-ascorbic acid와 유사하였다. 뿐만 아니라, S.
3에 제시되어있다. 산수유 에탄올 추출물의 총 폴리페놀 함량은 34.22 mg/g이고 총 플라보노이드 함량은 5.67 mg/g으로 총 플라보노이드 함량보다 총 폴리페놀 함량이 6배 이상 높게 나타났다. Ju 등(29)의 연구 결과에서 산수유 열수추출물의 총 페놀화합물 함량은 2.
산수유 추출물 0.5, 1, 5 mg/mL 첨가 시 돌연변이 유발 저해효과는 각각 15%, 20%, 76.7%로 나타났다(Table 3).
산수유 추출물의 항돌연변이능은 DPPH 라디칼 소거능을 통해 나타난 강력한 항산화 활성의 결과와 잘 일치하므로, 산수유 에탄올 추출물은 자유라디칼에 의해 유도된 돌 연변이 유발을 감소시킬 수 있을 것으로 보인다.
또한 산수유 에탄올 추출물의 폴리페놀 함량은 황기, 구기자 및 작약 에탄올 추출물보다 높았으며 국화, 당귀 및 천궁 에탄올 추출물보다는 낮았다(30). 참 마, 오미자, 둥글레, 하수오, 황기 및 황정 열수 추출물의 플라보노이드 함량을 측정한 연구결과와 비교 시, 본 연구의 산수유 에탄올 추출물이 플라보노이드를 더 많이 함유하고 있는 것으로 나타났다(4).
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
합성 항산화제를 과량 섭취할 경우 발생하는 문제점은?
기존에 많이 사용되고 있는 항산화제로는 butylated hydroxyanisole(BHA), butylated hydroxytoluene(BHT)와 같은 합성 항산화제와 토코페롤과 같은 천연 항산화제가 있다. BHT와 BHA는 우수한 항산화력을 지니고 있지만 과량 섭취 시 암 유발 가능성 등 안전성이 논란이 되고 있으며, 토코 페롤은 가격이 높아 이들을 대체할 수 있는 안전하고 경제적 인 항산화제의 개발이 요구되고 있다(2). 이에 식품과학 분야에서는 천연 생물자원으로부터 항산화력이 우수한 물질을 탐색하는 연구가 활발히 행해지고 있으며, 나아가 이들 생리활성 소재를 추출하여 첨가한 기능성 식품의 개발에 대한 연구가 진행되고 있다(3).
산화적 스트레스를 제거하는 체내 시스템은?
최근 증가하고 있는 환경오염 물질, 환경 호르몬, 흡연 및 알코올 등은 인체 내 산화적 스트레스를 가중시키고 있다. 이러한 산화적 스트레스는 정상적인 경우에는 체내 항산화 시스템에 의해 제거되어진다. 그러나 체내 산화-항산화 시스템의 균형이 깨어지게 되면 지질의 과산화, 단백질의 변성, DNA의 손상 및 면역계 교란 등으로 인하여 여러 성인병, 노화 및 암이 유발될 수 있다.
체내 산화-항산화 시스템의 균형이 깨어지게 되면 어떤 변화가 발생하는가?
이러한 산화적 스트레스는 정상적인 경우에는 체내 항산화 시스템에 의해 제거되어진다. 그러나 체내 산화-항산화 시스템의 균형이 깨어지게 되면 지질의 과산화, 단백질의 변성, DNA의 손상 및 면역계 교란 등으로 인하여 여러 성인병, 노화 및 암이 유발될 수 있다. 따라서 산화적 스트레스를 억제하고 각종 질병과 노화로부터 예방하기 위하여 항산화제의 섭취에 대한 관심이 증가하고 있다(1).
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