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문제 정의
- 결론적으로 본 연구에서는 추출 용매별 니아울리 잎의 분획별 추출물을 제조하고 이들 추출물의 수율과 항균활성을 조사하였다. 이 중 가장 우수한 추출 분획은 50% 에탄올 추출물과 물 분획임을 확인하였다.
- 본 연구에서는 니아울리 잎 추출물을 화장품의 소재로 이용할 목적으로, 항균활성이 높은 추출물을 얻기 위한 추출 분획 조건을 확립하였고 각각의 조건별 추출물에 대하여 추출 수율 및 항균활성을 측정하였다.
- 따라서 본 연구에서는 니아울리 잎 추출물/분획에 대한 항균활성을 측정하였고, 니아울리 잎 추출물에 우수한 항균활성이 있음을 확인하였다. 이 연구를 통하여 니아울리 잎 추출물이 화장품 및 식품 산업에서 합성 방부제를 대체할 수 있는 천연 방부제로써 이용 가능성이 있는지를 검토하고자 하였다.
제안 방법
- , Tokyo, Japan)에 시료를 천천히 흡수시켜 도말한 평판배지 위에 밀착시킨 상태로 배양하였다. 24 - 48 h 배양 후 disc 주변에 생성된 저해환(clear zone, mm)의 직경을 측정하여 항균활성을 비교하였다.
- 3) Disc diffusion assay에서 가장 우수한 항균효과를 보였던 니아울리의 50% 에탄올 추출물과 물 분획에 대하여 성장 억제의 경향성을 확인하기 위해 MIC와 MBC를 수행하였다. 에탄올 추출물과 물 분획은 농도의존적으로 콜로니가 감소하였다.
- Disc diffusion assay에서 가장 우수한 항균효과를 보였던 니아울리의 50% 에탄올 추출물과 물 분획(50%에탄올 추출물로부터 분획함)에 대하여 성장 억제의 경향성을 확인하기 위해 MIC와 MBC를 수행하였으며, 측정 결과는 Table 4와 같다. 에탄올 추출물과 물 분획의 농도가 증가함에 따라 콜로니가 농도 의존적으로 감소하는 것을 알 수 있었으며, 이로부터 세균의 최소살균농도인 MBC를 확인하였다.
- 위의 세균 배양액에서 10 µL를 취하여 시료를 고농도로 2배 희석 후 배양하여 한천배지에 도말하였다. S. aureus, B. subtilis, E. coli 및 P. aeruginosa의경우 37 ℃에서 24 h, P. acnes는 48 h, 30 ℃에서 P. ovale는 24 h 배양한 뒤 형성된 콜로니를 확인하여 평판 배지 상에서 집락이 형성되지 않은 최소 농도를 MBC 로 결정하였다. 음성 대조군으로는 DMSO를, 양성 대조군으로는 메틸 파라벤과 프로필 파라벤을 사용하였다.
- 각각의 시료 농도로 처리된 세균 및 진균들을 시료가 없는 평판배지에 100 µL씩 취하여도말하여 배양 후 plate count method로 생성된 콜로니 (colony)를 계수하여 육안으로 확인하였을 때 집락을 형성하지 않는 well의 농도 중 최소 농도를 MIC로 결정하였다.
- 대조군으로는 합성 방부제인 메틸 파라벤, 프로필 파라벤을 사용하였으며, 평판배지에 각각의 배양 균주를 접종하여 멸균 면봉을 이용하여 100 µL씩 균일하게 도말하여 건조시켰다. 시료는 disc 당 0.5, 1.5, 2.5 mg/disc로 농도를 달리하여 추출물 분획 파우더는 DMSO에 에센셜 오일은 에탄올에 용해하였으며, 멸균 paper disc (diameter 8 mm, Roshi kaisha. Ltd., Tokyo, Japan)에 시료를 천천히 흡수시켜 도말한 평판배지 위에 밀착시킨 상태로 배양하였다. 24 - 48 h 배양 후 disc 주변에 생성된 저해환(clear zone, mm)의 직경을 측정하여 항균활성을 비교하였다.
- 시험 균주들은 2배 희석법을 이용하여 단계별로 희석된 시료(0.016 ~ 4%)를 함유한 각각의 배지에 106 ∼ 107 CFU/mL가 되도록 희석 하여 96-well plate에 접종한 후 30 ~ 37 ℃의 배양기에서 배양하였다.
대상 데이터
- 피부 상재균을 50% 에탄올 추출물과 물 분획에 노출시킨 후 추출물 농도별 CFU의 변화를 Figure 2에 나타내었다. Figure 2에서와 같이, 비교물질로는 메틸 파라벤과 프로필 파라벤을 사용하였다. 프로필 파라벤의 경우 P.
- P. acnes는 배양 배지에 접종 후 anaerobic jar에서 Gaspack system (Merck Anaerocult®Gaspacksystem, Germany)을 사용하여 밀봉하여 혐기성 정지 배양하였으며, S. aureus, B. subtilis, E. coli 및 P. aeruginosa와 효모균인 P. ovale은 진탕 배양하여 사용하였다.
- 대조군으로는 합성 방부제인 메틸 파라벤, 프로필 파라벤을 사용하였으며, 평판배지에 각각의 배양 균주를 접종하여 멸균 면봉을 이용하여 100 µL씩 균일하게 도말하여 건조시켰다.
- 본 연구에 사용된 균주는 피부 상재균으로써, 그람양성균주 3종, 그람 음성균주 2종 및 효모균 1종으로총 6종의 균주이다. 여드름 원인균인 혐기성 그람 양성 균주 P.
- 본 연구에서 실험 재료로 사용한 건조된 니아울리 잎과 잎에서 추출한 에센셜 오일은 코스메칼코리아에서 제공 받았다. 이 니아울리 잎은 뉴칼레도니아(New Caledonia)에서 자생하는 니아울리 잎을 채취하여 건조시킨 것이다.
- 이 니아울리 잎은 뉴칼레도니아(New Caledonia)에서 자생하는 니아울리 잎을 채취하여 건조시킨 것이다. 에탄올, 에틸아세테이트, 헥산, dimethyl sulfoxide 등 각종 용매는 시판 특급 시약을 사용하였고, 항균활성 비교물질로 사용한 화장품 방부제인 메틸 파라벤, 프로필 파라벤은 Sigma Chemical Co. (USA)에서 구입하여 사용하였다.
- 본 연구에 사용된 균주는 피부 상재균으로써, 그람양성균주 3종, 그람 음성균주 2종 및 효모균 1종으로총 6종의 균주이다. 여드름 원인균인 혐기성 그람 양성 균주 P. acnes (ATCC 6919)와 비듬균인 P. ovale (ATCC12078), 호기성 그람 양성균주인 S. aureus (ATCC 6538), B. subtilis (ATCC19659), 호기성 그람음성균주인 E. coli (ATCC 23736), P. aeruginosa (ATCC29336)를 한국 미생물 보존센터(KCCM)에서 분양 받아 사용하였다. 배양 조건은 Table 1에 나타내었다.
- ovale는 24 h 배양한 뒤 형성된 콜로니를 확인하여 평판 배지 상에서 집락이 형성되지 않은 최소 농도를 MBC 로 결정하였다. 음성 대조군으로는 DMSO를, 양성 대조군으로는 메틸 파라벤과 프로필 파라벤을 사용하였다.
이론/모형
- MIC와 MBC 측정은 Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI)에서 제시한 미세희석(micro-dilution)법을 이용하여 실시하였다. 시험 균주들은 2배 희석법을 이용하여 단계별로 희석된 시료(0.
- 니아울리 잎 추출물의 항균력 시험은 시험 균주를 대상으로 disc diffusion assay를 실시하였다. 대조군으로는 합성 방부제인 메틸 파라벤, 프로필 파라벤을 사용하였으며, 평판배지에 각각의 배양 균주를 접종하여 멸균 면봉을 이용하여 100 µL씩 균일하게 도말하여 건조시켰다.
- 추출/분획물에 대한 항균효과를 조사하기 위하여 니아울리 잎 50% 에탄올 추출물, 50% 에탄올 추출물로부터 에틸아세테이트, 헥산 및 물 분획을 얻고, 이들 추출/분획물들에 대한 항균활성을 paper disc method로 측정하였다. 그 결과를 Table 3에 나타내었다.
성능/효과
- 1) 니아울리 잎 추출물의 추출 분획별 추출 수율은 각각 50% 에탄올 추출물의 추출 수율 30.91%, 에틸아세테이트 분획 2.47%, 헥산 분획 1.08%, 물 분획 9.35%이었다. 또한 에틸아세테이트 분획을 산가수분해 시켜서 당을 제거한 아글리콘의 수득률은 1.
- 2) Disc diffusion assay에서 니아울리의 에센셜 오일을 제외한 모든 추출물과 분획물들은 모두 황색포도상구균(S. aureus)에 대해서 대조군인 메틸 파라벤과 프로필 파라벤과 비교할 때 큰 항균활성을 나타내었다. 추출물/분획 중에서 50% 에탄올 추출물과 물 분획만이 P.
- 이러한 결과는 일반적으로 프로필 파라벤이 메틸파라벤보다 항균력이 높다는 보고와도 일치한다[16]. 50% 에탄올 추출물과 물 분획의 최소살균농도를 비교해보면, P. acnes을 제외한 모든 피부 상재균에서 물 분획이 50% 에탄올 추출물보다 항균활성이 높음을 보여주고 있다. 특히 P.
- 에탄올 추출물과 물 분획은 농도의존적으로 콜로니가 감소하였다. 50% 에탄올 추출물과 물 분획의 최소살균농도를 비교해보면, P. acnes을 제외한 모든 피부 상재균에서 물 분획이 50% 에탄올 추출물보다 항균활성이 높음을 보여주었다. S.
- 91%이었다. 50% 에탄올로 추출한 것을 헥산으로 비극성 물질을 완전히 제거한 뒤 에틸아세테이트로 분획하여 추출하였으며, 수득률은 각각 에틸아세테이트분획 2.47%, 헥산 분획 1.08%, 물 분획 9.35%이었다. 에틸아세테이트 분획을 산가수분해 시켜서 당을 제거한 아글리콘의 수득률은 1.
- ovale)에 대한 50% 에탄올 추출물과물 분획의 항균활성이 실험한 농도 범위에서 나타나지 않는 것을 확인하였다(Figure 2 및 Table 4에 표시 하지 않았음). S. aureus에 대한 항균활성이 가장 큰 물 분획의 경우 최소살균농도(MBC)는 0.25%였으며, S. aureus 및 B. subtilis에 대한 니아울리 잎 추출물의 물 분획의 항균활성은 메틸 파라벤보다 2배 우수한 것으로 나타났고, E. coli와 P. aeruginosa에 대한 최소살균 농도(MBC)는 물 분획과 메틸 파라벤이 동일 하였다.
- ovale)에 대한 50% 에탄올 추출물과물 분획의 항균활성이 실험한 농도 범위에서 나타나지 않는 것을 확인하였다(Figure 2 및 Table 4에 표시 하지 않았음). S. aureus에 대한 항균활성이 가장 큰 물 분획의 경우 최소살균농도(MBC)는 0.25%였으며, S. aureus 및 B. subtilis에 대한 니아울리 잎 추출물의 물 분획의 항균활성은 메틸 파라벤보다 2배 우수한 것으로 나타났고, E. coli와 P. aeruginosa에 대한 최소살균 농도(MBC)는 물 분획과 메틸 파라벤이 동일 하였다.
- 결과적으로 니아울리 잎 추출물의 피부 상재균에 대한 항균활성 실험 결과 물 분획에서 감수성이 뛰어난 것을 확인하였다. 또한 그람 양성균보다는 그람 음성균에 대한 MIC 값이 낮은 것으로 볼 때 이러한 감수성의 차이는 세균의 종류에 따른 니아울리 잎의 항균 성분에 대한 저항성에 차이일 것으로 사료된다.
- 극성도가 다른 추출 용매로 사용된 에탄올, 에틸아세테이트, 헥산, 물, 아글리콘 및 에센셜 오일에 대한 항균활성을 비교한 결과, 50% 에탄올 추출물과 물 분 획에서 뚜렷한 항균력을 보였다. 니아울리의 에센셜오일이 일부 항균활성을 나타낸다는 보고가 있지만, 본 연구에서 니아울리 잎 추출물/분획의 피부 상재균에 대한 항균 실험 결과, 추출물 중 헥산 분획 및 아글리콘 분획과 니아울리 에센셜 오일에서는 항균력을 보이지 않았다.
- 그 결과를 Table 3에 나타내었다. 니아울리의 에센셜 오일을 제외한 모든 추출물과 분획물들은 모두 황색포도상구균(S. aureus)에 대해서 대조군인 메틸 파라벤과 프로필 파라벤과 비교할 때 큰 항균활성을 나타내었다. 효모균인 비듬균(P.
- 극성도가 다른 추출 용매로 사용된 에탄올, 에틸아세테이트, 헥산, 물, 아글리콘 및 에센셜 오일에 대한 항균활성을 비교한 결과, 50% 에탄올 추출물과 물 분 획에서 뚜렷한 항균력을 보였다. 니아울리의 에센셜오일이 일부 항균활성을 나타낸다는 보고가 있지만, 본 연구에서 니아울리 잎 추출물/분획의 피부 상재균에 대한 항균 실험 결과, 추출물 중 헥산 분획 및 아글리콘 분획과 니아울리 에센셜 오일에서는 항균력을 보이지 않았다. 본 연구에 앞선 선행연구에서 85% 에탄올 추출물과 50% 에탄올 추출물을 disc diffusion assay로 비교했을 때 50% 에탄올 추출물에서 보다 더 우수한 효과를 나타냈다.
- 그러나 니아울리 오일이 아닌 잎 추출물 또는 분획의 피부 상재균에 대한 항균활성이나 항산화 활성 및 성분 분석에 대한 연구는 매우 미흡한 실정이다[15]. 따라서 본 연구에서는 니아울리 잎 추출물/분획에 대한 항균활성을 측정하였고, 니아울리 잎 추출물에 우수한 항균활성이 있음을 확인하였다. 이 연구를 통하여 니아울리 잎 추출물이 화장품 및 식품 산업에서 합성 방부제를 대체할 수 있는 천연 방부제로써 이용 가능성이 있는지를 검토하고자 하였다.
- aureus을 제외하고는 항균활성이 전혀 나타나지 않았다. 본 실험에서 니아울리 잎에서 추출한 에센셜 오일(코스메칼 코리아에서 제공받음)은 3, 6, 13, 25, 50% 농도에서 피부상재균에 대해 항균력을 나타내지 않았다. Wilkinson 등(2005)은 disc diffusion assay를 이용해서, 오스트레일리아에서 자생한 니아울리(M.
- 본 연구에 앞선 선행연구에서 85% 에탄올 추출물과 50% 에탄올 추출물을 disc diffusion assay로 비교했을 때 50% 에탄올 추출물에서 보다 더 우수한 효과를 나타냈다.
- Disc diffusion assay에서 가장 우수한 항균효과를 보였던 니아울리의 50% 에탄올 추출물과 물 분획(50%에탄올 추출물로부터 분획함)에 대하여 성장 억제의 경향성을 확인하기 위해 MIC와 MBC를 수행하였으며, 측정 결과는 Table 4와 같다. 에탄올 추출물과 물 분획의 농도가 증가함에 따라 콜로니가 농도 의존적으로 감소하는 것을 알 수 있었으며, 이로부터 세균의 최소살균농도인 MBC를 확인하였다. 피부 상재균을 50% 에탄올 추출물과 물 분획에 노출시킨 후 추출물 농도별 CFU의 변화를 Figure 2에 나타내었다.
- quinquenervia)로부터 얻은 에션셜 오일의 항균활성을 보고하였다[12]. 이 논문에서 에션셜 오일의 농도가 100%일 때 E. coli, S. aureus, C. albicans 및 Alcaligenes faecalis (A. faecalis)에 대해서 약간의 항균활성을 보였으며 10%의 농도에서는 이들 균에 대하여 항균활성을 거의 나타내지 않았음을 보고하였다. 저자들의 연구에서도 에션셜 오일은 피부 상재균에 대하여 항균활성을 보이지 않 았다.
- 결론적으로 본 연구에서는 추출 용매별 니아울리 잎의 분획별 추출물을 제조하고 이들 추출물의 수율과 항균활성을 조사하였다. 이 중 가장 우수한 추출 분획은 50% 에탄올 추출물과 물 분획임을 확인하였다. 50% 에탄올 추출물과 물 분획물은 천연 방부제로서 화장품에서 파라벤류를 대체할 수 있는 가능성을 기대할 수 있을 것으로 보인다.
- 50% 에탄올 추출물 또는 그 활성 성분은 여드름 피부 트러블을 완화시키는 소재로서 응용 가능성이 있을 것으로 사료된다. 저자들은 비듬균(P. ovale)에 대한 50% 에탄올 추출물과물 분획의 항균활성이 실험한 농도 범위에서 나타나지 않는 것을 확인하였다(Figure 2 및 Table 4에 표시 하지 않았음). S.
- ovale에 항균활성을 나타냈다. 추출물/분획 중에서 50% 에탄올 추출물과 물 분획만이 P. ovale을 제외한 모든 피부 상재균에서 큰 항균활성을 나타내었다. 하지만 실험한 농도에서 에틸아세테이트, 헥산, 아글리콘 분획은 S.
- 30%이었다. 특히 50% 에탄올 추출물이 매우 높은 수율을 나타냈으며, 이어 물 분획에서 높은 수율을 나타내었다.
후속연구
- acnes에 대하여 물 분획보다도 높은 항균활성을 보인 50% 에탄올 추출물에 대해서는 추가적인 성분 분석 연구가 필요한 것으로 보인다. 50% 에탄올 추출물 또는 그 활성 성분은 여드름 피부 트러블을 완화시키는 소재로서 응용 가능성이 있을 것으로 사료된다. 저자들은 비듬균(P.
- 이 중 가장 우수한 추출 분획은 50% 에탄올 추출물과 물 분획임을 확인하였다. 50% 에탄올 추출물과 물 분획물은 천연 방부제로서 화장품에서 파라벤류를 대체할 수 있는 가능성을 기대할 수 있을 것으로 보인다.
- 또한 그람 양성균보다는 그람 음성균에 대한 MIC 값이 낮은 것으로 볼 때 이러한 감수성의 차이는 세균의 종류에 따른 니아울리 잎의 항균 성분에 대한 저항성에 차이일 것으로 사료된다. 그람 양성균과 그람 음성균은 세포벽의 구성 및 그 두께가 다르므로 감수성에도 차이가 발생할 것으로 추정되나, 니아울리 잎 추출물의 그 밖의 효능과 항균 작용 메커니즘을 밝히기 위해 항균 작용 성분을 규명하기 위한 추가적인 연구가 필요할 것으로 판단된다. 최근 천연물의 항균 활성에 관한 연구가 매우 활발히 이루어지고 있는데, 니아울리 잎 추출물이 현재 사용되고 있는 방부제와 동등 또는 그 이상의 활성을 나타내기 때문에 천연 방부제 및 항균제로서의 역할을 충분히 발휘할 것으로 사료된다.
- acnes을 제외한 모든 피부 상재균에서 물 분획이 50% 에탄올 추출물보다 항균활성이 높음을 보여주고 있다. 특히 P. acnes에 대하여 물 분획보다도 높은 항균활성을 보인 50% 에탄올 추출물에 대해서는 추가적인 성분 분석 연구가 필요한 것으로 보인다. 50% 에탄올 추출물 또는 그 활성 성분은 여드름 피부 트러블을 완화시키는 소재로서 응용 가능성이 있을 것으로 사료된다.
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