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문제 정의
- 마늘은 강력한 항산화 효과로 인해 혈액 순환을 촉진하고 피부의 탄력성을 부여하는 기능이 있어 기능성 화장품 소재로의 가능성을 보이고 있다(6,13). 따라서 본 연구는 국내에서 생산되는 토종 마늘을 이용하여 개선된 마늘 형태인 흑마늘을 제조하고 이를 함유한 기능성 화장품에 대한 연구를 통해 한국인의 피부에 맞는 고기능성 제품을 개발하는데 있어 기초 자료를 마련하고자 실시되었다. 이에 본 연구에서는 흑마늘 추출물의 기능성 화장품 소재화 가능성을 in vitro에서 tyrosinase와 elastase의 저해 활성을 측정하여 미백과 피부 탄력성에 관련된 기능성을 평가하고, 기능성 화장품에 있어 가장 중요한 부분인 피부 안전성 시험을 자극에 의한 반응이 사람 피부와 유사한 guinea pig를 이용하여 1차 피부자극 시험 및 감작성 시험을 실시하여 화장품 소재로서의 흑마늘의 피부 안전성을 평가하고자 한다.
- 본 연구는 흑마늘을 기능성 화장품 소재로 활용하기 위하여 그 기능성을 in vitro에서 tyrosinase 및 elastase 저해 활성을 측정한 결과 피부노화에 관여하는 두 효소의 활성을 모두 저해하였다. 흑마늘 추출물을 hartley계 기니픽 수컷을 사용하여 피부 1차 자극 실험을 실시한 결과 1차 피부자극지수(P.
- 따라서 본 연구는 국내에서 생산되는 토종 마늘을 이용하여 개선된 마늘 형태인 흑마늘을 제조하고 이를 함유한 기능성 화장품에 대한 연구를 통해 한국인의 피부에 맞는 고기능성 제품을 개발하는데 있어 기초 자료를 마련하고자 실시되었다. 이에 본 연구에서는 흑마늘 추출물의 기능성 화장품 소재화 가능성을 in vitro에서 tyrosinase와 elastase의 저해 활성을 측정하여 미백과 피부 탄력성에 관련된 기능성을 평가하고, 기능성 화장품에 있어 가장 중요한 부분인 피부 안전성 시험을 자극에 의한 반응이 사람 피부와 유사한 guinea pig를 이용하여 1차 피부자극 시험 및 감작성 시험을 실시하여 화장품 소재로서의 흑마늘의 피부 안전성을 평가하고자 한다.
제안 방법
- 0.2 M Tris-HCl buffer(pH 8.0)와 10 μg/mL porcine pancreatic elastase type IV를 각각 0.5 mL을 가하여 혼합한 후 25℃에서 20분간 반응시킨 후 0.8 mM SANA를 1.0 mL 가하여 37℃에서 반응시킨 다음, 214 nm에서 흡광도를 측정하였으며 elastase 활성 억제능은 다음과 같이 계산하였다.
- 1차 감작(induction)을 위해, 제모한 기니픽의 등 부위 피부(2×4 cm)에 Fig. 2와 같이 표시한 후 각 부위에 FCA와 흑마늘 추출물, 음성대조군(생리식염수) 또는 양성대조군(DNCB)을 0.1 mL씩 각각 피내로 주사하였다.
- 흑마늘의 야기 농도는 화장품 사용예정량인 1%로 하였다. 24시간 야기 후 패취를 제거한 다음 미온수로 피부에 남아 있는 시험물질을 깨끗이 닦아낸 후 72시간까지 관찰하였다. 양성대조군인 DNCB는 감작 농도는 1.
- 2차 감작은 1차 감작 1주 후 시험물질을 피내주사 했던 부위에 시험물질을 포함하는 패취(patch, 2×4 cm)를 부착하여 48시간 동안 폐색첩포(occlusive with patch)하여 감작시켰다. 2차 감작 2주 후 야기(challenge)를 실시하였으며, Fig. 2의 야기부위에 부착하여 24시간 동안 폐색첩포 하여 감작을 야기하였다. 흑마늘의 야기 농도는 화장품 사용예정량인 1%로 하였다.
- 1차 및 2차 감작 노출량은 화장품 사용 예정량(1%) 의 10배인 10% 용액을 사용하여 감작시켰다. SLS 전 처치는 1차 감작 6일 후 시험물질에 의한 감작을 증강하기 위해 10%(w/v) SLS 함유 백색 바세린 0.5 g을 도포한 다음 24시간 후 SLS를 미온수로 씻어 내고 2차 감작을 실시하였다. 2차 감작은 1차 감작 1주 후 시험물질을 피내주사 했던 부위에 시험물질을 포함하는 패취(patch, 2×4 cm)를 부착하여 48시간 동안 폐색첩포(occlusive with patch)하여 감작시켰다.
- 감작기간 중 매일 오전 10시와 오후 5시 일반적인 상태를 관찰 기록하였고, 매주 1회씩 체중을 측정하였다.
- 반응 후 DMSO 용액 100 μL를 가하고 20분 후 492 nm에서 흡광도를 측정하였으며 tyrosinase 활성 억제능은 다음과 같이 계산하였다.
- 사육실의 사육조건은 온도 23±3℃, 습도 50±10%, 환기회수 15회/hr, 조도 150∼300 Lux, 명암주기 12시간(08:00∼20:00)으로 자동 유지되도록 하였다.
- 세정을 마친 다음, 24시간 간격으로 72시간까지 관찰하면서 피부반응을 “의약품 등의 독성시험기준”의 “피부자극반응 평가표”(Table 1)에 따라 평가하여, 피부 1차 자극지수(primary irritation index, P.I.I.)를 산출하여, 자극성을 Table 2에 따라 판정하였다(19,20).
- 야기를 위해 부착했던 폐쇄첩포를 제거한 다음 24시간, 48시간 및 72시간에 “피부감작반응 평가표”(Table 3)에 따라 반응을 평가하였으며, 각 군에서 반응을 보이는 개체로 양성반응율(%)[양성동물수/전체동물수×100]을 구하고 피부감작성의 정도를 평가하였다.
- 24시간 야기 후 패취를 제거한 다음 미온수로 피부에 남아 있는 시험물질을 깨끗이 닦아낸 후 72시간까지 관찰하였다. 양성대조군인 DNCB는 감작 농도는 1.0%, 야기 농도는 0.1%로 적용하였다.
- 전 시험기간 동안 기니픽 사료(Purina Korea Co., Seoul, Korea)와 음수는 자유롭게 급식시켰으며, 기니픽은 스테인레스 스틸 사육케이지(26×42×18 cm)에서 사육 상자 당 1마리씩 개별 사육하였다.
- 제모 한 10마리의 기닉픽을 이용하여 각 동물의 등 부위를 약 1.5 cm×1.5 cm 정도의 크기로 척추를 중심으로 4구획을 만들었다.
- 5 cm 정도의 크기로 척추를 중심으로 4구획을 만들었다. 표시된 부위 중 오른쪽 부위를 주사기 바늘을 이용하여 대각선 방향으로 각질층만 손상되고 진피는 손상되지 않으며 피가 나지 않을 정도의 찰과상을 내어 비찰과 피부 2개소와 찰과 피부 2개소로 나누었다(Fig. 1). Fig.
- 피부 감작성 실험은 Maximization Test법(21)으로 실시하였으며, 각 군당 기니픽 5마리씩을 사용하여 음성대조군 (생리식염수), 양성대조군(DNCB) 및 흑마늘 추출물 처리군으로 나누어 수행하였다. 제모는 1차 피부자극 시험과 동일한 방법으로 수행하였다.
- 마늘은 구입 즉시 냉장 보관하면서 박피하여 100 g씩 폴리에틸렌 필름으로 포장한 후 -70℃에서 보관하여 사용하였다. 흑마늘 제조는 첨가물 없이 60～70℃에서 85～95%의 상대 습도를 유지하면서 40일간 자연 숙성시켜 제조하였다. 흑마늘 추출물은 분쇄한 흑마늘을 증류수에 24시간 동안 실온에서 교반하여 추출시킨 후 15obrix까지 40℃에서 감압 농축시켜 보관하였다.
- 흑마늘의 항산화 활성의 측정은 DPPH 라디칼 및 ABTS 라디칼을 이용하여 각각의 라디칼을 소거하는 능력을 이용하여 측정하였다. DPPH 라디칼 소거능은 Brand-Williams 등(14)의 방법으로, ABTS 라디칼을 이용한 라디칼 소거능은 Re 등(15)의 방법에 의해 측정하였다.
대상 데이터
- 마늘은 경상북도 의성 지역에서 생산된 1등급 마늘을 지역농협에서 시판 중인 것을 구입하여 사용하였다. 마늘은 구입 즉시 냉장 보관하면서 박피하여 100 g씩 폴리에틸렌 필름으로 포장한 후 -70℃에서 보관하여 사용하였다.
- 본 시험에 사용한 동물은 건강한 수컷 Hartley guinea pig(350～420 g)를 (주)대한바이오링크(Dae Han Biolink Co., Eumseong, Korea)에서 구입하였다. 사육실의 사육조건은 온도 23±3℃, 습도 50±10%, 환기회수 15회/hr, 조도 150∼300 Lux, 명암주기 12시간(08:00∼20:00)으로 자동 유지되도록 하였다.
- 흑마늘 추출물은 분쇄한 흑마늘을 증류수에 24시간 동안 실온에서 교반하여 추출시킨 후 15obrix까지 40℃에서 감압 농축시켜 보관하였다. 이렇게 만들어진 흑마늘 추출물(black garic extract)은 생리식염수를 이용하여 10% 용액으로 만든 후 모든 실험에 사용하였다.
데이터처리
- ANOVA test 후 p<0.05 수준에서 Duncan's multiple range test로 실시하여 그룹간의 유의성을 나타내었다.
- Different letters indicate significant difference (p<0.05) among groups by Duncan's multiple range test.
- 실험 결과는 SPSS ver 10.0(SPSS Inc., IL, USA)을 이용 하여 통계 처리하였으며, 모든 측정 항목에 대한 평균(mean) 과 평균의 표준 편차(standard deviation, SD)를 산출하였다. ANOVA test 후 p<0.
이론/모형
- 1차 피부자극 실험은 Draize 방법(18)으로 실시하였으며, 시료의 농도는 화장품 사용 예정량(1%)의 10배인 10%로 하여 실시하였다. 실험 시작 24시간 전에 clipper와 일반 면도기를 이용하여 제모 하여 제모에 의한 피부자극을 안전화 시킨 후 다음날 사용하였다.
- 흑마늘의 항산화 활성의 측정은 DPPH 라디칼 및 ABTS 라디칼을 이용하여 각각의 라디칼을 소거하는 능력을 이용하여 측정하였다. DPPH 라디칼 소거능은 Brand-Williams 등(14)의 방법으로, ABTS 라디칼을 이용한 라디칼 소거능은 Re 등(15)의 방법에 의해 측정하였다. 피부노화 보호능은 tyrosinase 저해 활성 및 elastase 저해 활성을 측정하였으며 tyrosinase 저해 활성은 Mason과 Peterson(16)의 방법을 이용하여 측정하였다.
- Elastase 저해 활성은 James 등(17)의 방법을 이용하여 측정하였다. 0.
- , Minneapolis, MN, USA)법에 의해 측정하였다(22). 각 조직의 단백질 함량을 bicinchroninic acid(BCA, Pierce Chemcal Co., Rockford, IL, USA)법으로 측정한 후 조직 g당 pg 농도로 표시하였다. 각각의 시험 방법은 각 제조사에서 제시한 방법에 따라 실시하였다.
- DPPH 라디칼 소거능은 Brand-Williams 등(14)의 방법으로, ABTS 라디칼을 이용한 라디칼 소거능은 Re 등(15)의 방법에 의해 측정하였다. 피부노화 보호능은 tyrosinase 저해 활성 및 elastase 저해 활성을 측정하였으며 tyrosinase 저해 활성은 Mason과 Peterson(16)의 방법을 이용하여 측정하였다. 0.
- 회수된 상등액의 Tumor necrosis factorα(TNF-α), Interleukin-6(IL-6)를 sandwich ELISA(R & D Inc., Minneapolis, MN, USA)법에 의해 측정하였다(22).
성능/효과
- 10% 흑마늘 추출물의 pH는 약산성(5.6±0.7)이었으나 이는 마늘 추출물(5.2±1.4)과 유의적 수준에서 차이는 없었으며 특히, 마늘에 비해 마늘 특유의 향이 없었으며 높은 항산화 활성과 tyrosinase 및 elastase의 활성을 억제하는 효능을 가지고 있음을 알 수 있었다(Table 4).
- 23으로 practically non-irritation(비자극성)에 해당하는 자극으로 피부 자극이 거의 없었음을 알 수 있었다. Maximization test법으로 피부 감작성을 확인한 결과 시험물질에 의한 홍반과 부종 등이 전혀 유발되지 않았다. 이상의 결과로부터 흑마늘 추출물에 대한 기니픽의 피부 감작율은 0%로, 피부에 대한 피부 감작성이 없는 것으로 확인되었다.
- 이상의 결과로부터 흑마늘 추출물에 대한 기니픽의 피부 감작율은 0%로, 피부에 대한 피부 감작성이 없는 것으로 확인되었다. 따라서 이러한 본 연구의 결과는 흑마늘 추출물이 기능성 화장품 소재로 피부노화를 억제하는 기능성과 안전성 확보된 소재임을 추정할 수 있었다.
- 875로 나왔다고 보고하였다. 따라서 흑마늘 추출물은 P.I.I.가 0.23의 자극은 관찰되었으나 이는 practically non-irritation(비자극성)에 해당하는 자극으로 피부자극이 거의 없음을 알 수 있었다.
- 야기된 동물의 조직의 TNFα와 IL-6를 측정한 결과 TNF-α는 모든 처리군에서 유의적 차이가 관찰되지 않았으나 IL-6의 양은 양성대조군인 DNCB 처리군에서는 음성대조군보다 유의적으로 증가하였으나 흑마늘 처리군에서 음성대조군과 유의적 차이가 없었다(Fig. 5).
- Maximization test법으로 피부 감작성을 확인한 결과 시험물질에 의한 홍반과 부종 등이 전혀 유발되지 않았다. 이상의 결과로부터 흑마늘 추출물에 대한 기니픽의 피부 감작율은 0%로, 피부에 대한 피부 감작성이 없는 것으로 확인되었다. 따라서 이러한 본 연구의 결과는 흑마늘 추출물이 기능성 화장품 소재로 피부노화를 억제하는 기능성과 안전성 확보된 소재임을 추정할 수 있었다.
- 1차 자극을 평가하기 위하여 시험물질을 처리한 그룹의 동물에서는 시험물질에 의한 특이한 일반증상 및 사망의 예는 관찰되지 않았다. 피부 감작실험을 위하여 폐색첩포한 모든 개체에서 약간의 체중 감소가 있었으나(data not shown), 이는 고정에 의한 물리적인 스트레스에 의한 것으로 폐색첩포를 제거한 후에는 정상으로 회복하였다. 그러나 피부 감작성을 측정하기 위해 양성 대조물(DNCB)을 투여한 그룹에서는 피부에 중등도에 이르는 홍반과 부종이 관찰되었으며, 외부자극에 과민하게 반응하는 행동을 보였으나 이로 인한 사망은 관찰되지 않았다.
- 화장품 사용 예정량의 10배인 10% 흑마늘 추출물을 찰과 부위와 비찰과 부위에 24시간 폐색첩포 후 첩포물을 제거한 다음 24, 48, 72시간째에 관찰한 결과를 Fig. 3에 나타난 바와 같이 대조군(생리식염수)에서는 부종과 홍반이 전혀 관찰되지 않았다. 그러나 흑마늘 처리한 군의 찰과 영역에서 미비한 홍반이 관찰되었다.
- 본 연구는 흑마늘을 기능성 화장품 소재로 활용하기 위하여 그 기능성을 in vitro에서 tyrosinase 및 elastase 저해 활성을 측정한 결과 피부노화에 관여하는 두 효소의 활성을 모두 저해하였다. 흑마늘 추출물을 hartley계 기니픽 수컷을 사용하여 피부 1차 자극 실험을 실시한 결과 1차 피부자극지수(P.I.I.)가 0.23으로 practically non-irritation(비자극성)에 해당하는 자극으로 피부 자극이 거의 없었음을 알 수 있었다. Maximization test법으로 피부 감작성을 확인한 결과 시험물질에 의한 홍반과 부종 등이 전혀 유발되지 않았다.
- 활성화된 T세포는 IL-4, IL-6, IL-13 등과 같은 사이토카인을 방출하고, B세포와 상호작용하여 allergenspecific IgE의 생산을 유도하여, 항원에 의해 재 노출 시 감작반응을 일으키게 된다(26). 흑마늘의 피부 감작정도를 측정한 결과 grade I 정도의 약한 접촉자극을 유도하며, 야기된 조직의 IL-6의 방출량에서도 음성대조군(생리식염수)보다 함량의 증가가 관찰되지 않는 것으로 보아 피부에 감작을 전혀 일으키지 않는 것을 알 수 있었다.
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