한약재 70종의 메탄올 추출물을 이용하여 4종의 Staphylococcus epidermidis와 S. aureus에 대한 항균효과를 조사한 결과 모든 공시균주에 대하여 항균성을 나타내는 한약재는 황련, 소목, 오배자, 대황과 단삼으로 조사되었다. 이 중 우수한 항균성을 나타낸 오배자와 황련을 물, 에탄올, 메탄올과 에틸아세테이트를 추출 용매로 하여 추출물을 제조하고 항균성을 조사한 결과 황련 열수 추출물에서 가장 우수한 항균성을 확인할 수 있었다. 황련의 항균성은 berberine에 의한 것으로 가정하고 열수 추출물 중 berberine의 함량을 조사한 결과 13.88%로 조사되었다. Berberine에 의한 항균성과 다른 항생제와의 항균성을 비교하기 위하여 berberine chloride와 3종의 항생제를 이용하여 조사한 결과 600 mg/l 이상의 berberine chloride 농도에서 KCCM 35494 S. epidermidis에 대한 항균성만 나타내었으며 다른 공시균주에 대한 항균성은 확인되지 않았다. 이에 본 연구에 사용한 공시균주에 대한 C. japonica 열수 추출물의 항균성은 고 농도의 berberine 또는 다른 물질에 의한 것으로 판단할 수 있었으며 이 물질에 대한 연구가 필요할 것으로 판단되었다.
한약재 70종의 메탄올 추출물을 이용하여 4종의 Staphylococcus epidermidis와 S. aureus에 대한 항균효과를 조사한 결과 모든 공시균주에 대하여 항균성을 나타내는 한약재는 황련, 소목, 오배자, 대황과 단삼으로 조사되었다. 이 중 우수한 항균성을 나타낸 오배자와 황련을 물, 에탄올, 메탄올과 에틸아세테이트를 추출 용매로 하여 추출물을 제조하고 항균성을 조사한 결과 황련 열수 추출물에서 가장 우수한 항균성을 확인할 수 있었다. 황련의 항균성은 berberine에 의한 것으로 가정하고 열수 추출물 중 berberine의 함량을 조사한 결과 13.88%로 조사되었다. Berberine에 의한 항균성과 다른 항생제와의 항균성을 비교하기 위하여 berberine chloride와 3종의 항생제를 이용하여 조사한 결과 600 mg/l 이상의 berberine chloride 농도에서 KCCM 35494 S. epidermidis에 대한 항균성만 나타내었으며 다른 공시균주에 대한 항균성은 확인되지 않았다. 이에 본 연구에 사용한 공시균주에 대한 C. japonica 열수 추출물의 항균성은 고 농도의 berberine 또는 다른 물질에 의한 것으로 판단할 수 있었으며 이 물질에 대한 연구가 필요할 것으로 판단되었다.
The antibacterial activity of methanol extracts from 70 kinds of oriental medicinal herbs on four strains of Staphylococcus aureus and S. epidermidis was investigated. The results showed that C. japonica, C. sappan, R. javanica, R. tanguticum, and S. miltiorrhiza had an antibacterial activity on all...
The antibacterial activity of methanol extracts from 70 kinds of oriental medicinal herbs on four strains of Staphylococcus aureus and S. epidermidis was investigated. The results showed that C. japonica, C. sappan, R. javanica, R. tanguticum, and S. miltiorrhiza had an antibacterial activity on all the strains used. Among these, C. japonica and R. javanica, which showed excellent antibacterial activity, were extracted with water, ethanol, methanol, and ethyl acetate for further study of antibacterial activities. The results showed that the boiled water extract of C. japonica had the best antibacterial activity. Assuming that the antibacterial activity of C. japonica originated from berberine, which has been reported many times, the berberine content of the boiled water extract of C. japonica was analyzed and the result was 13.88%. To compare the antibacterial activity of berberine with that of other antibiotics, berberine chloride and three other kinds of antibiotics were investigated, which showed that berberine chloride had an antibacterial activity on KCCM 35494 S. epidermidis only when the concentration was higher than 600 mg/l, and it did not show antibacterial activity in the other strains. Based on these results, it was concluded that the antibacterial activity of the boiled water extract of C. japonica on the strains used in this study originated from high concentration of berberine or substances other than berberine. Therefore, identification of the substance will be necessary.
The antibacterial activity of methanol extracts from 70 kinds of oriental medicinal herbs on four strains of Staphylococcus aureus and S. epidermidis was investigated. The results showed that C. japonica, C. sappan, R. javanica, R. tanguticum, and S. miltiorrhiza had an antibacterial activity on all the strains used. Among these, C. japonica and R. javanica, which showed excellent antibacterial activity, were extracted with water, ethanol, methanol, and ethyl acetate for further study of antibacterial activities. The results showed that the boiled water extract of C. japonica had the best antibacterial activity. Assuming that the antibacterial activity of C. japonica originated from berberine, which has been reported many times, the berberine content of the boiled water extract of C. japonica was analyzed and the result was 13.88%. To compare the antibacterial activity of berberine with that of other antibiotics, berberine chloride and three other kinds of antibiotics were investigated, which showed that berberine chloride had an antibacterial activity on KCCM 35494 S. epidermidis only when the concentration was higher than 600 mg/l, and it did not show antibacterial activity in the other strains. Based on these results, it was concluded that the antibacterial activity of the boiled water extract of C. japonica on the strains used in this study originated from high concentration of berberine or substances other than berberine. Therefore, identification of the substance will be necessary.
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문제 정의
따라서, 본 연구에서는 한약재를 사용하여 피부 염증에 관여하는 Staphylococcus epidermidis와 S. aureus를 대상으로 항균 활성을 조사하고 그 결과를 보고하고자 한다.
피부 염증 유발 세균에 대한 한약재의 항균성을 조사하기 위하여 한의학 중 본초학을 바탕으로 문헌 조사를 진행하여 한약재를 선발하였다. 한약재의 구입은 대구시 수성구 상동 소재 대원약업사에서 생약제제로 포장되어 판매하는 제품을 사용하였으며 조사를 위한 추출물을 제조할 때 마다 구입하여 사용하였다(Table 1).
제안 방법
가장 우수한 항균성을 나타내는 한약재의 추출물과 CCARM 균주가 감수성을 가진다고 보고된 항생제 중 clindamycin hydrochloride (Sigma, USA), erythromycin (Sigma, USA)과 tetracycline (Sigma, USA)를 이용하여 항균성을 비교하였다.
각각의 한약재에 10배 량의 메탄올을 첨가하고 실온에서 3일간 정치하여 추출한 후 각각의 추출액을 여과(Filter paper No. 2, Whatman, Japan)하였다. 회수한 메탄올 추출액은 소형 회전농축기(Rotary evaporator, Eyela, Japan)로 농축하고 솔벤트 농축기(High throughput centrifugal evaporator, Genevac, UK)를 이용하여 잔존 용매를 제거한 다음 추출물을 준비하였다.
또한 Purifier®Biological Safety Cabinet (Labconco®, USA)를 사용하여 공시균의 접종 등의 과정을 수행하였다.
2 μm filter (Minisart RC 25, Sartorius, Germany)로 여과 하여 사용하였다. 물질의 확인은 표준품으로 농도구간을 설정하고 그 결과를 이용하여 검량선을 작성한 후 조사하였다(Table 3).
선발한 한약재 중 피부 염증 유발 세균에 대한 항균성을 나타내는 한약재를 선별하기 위하여 우선 메탄올 추출물을 제조하여 조사하였다.
선발한 한약재의 메탄올 추출물을 이용하여 피부 염증 유발 세균에 대한 항균성 조사의 결과를 바탕으로 양호한 항균성을 나타내는 한약재를 선별하고 물, 에탄올, 메탄올과 에틸아세테이트를 추출 용매로 하여 추출물을 제조하였다.
선발한 한약재의 항균성을 조사하기 위하여 메탄올 추출물을 이용한 선행조사를 수행하였으며 이 결과를 바탕으로 양호한 항균성을 나타내는 한약재를 선별하고, 선별한 한약재를 열수, 에탄올, 메탄올과 에틸아세테이트 추출물을 제조하여 조사하였다.
전배양액으로부터 회수하여 준비한 공시균주 현탁액 100 μl를 첨가하여 만든 고체배지에 각각의 메탄올 추출물 20 μl를 점적한 paper disc를 얹고 37℃에서 24시간 배양한 후 생육저지환의 생성 유․무를 관찰하였다.
한약재 추출물의 항균성을 조사하기 위하여 실험 하루 전 공시균을 접종하여 37℃, 24시간 배양하고 7,805× g에서 2분간 원심분리 하여 균체를 회수한 후 상등액을 제거하고 멸균수를 첨가하여 현탁 하였으며 잔존 배지성분과 공시균의 생육과정에서 세포 외로 방출되는 물질 등을 제거하고자 3번 반복하여 준비하였으며 1.5±0.5×108 cells/ml로 균수를 조정하여 사용하였다.
항균성은 한천평판확산법(Agar diffusion method)을 이용하여 조사하였으며 지름 6 mm paper disc (Advantec, Japan)에 각각의 추출물 20 μl를 점적한 후 무균상태에서 충분히 건조하여 추출용매에 의한 공시균주의 생육저해 가능성을 차단한 후 배양하여 조사하였다.
항균성이 가장 우수한 것으로 조사된 한약재가 함유하고 있는 물질의 분석은 UPLC (Ultra high performance liquid chromatography, Waters, USA)를 이용하였으며 사용 용매는 모두 특급을 사용하였다. 증류수는 탈이온 처리하였으며 사용 전 0.
대상 데이터
Table 2의 세균을 공시균주로 사용하였으며 한국미생물보존센터(KCCM, Korean Culture Center of Microorganisms)와 항생제 내성균주은행(CCARM, Culture Collection of Antimicrobial Resistant Microbes)에서 각각 분양 받아 사용하였다.
공시균의 배양을 위하여 KCCM 35494 Staphylococcus epidermidis는 Nutrient medium (0.3% beef extract, 0.5% peptone, pH 6.8, Becton, Dickinson and Company, USA)를 사용하였으며 CCARM 3708 S. aureus, CCARM 3709 S. epidermidis, CCARM 3710 S. epidermidis와 CCARM 3711 S. epidermidis는 Brain heart infusion medium (0.77% calf brains, 0.98% beef heart, 1.0% dextrose, 0.5% sodium chloride, 0.25% disodium phosphate, pH 7.4, Becton, Dickinson and Company, USA)를 사용하였다.
피부 염증 유발 세균에 대한 한약재의 항균성을 조사하기 위하여 한의학 중 본초학을 바탕으로 문헌 조사를 진행하여 한약재를 선발하였다. 한약재의 구입은 대구시 수성구 상동 소재 대원약업사에서 생약제제로 포장되어 판매하는 제품을 사용하였으며 조사를 위한 추출물을 제조할 때 마다 구입하여 사용하였다(Table 1).
성능/효과
선발한 한약재의 메탄올 추출물의 회수율은 Table 1과 같이 조사되었다. 70종의 한약재 중 산수유와 산사의 경우 120%이상의 회수율을 나타내었고 고추 외 7종의 경우 50% 이상의 회수율을 그리고 빈랑자 외 57종은 50% 미만의 회수율을 나타내었다. 특히 적소두와 녹두의 경우에는 0%로 조사되었으며 이는 회수율의 산정 시 소수점의 한 자리에서 반올림한 본 연구자의 계산법을 적용하지 않더라도 메탄올에 의하여 한약재의 성분 추출은 거의 일어나지 않았다.
Berberine에 의한 항균성을 확인하기 위하여 berberine chloride (Wako, Japan)를 이용하여 확인하였으며, 비교를 위하여 CCARM 균주가 감수성을 가진다고 알려진 3종의 항생제를 사용하여 100 mg/l의 농도로 표준품과 항생제를 준비하여 한천평판확산법으로 항균성을 조사한 결과 berberine에 의한 항균성을 확인할 수 없었다. 또한 clindamycin hydrochloride는 CCARM 3710 S.
epidermidis는 메탄올 추출물 중 황련, 소목, 황백, 오배자, 대황과 단삼에 의한 생육저지환이 형성되었으며, 이 중 황련(24 mm)과 오배자(22 mm) 추출물에서 가장 우수한 항균성을 나타내었다. CCARM 3708 S. aureus의 경우 황련, 소목, 오배자, 대황, 황금과 단삼에 의한 생육저지환이 형성되었으며, 황련 추출물에서 18 mm로 가장 우수한 항균성을 나타내었다. CCARM 3709 S.
aureus의 경우 황련, 소목, 오배자, 대황, 황금과 단삼에 의한 생육저지환이 형성되었으며, 황련 추출물에서 18 mm로 가장 우수한 항균성을 나타내었다. CCARM 3709 S. epidermidis는 소목, 황련, 목단피, 황백, 오배자, 대황, 단삼, 오미자와 측백엽에 의한 생육저지환이 형성되었으며, 황련 추출물에서 22 mm로 가장 우수한 항균성을 나타내었다.
CCARM 3710 S. epidermidis는 황련, 소목, 황백, 목단피, 오배자, 황금, 단삼과 측백엽에 의하여 생육저지환이 형성되었고, 황련 추출물에서 24 mm로 가장 우수한 항균성을 나타내었으며 CCARM 3711 S. epidermidis는 메탄올 추출물 중 황련, 소목, 황백, 황금, 오미자, 단삼, 오배자와 대황에 의한 생육저지환이 형성되었고, 황련 추출물에서 22 mm로 가장 우수한 항균성을 나타내었다. 소목의 경우 성분 중 brazillin에 의한 우수한 항균성을 나타낸다는 권 등[15] 의 보고와 유사한 결과를 확인할 수 있었으며, 황금의 경우 김 등[13]의 연구결과와 비교할 때 다양한 미생물에 대하여 우수한 항균성을 나타낸다고 보고되었으나 본 연구에서는 상대적으로 미비한 항균성을 나타내는 것으로 조사되었다.
공시균주에 대한 오배자 열수 추출물의 항균성은 KCCM 35494 S. epidermidis에 대하여 20 mm의 생육저지환을 형성하여 가장 우수한 항균성을 나타내었으나 CCARM 3708 S. aureus에 대하여 13 mm로 가장 낮은 항균성을 나타내었다.
전배양액으로부터 회수하여 준비한 공시균주 현탁액 100 μl를 첨가하여 만든 고체배지에 각각의 메탄올 추출물 20 μl를 점적한 paper disc를 얹고 37℃에서 24시간 배양한 후 생육저지환의 생성 유․무를 관찰하였다. 그 결과 KCCM 35494 S. epidermidis는 메탄올 추출물 중 황련, 소목, 황백, 오배자, 대황과 단삼에 의한 생육저지환이 형성되었으며, 이 중 황련(24 mm)과 오배자(22 mm) 추출물에서 가장 우수한 항균성을 나타내었다. CCARM 3708 S.
황련은 열수, 에탄올과 메탄올 추출물에서는 항균성을 나타내었으나 에틸아세테이트 추출물에서는 항균성을 나타내지 않는 것으로 조사되었으며 열수 추출물이 가장 우수한 항균성을 나타내는 것으로 조사되었다. 또한 메탄올 추출물도 열수 추출물과 거의 유사한 항균성을 나타내었고 에탄올 추출물의 경우에는 메탄올 추출물의 약 50% 수준의 항균성을 나타내는 것으로 조사되었다(Fig. 1A).
메탄올 추출물 중 한가지 이상의 공시균주에 대하여 항균성을 나타내는 한약재는 황련, 소목, 황백, 목단피, 오배자, 대황, 황금, 오미자, 단삼과 측백엽으로 조사되었으며 본 연구에서 사용한 공시균주 모두에 대하여 항균성을 나타내는 한약재는 황련, 소목, 오배자, 대황과 단삼으로 전체의 7.1%에 불과하였다(Table 4).
선별된 한약재의 용매별 추출물의 항균성은 황련 열수 추출물이 가장 우수한 것으로 조사되었으며 이에 피부 염증 유발 세균에 대한 항균효과가 가장 우수한 한약재로 황련을 최종 선별하였다.
이 결과는 황련 메탄올 추출물이 열수 추출물보다 항균성이 우수하였으며 berberine chloride를 사용하였을 때 메탄올 추출물보다 2배 높은 항균성을 나타내었다고 보고한 장 등[8]의 결과와 상이하였으나 사용한 균주의 차이로 인하여 직접적인 비교는 어려운 것으로 판단하였다.
이에 100 mg/l에서 1,000 mg/l의 농도로 각각 100 mg/l의 농도로 샘플을 준비하여 동일한 방법으로 항균성을 조사한 결과 CCARM 3710 S. epidermidis에 대한 clindamycin hydrochloride와 CCARM 3708 S. aureus와 CCARM 3710 S. epidermidis에 대한 erythromycine은 1,000 mg/l의 농도에서도 항균성을 나타내지 않는 것으로 조사되었다. Tetracycline의 경우에는 600 mg/l 이상의 농도에서 CCARM 3711 S.
epidermidis에 대한 항균성은 나타내었으나 다른 공시균주에 대한 항균성은 나타나지 않았다. 이에 황련 열수 추출물 중 berberine의 함량을 계산하여 1,000 mg/l이 되도록 조정한 후 berberine chloride와 비교한 결과 Fig. 3에서와 같이 거의 유사한 것으로 조사되어 황련 열수 추출물의 항균성이 berberine에 의한 것이라 판단할 수 있었다. 그러나 다른 공시균주에 대한 항균성이 확인되지 않는 것으로 미루어 볼 때 1,000 mg/l 이상의 농도에서 항균성을 나타내거나 또는 berbeine 이외 다른 물질에 의하여 항균성을 나타내는 것으로 판단하고 보다 더 연구를 진행하고자 한다.
오배자는 황련과는 달리 에틸아세테이트 추출물에서도 공시균주에 대한 항균성을 확인할 수 있었다. 추출물 중 열수 추출물에서 가장 우수한 항균성을 나타내었으며 황련의 결과와 같이 메탄올 추출물도 열수 추출물과 비교할 때 거의 유사한 수준의 항균성을 나타내었으며 에탄올 추출물의 경우에는 메탄올 추출물의 70-80% 수준의 항균성을 나타내는 것으로 조사되었다. 이 결과는 오배자의 메탄올 추출물의 다양한 분획을 이용하여 가축질병 균주에 대한 우수한 항균성을 확인하였다는 최[6]의 결과와 유사하였다.
항균성은 한천평판확산법(Agar diffusion method)을 이용하여 조사하였으며 지름 6 mm paper disc (Advantec, Japan)에 각각의 추출물 20 μl를 점적한 후 무균상태에서 충분히 건조하여 추출용매에 의한 공시균주의 생육저해 가능성을 차단한 후 배양하여 조사하였다. 추출물이 나타내는 항균성 여부는 공시균의 생육이 억제되면서 형성되는 생육저지환(Clear zone)의 크기로 확인하였으며 가장 우수한 항균성을 나타내는 한약재를 최종 선별하였다.
70종의 한약재 중 산수유와 산사의 경우 120%이상의 회수율을 나타내었고 고추 외 7종의 경우 50% 이상의 회수율을 그리고 빈랑자 외 57종은 50% 미만의 회수율을 나타내었다. 특히 적소두와 녹두의 경우에는 0%로 조사되었으며 이는 회수율의 산정 시 소수점의 한 자리에서 반올림한 본 연구자의 계산법을 적용하지 않더라도 메탄올에 의하여 한약재의 성분 추출은 거의 일어나지 않았다.
황련 열수 추출물의 항균성은 KCCM 35494 S. epidermidis에 대하여 28 mm의 생육저지환을 형성하여 가장 우수한 항균성을 나타내었으며, CCARM 3708 S. aureus에 대하여 15 mm로 가장 낮은 항균성을 나타내었다.
황련은 열수, 에탄올과 메탄올 추출물에서는 항균성을 나타내었으나 에틸아세테이트 추출물에서는 항균성을 나타내지 않는 것으로 조사되었으며 열수 추출물이 가장 우수한 항균성을 나타내는 것으로 조사되었다. 또한 메탄올 추출물도 열수 추출물과 거의 유사한 항균성을 나타내었고 에탄올 추출물의 경우에는 메탄올 추출물의 약 50% 수준의 항균성을 나타내는 것으로 조사되었다(Fig.
황련의 경우 함유하고 있는 berberine에 의한 항균성이 이미 많이 보고되어 있으며 이 결과를 이용하여 본 연구자들은 조사 결과가 berberine에 의한 것이라 가정하고 황련 추출물 중 berberine의 함량을 조사한 결과 표준품(25, 50, 100 mg/l)과 동일한 머무름 시간에서(6분) berberine peak를 확인할 수 있었으며 추출물의 berberine 함량은 13.88% (138.8 mg/g)로 조사되었다(Fig. 2).
후속연구
3에서와 같이 거의 유사한 것으로 조사되어 황련 열수 추출물의 항균성이 berberine에 의한 것이라 판단할 수 있었다. 그러나 다른 공시균주에 대한 항균성이 확인되지 않는 것으로 미루어 볼 때 1,000 mg/l 이상의 농도에서 항균성을 나타내거나 또는 berbeine 이외 다른 물질에 의하여 항균성을 나타내는 것으로 판단하고 보다 더 연구를 진행하고자 한다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
현재 사용되는 여드름의 약물치료의 방법은?
여드름의 약물치료는 피지 과잉생산 억제, 모낭벽의 과각화 방지, P. acnes의 증식억제 및 염증반응의 방지 측면에서 개발되고 있으며, 현재는 여드름이 있는 부위에 직접 발라주는 국소 요법제와 내복약을 통한 전신 요법이 사용되고 있다. 그러나, 현재 사용되고 있는 erythromycin, isotretinoin, benzoyl peroxide, vitamin A acid, triclosan 및 azelaic acid 등의 약물은 많은 부작용과 내성균주의 출현 등의 문제점이 보고되고 있다[10,21].
피부 상재균 중 피부에 염증을 유발할 수 있는 세균의 종류는?
본 연구자들도 한약재를 이용한 다양한 연구분야 중에서 피부 질환과 관련된 연구를 진행하고 있으며 특히 염증과 관련된 연구를 진행하고 있다. 일반적으로 피부 상재균 중 피부에 염증을 유발할 수 있는 세균으로는 Staphylococcus epidermidis, S. aureus, Streptococcus pyogenes 등이 보고되어 있으며, 특히 피부 여드름 유발 원인세균으로는 Propionibacterium acnes가 알려져 있다. 여드름의 약물치료는 피지 과잉생산 억제, 모낭벽의 과각화 방지, P.
한방 생약기술 및 다양한 약용 한방자원의 사용을 바탕으로 천연물 유래의 예방, 완화 및 치료제 개발하여 해결하고자 하는 기존 피부약의 문제점은?
acnes의 증식억제 및 염증반응의 방지 측면에서 개발되고 있으며, 현재는 여드름이 있는 부위에 직접 발라주는 국소 요법제와 내복약을 통한 전신 요법이 사용되고 있다. 그러나, 현재 사용되고 있는 erythromycin, isotretinoin, benzoyl peroxide, vitamin A acid, triclosan 및 azelaic acid 등의 약물은 많은 부작용과 내성균주의 출현 등의 문제점이 보고되고 있다[10,21].
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