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문제 정의
- 이에 동일 약제라 하여도 추출용매에 따라 추출 성분과 효능의 정도가 달라 질 수 있음을 고려하여 粉刺 및 酒齄에 외용 치료제로 敷法을 이용하여 활용되는 顚倒散을 에탄올과 물로 각각 추출하여 NO, PGE2, TNF-α 생성 저해능과 iNOS, COX-2 발현 억제능를 통한 항염 효능과 ROS 생성 저해능, GSH 합성능, DPPH 소거능을 통한 항산화 효능을 비교하여 추출용매에 따른 차이를 알아보고자 하였다.
- 이에 본 연구는 敷法을 활용하여 이용되는 顚倒散을 에탄올과 물로 추출하여 PGE2, NO, TNF-α 생성 저해능과 iNOS, COX-2 발현 억제능를 통한 항염 효능과 ROS 생성 저해능, GSH 합성능, DPPH 소거능을 통한 항산화 효능을 비교하여 추출용매에 따른 차이를 알아보고 외용 치료제인 顚倒散의 임상적인 활용가치를 높이고자 하였다.
제안 방법
- 7 세포를 1×106 /well의 농도로 6 well plate에 접종하였다. 24시간 배양 후 무혈청 배지를 이용하여 시료의 최종 농도가 20, 50, 100 ㎍/ ㎖가 되도록 처리한 후 LPS를 100 ng/㎖의 농도로 처리하였다. 24시간 후 배지를 회수하여 12000 rpm으로 5분 동안 원심 분리하여 상층액을 회수하여 -70℃에서 보관하였다.
- 7 세포를 1×106 /well의 농도로 6 well plate에 접종하였다. 24시간 배양 후 무혈청 배지를 이용하여 시료의 최종 농도가 20, 50, 100 ㎕/ ㎖이 되도록 처리하여 준 후 LPS를 100 ng/㎖의 농도로 처리하였다. 24시간 후 배지를 회수하여 12000 rpm으로 5분 동안 원심 분리하여 상층액을 회수하여 -70℃에서 보관하였다.
- 배양 후 배지를 제거하고, 무혈청 배지에 최종 농도가 20, 50, 100 ㎍/㎖가 되도록 JDS 를 처리한 후 염증 반응 유도인자인 LPS를 100 ng/㎖의 농도로 처리하였다. 24시간 배양 후 배지를 이용하여 NO의 생성 정도를 측정하였다9). 세 포배양액 50 ㎕와 Griess시약 50 ㎕를 혼합하여 10분 동안 반응시킨 후 ELISA reader를 이용하여 540 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.
- DPPH의 환원성을 이용하여 JDS의 DPPH Radical 소거효과를 측정하였다. DPPH를 메탄올에 용해시켜 0.1 mM DPPH 용액 1 ㎖에 JDS를 20, 50, 100 ㎍/㎖ 농도별로 제조하여 1 ㎖씩 넣어주고 잘 혼합하여 준 후, 실온에서 10분 동안 반응시킨 뒤 565 ㎚에서 흡광도를 측정하였다10).
- DPPH의 환원성을 이용하여 JDS의 DPPH Radical 소거효과를 측정하였다. DPPH를 메탄올에 용해시켜 0.
- PBS 100 ㎕를 넣은 후 세척하였다(3~5번 반복). H2O2 100 uM(in PBS) 100 ㎕를 넣은 후 ELISA를 이용하여 10분 간격으로 형광의 세기를 측정하였다(485 ㎚/535 ㎚).
- 24시간 배양 후 PBS를 이용하여 5 ㎎/㎖의 농도로 녹여져 있는 MTT 시약을 20 ㎕씩 넣어주고 4시간 배양하였다. MTT 시약과 시료가 포함된 배지를 모두 제거하고 각 well에 100 ㎕ acid isopropanol (0.04N HCl in iso-propanol)을 첨가하여 30분간 교반하여 주고, ELISA reader를 이용하여 570 ㎚에서 흡광값을 측정하였다8).
- 기기로는 ebioscience(USA), R&D system(USA), ELISA reader (Perkin-Elmer, Singapore)와 Multi-photon Confocal Laser Scanning Microscope system(Carl Zeiss Jena GmbH, Germany)을 사용하여 실험하였다.
- 단백질 보정을 위하여 β-actin도 함께 수행하였다.
- 세포를 용해시킨 후 12000rpm에서 5분 동안 원심 분리하여 상층액을 이용하여 Bicinchoninc Acid(BCA)법을 이용한 단백질 정량을 수행하였다. 단백질 정량 후 well당 35 ㎍ 정도의 단백질을 10% SDS-PAGE에 놓고 100 V에서 1시간 동안 전기영동을 수행하였다. 전기영동 후 PVDF membrane에 단백질을 옮긴 후 COX-2, iNOS 1차 antibody를 반응시킨 후 2차 Antibody를 반응하여 단백질의 발현 정도를 확인하였다.
- 7세포를 96well plate에 5×105 /㎖의 농도로 희석하여 100 ㎕씩 접종한 후 24시간 배양하였다. 배양 후 배지를 모두 제거하고 혈청이 포함되지 않은 배지 90 ㎕씩을 각 well 에 넣고 JDS의 농도가 20, 50, 100 ㎍/㎖가 되도록 혈청이 포함되지 않은 배지를 이용하여 희석한 시료를 10 ㎕씩 well에 처리하여 주었다. 24시간 배양 후 PBS를 이용하여 5 ㎎/㎖의 농도로 녹여져 있는 MTT 시약을 20 ㎕씩 넣어주고 4시간 배양하였다.
- /㎖의 농도로 96 well plate에 100 ㎕씩 접종한 후 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 배지를 제거하고 무혈청 배지를 이용하여 JDS의 최종농도가 20, 50, 100 ㎍/㎖가 되도록 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후 PBS 100 ㎕를 넣은 후 세척하였다.
- /㎖의 농도가 되도록 접종한 후 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 배지를 제거하고 혈청이 포함되지 않은 배지를 이용하여 JDS의 최종농도가 20, 50, 100 ㎍/ ㎖가 되도록 처리하였다. 12시간 동안 배양 후 1% Triton X-100이 포함되어 있는 PBS 완충용액을 300 ㎕ 넣고 scrapping한 후 30분 정도 얼음 에서 세포를 용해시키고 10000 rpm에서 5분 동안 원심 분리 후 상층액을 이용하여 실험에 사용하였다.
- 7 세포가 들어있는 부유액 100 ㎕를 넣고 24시간 배양하였다. 배양 후 배지를 제거하고, 무혈청 배지에 최종 농도가 20, 50, 100 ㎍/㎖가 되도록 JDS 를 처리한 후 염증 반응 유도인자인 LPS를 100 ng/㎖의 농도로 처리하였다. 24시간 배양 후 배지를 이용하여 NO의 생성 정도를 측정하였다9).
- 7 세포가 들어있는 부유액 1 ㎖을 넣고 24시간 배양하였다. 배양 후 배지를 제거하고, 무혈청 배지에 최종 농도가 20, 50, 100 ㎍/㎖이 되도록 시료를 처리한 후 염증 반응 유도 인자인 LPS를 100 ng/ ㎖의 농도로 처리하였다. 세포를 scrapper를 이용하여 회수하여 12000 rpm에서 5분 동안 원심 분리한 후에 상층액을 제거하고, PBS를 이용하여 세척한 후 RIPA buffer를 100 ㎕씩 넣고 혼합한 후에 얼음에서 30분 동안 세포를 용해시켰다.
- 24시간 후 배지를 회수하여 12000 rpm으로 5분 동안 원심 분리하여 상층액을 회수하여 -70℃에서 보관하였다. 상온에서 측정 배지를 녹인 후 Calibrator Diluent를 사용하여 5배 희석하였고 또한 PGE2 standard를 2500, 1250, 625, 312.5, 156, 39의 농도가 되도록 Calibrator Diluent를 이용하여 희석하였다. 희석되어진 시료와 standard를 각 well에 100 ㎕씩 넣고, PGE2 conjugate와 PGE2 antibody 용액을 각각 50 ㎕씩 넣어준 후 shaker위에서 2시간 반응시킨 후 PGE2는 washing buffer를 이용하여 4~5번 세척하였다.
- 24시간 배양 후 배지를 이용하여 NO의 생성 정도를 측정하였다9). 세 포배양액 50 ㎕와 Griess시약 50 ㎕를 혼합하여 10분 동안 반응시킨 후 ELISA reader를 이용하여 540 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 양성 대조군으로는 NO 생성 억제제인 NMMA를 50 uM이 되도록 시료와 같은 방법으로 처리하여 NO 생성 저해 효능을 비교하였다.
- 세 포배양액 50 ㎕와 Griess시약 50 ㎕를 혼합하여 10분 동안 반응시킨 후 ELISA reader를 이용하여 540 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 양성 대조군으로는 NO 생성 억제제인 NMMA를 50 uM이 되도록 시료와 같은 방법으로 처리하여 NO 생성 저해 효능을 비교하였다.
- 단백질 정량 후 well당 35 ㎍ 정도의 단백질을 10% SDS-PAGE에 놓고 100 V에서 1시간 동안 전기영동을 수행하였다. 전기영동 후 PVDF membrane에 단백질을 옮긴 후 COX-2, iNOS 1차 antibody를 반응시킨 후 2차 Antibody를 반응하여 단백질의 발현 정도를 확인하였다. 단백질 보정을 위하여 β-actin도 함께 수행하였다.
대상 데이터
- Raw 264.7(Mouse Macrophage cell line) cell을 10% fetal bovine serum, penicillin(100 units/㎖), streptomycin(100 units/㎖)이 첨가된 DMEM 배지로 5% CO2, 37℃에서 배양하였으며, 배지는 3~4일 간격으로 교체하고 배양용기에 90% 이상 자라게 되면 계대 배양하여 실험에 사용하였다7).
- 본 실험에 사용된 한약재는《醫宗金鑒》에 수록된 顚倒散(JDS)의 처방에 따른 구성약물로 상지대학교부속한방병원 약제과에서 엄선하여 구입한 후 실험에 사용하였다(Table 1).
-
2) 균주 및 세포주
세포독성과 항염에 사용된 Raw 264.7(Mouse Macrophage cell line) 세포주는 한림대학교 TIC에서, 항산화에 사용된 HaCaT(Human Keratinocyte cell line) 세포주는 강원대학교 생화학과에서 분양 받아 사용하였다.
- 실험에 사용한 2,2-Diphenyl-1-picryl-hydrazyl (DPPH), Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT), Griess reagent, Dimethyl sulfoxide (DMSO), NG -methyl-L-arginine acetate salt (NMMA) Lipopolysaccharide(LPS)는 Sigma(USA)에서 구입하였으며 Fetal Bovine Serum(FBS), Penicillin-Streptomycin, Dulbecco's modified Egale's medium(DMEM)/High glucose는 Hyclone (USA)에서 구입하였다.
데이터처리
- 각 실험군 간의 통계적 유의성은 one-way ANOVA로 하였으며, 사후분석은 Duncan's multiple comparison test를 시행하였다.
- 실험 결과는 SPSS 10.0 for Windows를 사용하여 평균±표준편차로 표기하고 유의수준은 p<0.05 로 하였다.
이론/모형
- 세포를 scrapper를 이용하여 회수하여 12000 rpm에서 5분 동안 원심 분리한 후에 상층액을 제거하고, PBS를 이용하여 세척한 후 RIPA buffer를 100 ㎕씩 넣고 혼합한 후에 얼음에서 30분 동안 세포를 용해시켰다. 세포를 용해시킨 후 12000rpm에서 5분 동안 원심 분리하여 상층액을 이용하여 Bicinchoninc Acid(BCA)법을 이용한 단백질 정량을 수행하였다. 단백질 정량 후 well당 35 ㎍ 정도의 단백질을 10% SDS-PAGE에 놓고 100 V에서 1시간 동안 전기영동을 수행하였다.
성능/효과
- 1. 顚倒散의 에탄올 및 열수 추출물 모두 세포 독성이 없는 것으로 나타났다.
- 2. 顚倒散의 에탄올 및 열수 추출물은 PGE2 생성 저해능 실험에서 모두 유의성 있게 농도 의존적인 저해능을 보였다.
- 3. 顚倒散의 에탄올 및 열수 추출물은 NO 생성 저해능 실험에서 모두 유의성 있게 농도 의존적인 저해능을 보였다.
- 4. 顚倒散의 에탄올 및 열수 추출물은 TNF-⍺ 생성 저해능 실험에서 모두 유의한 결과가 나타나지 않았다.
- 5. 顚倒散의 에탄올 및 열수 추출물은 COX-2, iNOS 발현 억제능 실험에서 에탄올 추출 100 ㎍/㎖, 열수 추출 50, 100 ㎍/㎖의 농도에서 iNOS의 발현 억제능이 있는 것으로 나타났다.
- 6. 顚倒散의 에탄올 및 열수 추출물은 ROS 생성 저해능 실험에서 모두 유의성 있게 농도 의존적인 저해능을 보였으며, 에탄올 추출이 열수 추출보다 높게 나타났다.
- 7. 顚倒散의 에탄올 및 열수 추출물은 GSH의 합성 촉진능 실험에서 에탄올 추출물 100 ㎍/㎖ 농도에서만 32±5.2 %로 나타났다.
- 8. 顚倒散의 에탄올 및 열수 추출물은 DPPH 라 디컬 소거능 실험에서 모두 유의성 있게 농도 의존적인 소거능을 보였으며, 에탄올 추출이 열수 추출보다 높게 나타났다.
- JDS 에탄올 및 열수 추출물로 처리한 HaCaT 세포에 대한 DPPH 라디컬 소거능 실험에서 에탄올 및 열수 추출물 모두 유의성 있게 농도 의존적인 소거능을 보였으며, 20, 50, 100 ㎍/㎖의 농도에서 에탄올 추출이 열수 추출보다 높은 소거능을 보였고, 에탄올 추출 50, 100 ㎍/㎖의 농도에서는 동일한 소거능을 보였다(Table 8).
- JDS 에탄올 및 열수 추출물로 처리한 HaCaT 세포에 대한 ROS 생성 저해능 실험에서 에탄올 및 열수 추출물 모두 유의성 있게 농도 의존적인 저해능을 보였으며, 50, 100 ㎍/㎖의 농도에서 에탄올 추출이 열수 추출보다 높은 저해능을 보였다 (Table 6).
- JDS 에탄올 및 열수 추출물로 처리한 HaCaT 세포에 대한 세포내 GSH의 합성 촉진능 실험에서 에탄올 추출물 100 ㎍/㎖ 농도에서만 32±5.2 %로 나타났다(Table 7).
- JDS 에탄올 및 열수 추출물의 LPS로 유도된 Raw 264.7 세포에 대한 COX-2, iNOS 발현 억제능 실험에서 에탄올 및 열수 추출물 모두 COX-2의 발현 억제능은 나타나지 않았으나, 에탄올 추출 100 ㎍/㎖, 열수 추출 50, 100 ㎍/㎖의 농도에서 iNOS의 발현 억제능이 있는 것으로 나타났다(Fig. 1).
- JDS 에탄올 및 열수 추출물의 LPS로 유도된 Raw 264.7 세포에 대한 NO 생성 저해능 실험에서 에탄올 및 열수 추출물 모두 유의성 있게 농도 의존적인 저해능을 보였으며, 50, 100 ㎍/㎖의 농도에서 에탄올 추출보다 열수 추출이 높은 저해능을 보였다(Table 4).
- JDS 에탄올 및 열수 추출물의 LPS로 유도된 Raw 264.7 세포에 대한 PGE2 생성 저해능 실험에서 에탄올 및 열수 추출물 모두 유의성 있게 농도 의존적인 저해능을 보였으며, 20, 50 ㎍/㎖의 농도에서 에탄올 추출이 열수 추출보다 높은 저해능을 보였다(Table 3).
- JDS 에탄올 및 열수 추출물의 LPS로 유도된 Raw 264.7 세포에 대한 TNF-⍺ 생성 저해능 실험에서 에탄올 및 열수 추출물 모두 유의한 결과가 나타나지 않았다(Table 5).
- JDS 에탄올 및 열수 추출물의 Raw 264.7 세포에 대한 세포 독성 실험에서 열수 추출물 50, 100 ㎍/㎖의 농도는 90%의 세포 생존율을 보였으며, 나머지는 세포 독성이 나타나지 않았다(Table 2).
- 顚倒散 에탄올 및 열수 추출물로 처리한 HaCaT 세포에 대한 ROS 생성 저해능과 DPPH 라디컬 소거능 실험에서는 에탄올 및 열수 추출물 모두 유의성 있게 농도 의존적인 저해능과 소거능을 보 였으며(Table 6, 8), GSH의 합성 촉진능 실험에서는 에탄올 추출물 100 ㎍/㎖ 농도에서만 32±5.2 %로 나타났다(Table 7).
- 顚倒散 에탄올 및 열수 추출물의 LPS로 유도된 Raw 264.7 세포에 대한 PGE2 생성 저해능과 NO 생성 저해능 실험에서는 에탄올 및 열수 추출물 모두 유의성 있게 농도 의존적인 저해능을 보였으며(Table 3, 4), COX-2, iNOS 발현 억제능 실험 에서는 에탄올 추출 100 ㎍/㎖, 열수 추출 50, 100 ㎍/㎖의 농도에서 iNOS의 발현 억제능이 있는 것으로 나타났으며(Fig. 1), TNF-⍺ 생성 저해 능 실험에서는 에탄올 및 열수 추출물 모두 유의 한 결과가 나타나지 않았다(Table 5). 결과적으로 顚倒散 에탄올 및 열수 추출물의 항염 기전은 iNOS 효소를 억제하여 NO의 생성을 억제하는 것으로 이해할 수 있으며, NO 생성 저해능에서 50, 100 ㎍/㎖의 농도에서 에탄올 추출보다 열수 추출 이 높은 저해능을 보인 것으로 보아 열수 추출물 을 활용하는 것이 보다 효과적일 것이라 사려된다.
- 1), TNF-⍺ 생성 저해 능 실험에서는 에탄올 및 열수 추출물 모두 유의 한 결과가 나타나지 않았다(Table 5). 결과적으로 顚倒散 에탄올 및 열수 추출물의 항염 기전은 iNOS 효소를 억제하여 NO의 생성을 억제하는 것으로 이해할 수 있으며, NO 생성 저해능에서 50, 100 ㎍/㎖의 농도에서 에탄올 추출보다 열수 추출 이 높은 저해능을 보인 것으로 보아 열수 추출물 을 활용하는 것이 보다 효과적일 것이라 사려된다.
- 4의 세포 생존율을 보였다(Table 2). 따라서 에탄올 및 열수 추출 모두 안전하게 사용 될 수 있을 것으로 나타났다.
- 이상의 결과를 종합해 보면 顚倒散의 에탄올 및 열수 추출물은 세포 독성이 없으며, 두 추출물은 iNOS 효소를 억제하여 NO의 생성을 억제하는 것으로 항염 효과를 보일 것이라 사려된다. 항염에서는 열수 추출물을, 항산화능에서는 에탄올 추출물을 활용하는 것이 보다 효과적일 것이라 사려된다.
- 전체적으로 顚倒散의 에탄올 및 열수 추출물은 항염과 항산화능을 가지고 있는 것으로 나타났으며, 항염에서는 열수 추출이 항산화능에서는 에탄올 추출이 효과적일 것이라 사려된다.
후속연구
- 2 %로 나타났다(Table 7). 결과적으로 顚倒散은 항산화 기능으로 활성산소를 제거하는 기능을 가지고 있으며 동일 농도에서 에탄올 추출이 열수 추출보다 높은 저해능과 소거능을 가지고 있어 에탄 올 추출물을 활용하는 것이 보다 효과적일 것이라 사려된다.
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