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문제 정의
- 따라서 본 연구는 국내에 자생하는 산여뀌에 대한 기초 자료 확보를 구축하고, 자연친화적 화장품 소재로 응용하기 위한 기초실험으로서 위해성에 대해 검증을 하고자 하며, 이를 위해 자연친화적 화장품 원료에 있어 가장 중요한 부분으로서 피부에 대한 안전성을 확인 및 검증하기 위한 방법으로서 토끼와 Guinea pig을 이용한 1차 피부자극성, 안점막자극과 피부감작성 시험과 같은 피부 안전성 시험을 실시하여 환경친화적 원료의 위해성을 평가하고자 한다.
제안 방법
- 피부감작성 시험은 maximization test법(OECD, 1992)으로 실시하였으며, 시험물의 조제는 증류수를 이용하여 induction 시에는 10%, challenge 시에는 2%을 각각 적용하였으며, 양성대조군으로는 20% benzocaine을 사용하였으며, 시험군의 구성은 건강한 암컷 기니피그 22마리를 이용하여 시험하였으며, 검역 및 적응기간 중의 체중을 기초로 하여, 등 부분의 피모상태가 양호한 건강한 동물을 선별한 후, 평균체중이 가능한 균등하도록 시험군, 음성대조군, 양성대조군으로 구성하였다. 1st Induction (intradermal induction, day 1)은 2 x 4 cm 크기로 털을 제거한 견갑내부의 주사부위에 시험물질을 0.1ml 씩 양쪽에 피내주사 한 후 2nd Induction (topical induction, day 8)은 피내 주사 7일째에 동일부위를 제모한 후 10% Sodium Lauryl Sulfate (SLS) 용액을 0.5 ~ 1 g 처리 하여 24시간 적용 하고 동일 부위에 시험물질 0.5ml /site를 적용하여 2 x 4 cm 크기의 거즈로 덮은 뒤 비자극성 테이프로 잘 고정하여 48시간 폐쇄 첩포하였다. 시험군은 10% 산여뀌 추출물, 음성대조군에는 용매, 양성대조군에는 20% benzocaine을 적용하였다.
- , Seoul, Korea)에서 구입하여 사용하였다. 1차 피부자극성 시험과 안점막 자극 시험에는 토끼, 피부감작성 시험에는 기니피그를 이용하여 산여뀌 추출물의 피부 안전성을 평가하였다. 물과 사료는 자유급식 하였으며 온도 23 ± 2°C, 습도 55 ± 10%, 명암주기는 12시간으로 자동 유지되도록 하였다.
- 1차 피부자극성 시험을 위하여 적용 24시간 전 토끼의 등 부위를 제모하고, 4개소(2.5 cm×2.5 cm) 가운데 2개소에 26 G, 1회용 주사침을 사용하여 진피에 손상 및 출혈을 일으키지 않게 각질층만을 파괴하도록 찰과상을 만들어 시험하였다.
- 1ml 적용 하였으며, 적용 후 시험물질의 누출을 방지하기 위해 약 1초간 양 안검을 잡아 강제 폐안시켰다. 3마리는 시험물질 적용 20 ~ 30초 후 양쪽 눈에 미온 멸균생리식염수 20ml을 이용하여 1분간 세안하였다. 시험물질 적용 후 7일까지 임상증상 및 체중을 측정하였으며, 시험물질 투여 후 1, 24, 48 및 72시간, 4일, 7일에 각막, 홍채, 결막 등을 관찰하였고, 안자극 평가는 안구병변의 등급 기준에 따라 평가 하였다(KFDA, 2009).
- Challenge (topical application, day 22)는 국소유도단계 종료 후 14 ± 2일에 오른쪽 옆구리(감작유도 부위를 배제한 부위)에 시험물질을 2 × 2 cm의 패취를 부착하여 24 ± 2시간동안 폐색 첩포하였다.
- 다음 단계로서 시험부위와 대조 부위에 거즈를 사용하여 덮고, 비자극성 테이프를 이용하여 고정하고 24시간 동안 노출시켰다.
- 시험물질은 화장품 사용 예정량의 10배인 10% 농도(weight/volume)로 희석하여 사용하였으며, 희석에 사용된 멸균증류수를 대조물질로 하였다. 동물 당 찰과 부위 2개소와 비찰과 부위 20개소를 비교 대상으로 설정하였으며, 좌측의 찰과 부위 1개소와 비찰과 부위 1개소에 각각 0.5ml 씩 1회 도포 하였고, 우측의 대조부위에는 희석에 사용된 멸균 증류수를 대조물질로 사용하여 도포하였다. 다음 단계로서 시험부위와 대조 부위에 거즈를 사용하여 덮고, 비자극성 테이프를 이용하여 고정하고 24시간 동안 노출시켰다.
- 따라서 산여뀌 추출물의 피부반응평가에서는 무반응으로 “0.0”으로 산정되어 피부 감작성 반응이 관찰되지 않는 안전한 등급인 grade Ⅰ로 무독성 물질로 확인하였다.
- 물과 사료는 자유급식 하였으며 온도 23 ± 2°C, 습도 55 ± 10%, 명암주기는 12시간으로 자동 유지되도록 하였다.
- 본 연구는 산여뀌 추출물에 대한 안전성 평가로 1차 피부자극, 안점막자극, 그리고 피부감작성 시험을 실시하였다. 특히, 산여뀌 추출물은 전 항목에 있어 관찰 기간 동안 폐사하는 현상은 관찰되지 않았다.
- 산여뀌 추출물의 안점막 자극성을 평가하기 위하여 급성 안점막 자극 시험을 실시하였다. 실험동물은 양안의 각막 등의 손상 여부를 검사 한 결과 이상이 관찰되지 않은 토끼 9마리를 사용하였으며, 멸균증류수를 이용하여 10% 농도(weight/volume)로 시험물질을 희석하여 좌측안구에 시험물질을 0.
- 5ml /site를 적용하여 2 x 4 cm 크기의 거즈로 덮은 뒤 비자극성 테이프로 잘 고정하여 48시간 폐쇄 첩포하였다. 시험군은 10% 산여뀌 추출물, 음성대조군에는 용매, 양성대조군에는 20% benzocaine을 적용하였다. Challenge (topical application, day 22)는 국소유도단계 종료 후 14 ± 2일에 오른쪽 옆구리(감작유도 부위를 배제한 부위)에 시험물질을 2 × 2 cm의 패취를 부착하여 24 ± 2시간동안 폐색 첩포하였다.
- 다음 단계로서 시험부위와 대조 부위에 거즈를 사용하여 덮고, 비자극성 테이프를 이용하여 고정하고 24시간 동안 노출시켰다. 시험물질 적용 후 72시간까지 임상증상 및 사망동물의 유무 등에 관하여 매일 관찰하였으며, 시험물질 적용 직전 및 72시간째에 개별 체중을 측정하였다. 적용부위는 시험물질 도포 종료 후 적용부위의 패치를 제거하여 1, 24, 48 및 72시간에 따라, 홍반 및 부종 등의 자극성 유무를 관찰 한 후, 피부자극반응 평가표 Table 1에 따라 평가하여 피부 1차 자극지수(Primary Irritation Index, P.
- 3마리는 시험물질 적용 20 ~ 30초 후 양쪽 눈에 미온 멸균생리식염수 20ml을 이용하여 1분간 세안하였다. 시험물질 적용 후 7일까지 임상증상 및 체중을 측정하였으며, 시험물질 투여 후 1, 24, 48 및 72시간, 4일, 7일에 각막, 홍채, 결막 등을 관찰하였고, 안자극 평가는 안구병변의 등급 기준에 따라 평가 하였다(KFDA, 2009). 결과에 대한 자극성의 판정은 안구병변의 등급에 따른 각 관찰시점의 개체별 안자극지수(IOI, individual ocular irritation index)를 산출하였고, 이를 이용하여 각 기기별 평균 안자극지수(MOI, mean ocular irritation index)로 하였다(Ballantyne, 1993; KFDA, 2009).
- 5 cm) 가운데 2개소에 26 G, 1회용 주사침을 사용하여 진피에 손상 및 출혈을 일으키지 않게 각질층만을 파괴하도록 찰과상을 만들어 시험하였다. 시험물질은 화장품 사용 예정량의 10배인 10% 농도(weight/volume)로 희석하여 사용하였으며, 희석에 사용된 멸균증류수를 대조물질로 하였다. 동물 당 찰과 부위 2개소와 비찰과 부위 20개소를 비교 대상으로 설정하였으며, 좌측의 찰과 부위 1개소와 비찰과 부위 1개소에 각각 0.
- 시험물질 적용 후 72시간까지 임상증상 및 사망동물의 유무 등에 관하여 매일 관찰하였으며, 시험물질 적용 직전 및 72시간째에 개별 체중을 측정하였다. 적용부위는 시험물질 도포 종료 후 적용부위의 패치를 제거하여 1, 24, 48 및 72시간에 따라, 홍반 및 부종 등의 자극성 유무를 관찰 한 후, 피부자극반응 평가표 Table 1에 따라 평가하여 피부 1차 자극지수(Primary Irritation Index, P.I.I.)를 산출하여 자극성을 Table 2에 따라 평가하였다(KFDA, 2009).
- 24 ± 2시간이 지난 후에 드레싱과 첩포를 제거한다. 체중 변화는 induction 실시 당일 및 일주일 간격으로 체중을 측정하였으며 challenge 후 3일째인 실험 종료일에 체중을 측정하였으며, 시험물질 적용 첩포 제거 후 24, 48 시간째에 홍반 및 가피형성, 부종 형성 등의 자극에 대하여 피부반응평가표를 이용하여 관찰하였다(KFDA, 2009). 또한 결과에 대한 자극성의 정도 판정은 Table 4에 따라 피부감작성을 평가하였다.
- 피부감작성 시험은 maximization test법(OECD, 1992)으로 실시하였으며, 시험물의 조제는 증류수를 이용하여 induction 시에는 10%, challenge 시에는 2%을 각각 적용하였으며, 양성대조군으로는 20% benzocaine을 사용하였으며, 시험군의 구성은 건강한 암컷 기니피그 22마리를 이용하여 시험하였으며, 검역 및 적응기간 중의 체중을 기초로 하여, 등 부분의 피모상태가 양호한 건강한 동물을 선별한 후, 평균체중이 가능한 균등하도록 시험군, 음성대조군, 양성대조군으로 구성하였다. 1st Induction (intradermal induction, day 1)은 2 x 4 cm 크기로 털을 제거한 견갑내부의 주사부위에 시험물질을 0.
대상 데이터
- 본 시험에 사용한 동물은 수컷 토끼(New Zealand rabbits)와 암컷 기니피그(Hartly guinea pig)을 중앙실험동물(Central Lab. animal Inc., Seoul, Korea)에서 구입하여 사용하였다. 1차 피부자극성 시험과 안점막 자극 시험에는 토끼, 피부감작성 시험에는 기니피그를 이용하여 산여뀌 추출물의 피부 안전성을 평가하였다.
- 실험동물은 양안의 각막 등의 손상 여부를 검사 한 결과 이상이 관찰되지 않은 토끼 9마리를 사용하였으며, 멸균증류수를 이용하여 10% 농도(weight/volume)로 시험물질을 희석하여 좌측안구에 시험물질을 0.1ml 적용 하였으며, 적용 후 시험물질의 누출을 방지하기 위해 약 1초간 양 안검을 잡아 강제 폐안시켰다.
- 실험에 사용한 산여뀌는 2009년 충북 제천 백운산에서 채집하여 풍건 및 분쇄하여 실험에 사용하였다. 산여뀌 추출은 상온에서 70% 에탄올을 이용하여 18시간 동안 교반 추출한 후 Filter paper No.
데이터처리
- 시험물질 적용 후 7일까지 임상증상 및 체중을 측정하였으며, 시험물질 투여 후 1, 24, 48 및 72시간, 4일, 7일에 각막, 홍채, 결막 등을 관찰하였고, 안자극 평가는 안구병변의 등급 기준에 따라 평가 하였다(KFDA, 2009). 결과에 대한 자극성의 판정은 안구병변의 등급에 따른 각 관찰시점의 개체별 안자극지수(IOI, individual ocular irritation index)를 산출하였고, 이를 이용하여 각 기기별 평균 안자극지수(MOI, mean ocular irritation index)로 하였다(Ballantyne, 1993; KFDA, 2009). 이 결과에서 얻어진 급성안 자극지수를 Table 3에 따라 안점막 자극정도를 평가하였다.
- 모든 실험결과는 평균 ± 표준 편차(mean ± S.D)로 산출하였으며, 통계적 분석은 SPSS ver 10.0(SPSS Inc., IL, USA)을 이용하여 통계 처리하였으며, ANOVA test를 실시하여 그룹간의 통계적 유의수준 p < 0.05로 정하는 것을 원칙으로 하였다.
이론/모형
- 물과 사료는 자유급식 하였으며 온도 23 ± 2°C, 습도 55 ± 10%, 명암주기는 12시간으로 자동 유지되도록 하였다. 본 실험은 한국 기계전기전자 시험연구원 동물실험윤리위원회 승인을 받아 실험동물 관리 및 이용에 관한 지침(Guide for the care and use of laboratory animals, NRC, 2011)에 따라 실시하였다.
- 시험 산여뀌 추출물의 피부에 대한 자극성을 평가하기 위하여 토끼를 이용하여 1차 피부자극성시험은 Draize 방법으로 실시하였다(Draize et al., 1994). 1차 피부자극성 시험을 위하여 적용 24시간 전 토끼의 등 부위를 제모하고, 4개소(2.
- 산여뀌 추출물의 1차 피부자극성 시험 결과 Table 5에 나타난 것과 같이, 1차 자극을 평가하기 위하여 시험물질을 처리한 모든 동물에 있어서 시험물질에 의한 특이한 일반증상과 임상증상이 관찰되지 않았으며, 사망하는 동물도 없었으며, 시험기간 중 모든 동물에서 정상적으로 체중이 증가하였다(data not shown). 시험물질 적용 후 24, 48 및 72시간째에 적용부위의 국소자극성을 관찰한 결과, 시험물질의 적용에 기인한 홍반 및 부종이 관찰되지 않았으며, 상기의 소견을 피부반응평가표에 따라 점수로 산출하였다(KFDA, 2009). 피부 1차 자극지수는 24시간과 72시간째의 점수로 산출하였으며 그 결과, “0.
성능/효과
- 875로 보고하였다. 따라서 산여뀌 추출물은 P.I.I. 0.08로 기존 보고된 레티놀 함유 크림에 비해 10배 이상의 피부 자극이 감소하였으므로, 산여뀌 추출물은 비자극성에 해당하는 것으로 피부자극이 거의 없음을 확인하였다. 대조군과 시험군(PNE)에 대한 2그룹 간 유의한 수준 변화는 없었다.
- 따라서 산여뀌 추출물은 안점막 자극에 대하여 안전한 물질로 확인 되었으며, 2그룹 간 유의한 수치 변화는 관찰되지 않았다.
- 산여뀌 추출물의 1차 피부자극성 시험 결과 Table 5에 나타난 것과 같이, 1차 자극을 평가하기 위하여 시험물질을 처리한 모든 동물에 있어서 시험물질에 의한 특이한 일반증상과 임상증상이 관찰되지 않았으며, 사망하는 동물도 없었으며, 시험기간 중 모든 동물에서 정상적으로 체중이 증가하였다(data not shown). 시험물질 적용 후 24, 48 및 72시간째에 적용부위의 국소자극성을 관찰한 결과, 시험물질의 적용에 기인한 홍반 및 부종이 관찰되지 않았으며, 상기의 소견을 피부반응평가표에 따라 점수로 산출하였다(KFDA, 2009).
- 산여뀌 추출물의 안점막자극 시험 결과를 Table 6에 나타내었으며, 시험물질을 처리한 모든 동물에 있어서 시험물질에 의한 특이한 일반증상과 임상증상이 관찰되지 않았으며, 사망하는 동물도 없었으며, 시험기간 중 모든 동물에서 정상적으로 체중이 증가하였다(data not shown). 시험물질 적용 후 1, 24, 48 및 72시간째에 적용 부위의 안구반응을 관찰한 결과, 각막, 홍채, 결막 등에서 병변이 확인되지 않았으며 안반응의 평가표에 따라 안점막자극지수를 산정한 결과, 급성 안점막 자극지수는 “0.
- 체중 변화는 induction 실시 당일 및 일주일 간격으로 체중을 측정하였으며 challenge 후 3일째인 실험 종료일에 체중을 측정한 결과 시험기간 중 모든 동물에서 정상적으로 체중이 증가하였다(data non shown). 시험물질 노출 종료 후 적용부위를 관찰한 결과, 시험군에서는 시험물질 적용부위 모두에서 24시간째와 48시간째에 감작성 반응이라 판단되는 자극은 관찰되지 않았으며, 음성대조군에서도 관찰기간 모두에서 감작성 반응은 관찰 되지 않았다. 양성대조에서는 24시간째에 감작성 양성율 100%, 48시간째에 감작성 양성율 90%를 나타내어 grade Ⅴ에 해당하였으나, 산여뀌 추출물은 피부반응평가에서는 무반응으로 “0.
- 시험물질 적용 후 1, 24, 48 및 72시간째에 적용 부위의 안구반응을 관찰한 결과, 각막, 홍채, 결막 등에서 병변이 확인되지 않았으며 안반응의 평가표에 따라 안점막자극지수를 산정한 결과, 급성 안점막 자극지수는 “0.0”으로 산정되었다.
- 안점막 자극성을 평가하기 위하여 급성 안점막 자극시험을 실시한 결과 산여뀌 추출물 50%을 적용한 후 이상 반응, 각막, 홍채, 그리고 결막 등의 병변은 확인되지 않았으며, 급성 안점막 자극지수는 “0.0”, 그리고 피부 감작성 유발 가능성을 평가하기 위하여 GPMT (Guinea Pig Maximization Test)를 실시한 결과 실험 전 기간 동안 산여뀌 추출물 10%에서 감작성 반응으로 판단되는 자극이 관찰되지 않았다.
- 피부감작성을 평가하기 위한 시험결과를 Table 7에 나타내었으며, 일반상태 및 사망의 관찰은 시험물질 적용 후, 매일 임상증상과 사망률에 대하여 관찰한 결과 모든 시험동물에 있어서 시험물질에 의한 특이한 일반증상과 임상증상이 관찰되지 않았으며, 사망하는 동물도 관찰되지 않았다(data not shown). 체중 변화는 induction 실시 당일 및 일주일 간격으로 체중을 측정하였으며 challenge 후 3일째인 실험 종료일에 체중을 측정한 결과 시험기간 중 모든 동물에서 정상적으로 체중이 증가하였다(data non shown). 시험물질 노출 종료 후 적용부위를 관찰한 결과, 시험군에서는 시험물질 적용부위 모두에서 24시간째와 48시간째에 감작성 반응이라 판단되는 자극은 관찰되지 않았으며, 음성대조군에서도 관찰기간 모두에서 감작성 반응은 관찰 되지 않았다.
후속연구
- 0”으로 산정되어 피부 감작성 반응이 관찰되지 않는 안전한 등급인 grade Ⅰ로 무독성 물질로 확인하였다. 이러한 결과 화학 물질로 제조되어 인간의 피부에 영향을 주는 화장품 주원료에 대한 위해성 평가는 대단히 중요한 것으로, 본 연구를 통하여 화장품 원료로서 산여뀌 추출물은 인체 피부에 무해한 것으로 판단되며, 향후 산여뀌에 포함된 다양한 성분 분석과 성분에 따른 위해성 연구를 진행할 것이다.
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