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문제 정의
- 그러나 현재 연구되고 있는 항균효과는 주로 식품의 보존성을 높이기 위한 유해균에 대한 항균력에 집중되어 있고 질병에 대한 항균력 측정은 미미한 상태이다. 따라서 본 논문은 한약재를 이용하여 자주 발병하는 병원성 균주에 대한 항균력 검사를 실시하였다.
제안 방법
- 각 균주별 우수한 항균력을 가진 오배자, 소목, 오미자, 황금의 MeOH추출물의 활성성분에 대한 특성을 검토하고자 극성이 다른 유기용매인 n-hexane, CHCl3, EtOAc, n-BuOH, water를 순차적으로 분획하여 추출하였으며, 그 수율 측정 결과는 Table 5 같다.
- 즉, 각각의 추출물을 분획여두에서 극성을 달리하는 용매[n-hexane, CHCl3, EtOAc, n-butanol(BuOH), water]로 순차적으로 분획한 후 이 분획물을 45℃ 수욕 상에서 rotatory vacuum evaporator로 농축, 용매를 완전히 제거하였다. 각 용매별 농축물은 멸균한 DMSO용액을 용매로 하여 농도를 일정 하게 조절하여 각 균주별 항균활성을 측정하였다.
- 45 μm membrane filter로 여과한 다음 10 mL의 생육액체배지에 추출물의 soluble solid를 기준으로 하여 0, 100, 300 및 500 ppm 농도별로 첨가한 후 slant에서 배양된각 균주 1백금이를 취해 50 mL 생육액체배지에 접종하여 적정온도에서 24시간 동안 배양하였다. 배양액 2.5 mL을 취해 다시 50 mL 액체배지에 접종하여 배양한 후 활성화된 배양액 0.15 mL씩을 접종하여 각 균주의 생육적정온도에서 72시간까지 배양하면서 미생물의 생육정도를 12시간마다 UV spectrophotometer를 사용하여 660 nm에서 측정하였다. 흡광도 측정 시 각 생육액체배지를 blank로 사용하였다.
- 본 실험에 사용된 한약재 중에서 5 mg/mL 수준까지 항균활성이 나타난 MeOH추출물을 대상으로 병원성 미생물에 대해 12시간마다 농도별 즉, 0 ppm(control), 100 ppm, 300 ppm 및 500 ppm에 활성화된 균액을 첨가하여 미생물의 생육상태를 측정하였고, 그 결과는 Fig. 2부터 Fig. 7과 같다. 즉, 각 균주에 대해 한약재 추출물을 첨가하지 않은 대조구에서는 12시간 이후 급격한 균의 성장을 나타내고 있으나 그람양성균에 있어서 S.
- 본 연구에서 18종의 한약재추출물을 제조하여 병원성세균에 대한 한약재의 항균활성을 측정하였다. 오배자, 오미자 및 소목 메탄올 추출물은 대부분 균주에 대해 5 mg/mL 수준에서 항균활성을 나타냈으나 15여 종의 한약재추출물들은 30 mg/mL 수준에서 항균활성을 나타냈다.
- 시료 추출물의 조제는 각 한약재의 특정 부위를 대상으로 약재 300 g을 세절하거나 잘게 부수어 수직으로 환류냉각관을 부착시킨 round flask에 시료의 5배 정도의 MeOH(w/v)를 각각 첨가한 후, 80℃에서 5시간 동안 3회 환류 추출하였다. 추출액은 Whatman No.
- 여러 종류의 병원성 균주에 대하여 농도별 항균활성이 나타난 각 한약재의 MeOH추출물의 최소저해농도(MIC)를 추출물의 항균성 검색과 동일한 방법(paper disc agar diffusion)으로 측정하였고, 그 결과는 Table 4와 같다. S.
- 우수한 항균활성을 나타내는 한약재를 대상으로 MeOH 추출물을 얻은 후 Fig. 1과 같이 용매로 분획하였다. 즉, 각각의 추출물을 분획여두에서 극성을 달리하는 용매[n-hexane, CHCl3, EtOAc, n-butanol(BuOH), water]로 순차적으로 분획한 후 이 분획물을 45℃ 수욕 상에서 rotatory vacuum evaporator로 농축, 용매를 완전히 제거하였다.
- 우수한 항균활성을 나타내는 한약재를 대상으로 각각의 추출물을 0.45 μm membrane filter로 여과한 다음 10 mL의 생육액체배지에 추출물의 soluble solid를 기준으로 하여 0, 100, 300 및 500 ppm 농도별로 첨가한 후 slant에서 배양된각 균주 1백금이를 취해 50 mL 생육액체배지에 접종하여 적정온도에서 24시간 동안 배양하였다.
- 우수한 항균활성을 나타내는 한약재를 대상으로 용매 분획한 후 soluble solid 함량을 적용하여 각 분획물을 3% 농도로 조정 후 각 균주별로 한천배지 확산법으로 측정하여 항균활성을 측정하였다.
- 시료 추출물의 조제는 각 한약재의 특정 부위를 대상으로 약재 300 g을 세절하거나 잘게 부수어 수직으로 환류냉각관을 부착시킨 round flask에 시료의 5배 정도의 MeOH(w/v)를 각각 첨가한 후, 80℃에서 5시간 동안 3회 환류 추출하였다. 추출액은 Whatman No.2 여과지로 2회 여과한 후 rotatory vacuum evaporator로 감압 농축하였으며 최종적으로 각각의 농축물은 멸균한 DMSO(dimethylsulfoxide)용액을 용매로 하여 5 mg/mL, 10 mg/mL, 30 mg/mL 및 50 mg/mL로 희석하여 사용하였다.
- 한약재 18종에 대한 MeOH추출물의 균별 항균력을 조사하기 위해 각각의 추출물을 5 mg/mL, 10 mg/mL, 30 mg/mL 및 50 mg/mL로 희석하여 paper disc agar diffusion 법으로 clear zone을 확인하였고, 그 결과는 Table 3과 같다. 오배자 추출물은 Gram positive bacteria 3종, Gram negative bacteria 7종의 대부분 균주에 대해 5 mg/mL 수준에서 모두 항균활성을 나타내었고 특히 S.
- 우수한 항균활성이 확인된 오배자, 소목, 오미자, 황금을 대상으로 극성이 다른 5가지 용매로 순차 분획하여 항균활성을 검토한 결과 대부분의 균주에서 EtOAc층이 다른 분획층에 비해 성장억제효과가 높게 나타났다. 항균력이 우수한 한약재추출물의 미생물 증식억제 효과를 조사하기 위해 증식배지에 0, 100, 300 및 500 ppm의 메탄올 추출물을 첨가하였다. 한약재 추출물을 첨가하지 않은 대조구에서는 12시간 이후 급격한 균의 성장을 나타내고 있으나 오배자와 소목추출물의 첨가 농도가 높을수록 그람양성균인 S.
- 항균활성이 나타난 한약재의 최소 저해농도 측정은 한천 배지 확산법(paper disc agar diffusion)을 이용하였고, 측정 농축물을 membrane filter(0.45 μm)로 제균 시키고, plate에 활성화된 배양액 0.2 mL를 접종하여 soluble solid 함량을 기준으로 하여 0.2 mg/mL 간격으로 0.2 mg/mL에서 50 mg/ mL까지의 범위 내에서 plate에 접종하여 각 균주의 적정온도에서 24시간 배양한 후 육안으로 관찰하여 미생물이 증식되지 않는 농도를 MIC로 결정하였다.
대상 데이터
- 본 항균활성 실험에 사용한 한약재는 방약합편(9), 식물도감(7)에서 항균, 항진균 작용을 가지고 있는 것으로 예상되는 약재를 참고하여 선정하였고, 실험에 사용한 약재는 건조 상태가 좋은 것을 구입하여(강원도 원주시 천일건재상) 상지대학교 생약학실에서 분류한 후 건냉한 장소에 보관하여 사용하였다. 약재명과 사용부위는 Table 1과 같다.
이론/모형
- 항균력 검색에 사용한 균주는 평판배지에 배양된 균주 2～3 백금이를 취해 10 mL nutrient broth의 균 생육 액체배지에 접종하고 37℃에서 24시간 배양하여 활성화시킨 후 시험균액 0.2 mL를 무균적으로 첨가하여 기층용 배지위에 고르게 펴지도록 멸균된 유리막대로 도포한 뒤 Piddok(20)의 paper disc에 의한 한천배지 확산법(disc plate method)으로 측정하였다.
성능/효과
- Gallinarum 및 Sal. Choleraesuis를 제외한 균주에서 각 분획물에 대한 항균성이 나타났으며, S. aureus와 S. epidermidis에서 MeOH추출물의 모든 분획층에서 활성을 나타냈고, EtOAc 층이 가장 높은 활성을 나타냈다.
- Choleraesuis는 오배자추출물에서 성장저해효과가 나타났고 Bor. bronchiseptica, E. coli serotype O8은 오배자와 소목에서 낮은 농도의 추출물에서도 다소 생육이 저해되었음을 보여주었고, 농도가 높을수록 균의 성장이 강하게 억제되는 것을 확인할 수있었다.
- Choleraesuis의 성장을 저해하였고 Bor. bronchiseptica, E. coli serotype O8은 오배자와 소목추출물은 낮은 농도에서 성장이 다소 저해되었음을 보여주었고, 추출물의 농도가 높을수록 균의 성장이 강하게 억제되었다.
- 오배자의 경우 5가지 용매 분획물 중 n-hexane을 제외한 다른 용매에 대하여 대부분 항균활성이 나타났으며, MeOH 추출물의 EtOAc층이 Bor. bronchiseptica에서 23.7 mm로 가장 높았으며, 대부분의 균주에서 EtOAc층이 다른 분획층에 비해 성장억제효과가 높게 나타났다. 소목의 경우 C.
- 0%로 가장 높았으며, 오미자의 경우 water층, 황금의 경우 n-hexane층과 n-BuOH층에서 가장 높게 나타났다. 반면에 CHCl3에 의한 추출수율이 4종의 한약재에 대해 가장 낮은 추출수율로 나타났다.
- monocytogenes의 경우 5 mg/mL 수준에서 비교해 볼 때 17 mm 와 18 mm로 가장 큰 clear zone을 나타냈다. 오미자와 소목 추출물이 많은 균주에서 5 mg/mL 수준에서 항균성을 나타냈으며 13여 종의 한약재들이 30 mg/mL 수준에서 항균성을 보여주고 있다. Lee 등(21)은 오배자 등 민간 생약재와 포도 과피 추출물의 항균활성에 대하여 조사한 결과 MeOH추출물은 B.
- 오미자와 황금의 경우도 마찬가지로 항균활성이 나타난 균주에 대해서는 5가지 용매 분획충 중에서 EtOAc층이 가장 높은 항균활성이 나타났다. Jung 등(24)은 오미자 종자 추출용매별 항균효과에서 모든 시험 균에 전반적으로 강한 항균활성을 나타내는 MeOH추출물을 이용하여 분획한 결과 물 분획물에서 대체적으로 항균활성이 낮았으며 S.
- 한약재 18종에 대한 MeOH추출물의 균별 항균력을 조사하기 위해 각각의 추출물을 5 mg/mL, 10 mg/mL, 30 mg/mL 및 50 mg/mL로 희석하여 paper disc agar diffusion 법으로 clear zone을 확인하였고, 그 결과는 Table 3과 같다. 오배자 추출물은 Gram positive bacteria 3종, Gram negative bacteria 7종의 대부분 균주에 대해 5 mg/mL 수준에서 모두 항균활성을 나타내었고 특히 S. epidermidis와 L. monocytogenes의 경우 5 mg/mL 수준에서 비교해 볼 때 17 mm 와 18 mm로 가장 큰 clear zone을 나타냈다. 오미자와 소목 추출물이 많은 균주에서 5 mg/mL 수준에서 항균성을 나타냈으며 13여 종의 한약재들이 30 mg/mL 수준에서 항균성을 보여주고 있다.
- 오배자, 소목의 경우 MeOH추출물에서 EtOAc에 의한 추출수율이 71.9%와 62.0%로 가장 높았으며, 오미자의 경우 water층, 황금의 경우 n-hexane층과 n-BuOH층에서 가장 높게 나타났다. 반면에 CHCl3에 의한 추출수율이 4종의 한약재에 대해 가장 낮은 추출수율로 나타났다.
- albicans에서 황금 26 mg/mL를 나타냈다. 오배자의경우 농도별 항균활성을 측정한 결과 S. epidermidis와 L. monocytogenes에서 MeOH추출물이 5 mg/mL 수준에서 17 mm와 18 mm로 가장 큰 clear zone을 나타냈지만, 최소저해 농도는 S. epidermidis와 Bor. bronchiseptica가 0.
- 6 mg/mL로 나타났다. 우수한 항균활성이 확인된 오배자, 소목, 오미자, 황금을 대상으로 극성이 다른 5가지 용매로 순차 분획하여 항균활성을 검토한 결과 대부분의 균주에서 EtOAc층이 다른 분획층에 비해 성장억제효과가 높게 나타났다. 항균력이 우수한 한약재추출물의 미생물 증식억제 효과를 조사하기 위해 증식배지에 0, 100, 300 및 500 ppm의 메탄올 추출물을 첨가하였다.
- 7과 같다. 즉, 각 균주에 대해 한약재 추출물을 첨가하지 않은 대조구에서는 12시간 이후 급격한 균의 성장을 나타내고 있으나 그람양성균에 있어서 S. aureus의 경우 오배자, 소목 및 황금추출물에서 첨가 농도가 높을수록 뚜렷한 억제효과를 보였으며, S. epidermidis의 경우 오배자와 소목, L. monocytogenes에서 오배자, 소목에서 생육억제효과를 나타냈다.
- 항균력이 우수한 한약재추출물의 미생물 증식억제 효과를 조사하기 위해 증식배지에 0, 100, 300 및 500 ppm의 메탄올 추출물을 첨가하였다. 한약재 추출물을 첨가하지 않은 대조구에서는 12시간 이후 급격한 균의 성장을 나타내고 있으나 오배자와 소목추출물의 첨가 농도가 높을수록 그람양성균인 S. aureus, S. epidermidis 및 L. monocytogenes는 뚜렷한 억제효과를 나타냈다. 오배자추출물은 그람음성균인 Sal.
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