선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 본 연구는 旱蓮草의 항염증효과를 평가하기 위하여 in vitro로 LPS로 활성화된 Raw 264.7 cell 에서의 염증매개물질 억제효과, in vivo로 carrageenan으로 유도된 rat의 paw edema에서 부종 및 염증세포침윤억제 효과등을 평가하였다.
- 본 연구에서는 먼저, 한련초추출물 (EH)의 항염 증효과를 평가하기 위하여 NO 생성억제정도를 관찰하였다. 이전의 연구들처럼24-32) LPS군에서는 control군에 비교하여 NO의 생성량이 유의하게 증가하였으며, 이러한 NO의 증가는 EH 25, 50, 100 μg/㎖에 의하여 유의한 억제를 나타내었다.
- receptor에 의한 Cl-channel활성화 연구 등이 보고되고 있으나, 한련초의 염증조절에 대한 연구는 미흡한 실정이다. 이에 본 연구에서는 한련초 추출물의 항염증작용을 평가하고자 실시하였다.
- 이에 저자는 한련초 추출물이 LPS로 활성된 Raw 264.7 cell에서의 cytokine에 미치는 영향 및 이러한 염증매개물질의 발현에 핵심적 역할을 하는 NF-κB의 변화를 살펴보고 또한 한련초 추출물이 in vivo에서 염증성병변을 억제할 수 있는지를 평가하고자 본 연구를 실시하였다.
제안 방법
- 4일째 약물을 투여하고 1시간 후 carrageenan을 투여하여 paw edema를 유발시켰다. Paw edema의 측정은 carrageenan을 주입한 후 시간별로 (0, 1, 2, 3, 4시간) 부종측정기 (Plethysmometer, LE 7500; LETICA Scientific Instruments, Spain)를 이용하여 부종 정도를 측정하였다.
- COX-2 activity는 Cayman chemical사 (MI, USA)의 assay kit를 사용하여 분석하였다. 먼저, 1 mM EDTA를 함유하는 0.
- Carrageenan으로 유도된 발부종의 조직학적 평가를 위하여 4시간째의 발부종 측정을 끝내고 실험동물을 희생하여 부종발의 발등 부분과 발바닥 부분에서 피부두께 및 침윤 염증세포를 측정하였다.
- EH가 LPS로 발현이 증가되는 염증매개단백질을 조절함에 따라, 염증매개단백질의 조절에 핵심적 역할을 하는 NF-κB에 미치는 EH의 영향을 평가 하였다.
- EH가 LPS에 의해 증가된 NO 및 PGE2를 억제함을 확인하고 이들의 상위에 있는 염증매개단백질의 발현을 평가하였다. 일반적으로 NO는 L-arginine으로부터 nitric oxide synthase (NOSs)를 경유하여 생성되고, PGE2는 COX-2를 경유하 여 생성되므로 이들의 발현에 대한 EH의 효능을 평가하였다.
- EH가 in vitro에서 IκBα의 인산화를 억제하여 염증매개물질을 억제함을 확인하고, in vivo에서도 유의한 항염증효능을 나타내는 지를 평가하기 위하여 carrageenan으로 발부종을 유도한 동물모델에서 발 부종의 정도 및 염증세포 침윤, 피부의 두께 등을 측정하였다.
- EH가 paw edema에 미치는 영향을 살펴보기 위해, carrageenan으로 염증이 유발된 rat의 오른쪽 하지의 발목아래를 절단하여 조직을 채취하여, 발등 및 발바닥의 피부 실질조직을 분리하여 10% 중성포르말린에 6시간 이상 고정시킨 다음 탈수 및 파라핀 포매를 실시하고, 3∼4 μm의 longitudinal 절편을 제작하여 Hematoxylin-eosin 염색을 실시하고, 광학현미경 (Nikon, Japan)하에서 관찰하였다.
- Kim et al23)의 방법을 변형시켜, 발등 및 발바닥 피부의 두께를 mm 단위로 40배 현미경 시야에서 자동영상분석장치 (DMI-300 Image Processing; DMI, Korea)를 이용하여 측정하였으며, 1 mm2의 발등 및 발바닥 피부에 침윤된 염증세포의 수 역시 자동영상분석장치를 이용하여, 200배 현미경 시야에서 측정하였다.
- Cytokine을 측정하기 위하여 6 well plate에 cells (5×105/ ㎖)을 분주하고 EH를 농도별로 처치한 다음, 1시간 후에 LPS를 처치하였다. LPS 처치 후 각 cytokine마다 특정 시간에 배지를 수거 하여 cytokine을 측정하였다. 수거된 배지는 바로 측정하거나, 측정전까지 -70℃에서 보관하였다.
- PGE2 assay kit와 COX-2 activity assay kit는 각각 R&D Systems (Minneapolis, MN, USA)와 Cayman chemical사 (Ann Arbor, MI, USA)로부터 구입한 assay kit를 사용하여 분석하였다.
- 4일째 약물을 투여하고 1시간 후 carrageenan을 투여하여 paw edema를 유발시켰다. Paw edema의 측정은 carrageenan을 주입한 후 시간별로 (0, 1, 2, 3, 4시간) 부종측정기 (Plethysmometer, LE 7500; LETICA Scientific Instruments, Spain)를 이용하여 부종 정도를 측정하였다.
- Raw 264.7 세포주로부터 생성된 NO의 양은 세포 배양액 중에 존재하는 NO2-의 형태로서 Griess 시약을 이용하여 측정하였다. 즉, 세포배양 상등액 50 μl와 Griess시약 (1% sulfanilamide in 5% phosphoric acid + 1% α-naphthylamide in H2O)50 μl를 96 well plates에 혼합하고 암실에서 10분 동안 반응시킨 후 540 nm에서 Titertek Multiskan Automatic ELISA microplate reader (Model MCC/340, Huntsville, AL)로 흡광도를 측정하였다.
- TNF-α, IL-1β와 IL-6는 ELISA Kit (Pierce endogen, Rockford, IL, USA)를 사용하여 측정하였다.
- dexamethasone과 EH는 4일 동안 매일 1회 투여하였으며, 마지막 약물투여 1시간 후 carrageenan을 100 μl/rat로 rat의 오른쪽 발바닥에 주입하였다.
- iNOS와 IκBα protein의 band는 ECL western blotting detection reagents (Amersham)를 사용하여 발색 하였다.
- iNOS의 발현은 antimouse iNOS antibodies를 사용하여 면역화학적 방법으로 분석하였으며, anti p-IκBα antibody를 사용하여 p-IκBα protein을 측정하였다.
- iNOS와 IκBα protein의 band는 ECL western blotting detection reagents (Amersham)를 사용하여 발색 하였다. 발색 후 각 단백질의 발현량을 평가하기 위하여 image analyzing system (Ultra-Violet Products Ltd., Upland, CA, USA)을 이용하여 densitometric analysis를 실시하였다.
- 배양 후 생존세포에 MTT (0.1 mg/㎖)를 50 μl넣고 4시간 배양한 후 배지를 조심스럽게 제거하고 생성된 formazan crystals 을 DMSO에 녹여 Titertek Multiskan Automatic ELISA microplate reader (Model MCC/340, Huntsville, AL)를 사용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 세포에 25, 50, 100 μg/㎖의 농도로 EH를 전처치한 후에 37℃, 5% CO2의 환경이 유지되는 배양기에서 배양하였다.
- 실험은 기염제인 carrageenan (Sigma Chemical Co., St. Louis, USA; 100 μl/rat)만을 피하주사한 군을 carrageenan군으로 하였으며, carrageenan으로 염증을 유발하고 dexamethasone (1 mg/kg, P.O)을 투여한 dexamethasone군, 0.1 g/kg의 한련초를 전투여하고 carrageenan을 주사한 0.1 g/kg EH군, 0.3 g/kg의 한련초를 전투여하고 carrageenan을 주사한 0.3 g/kg EH군으로 나누었으며, 각 군당 n수는 6마리로 하였다.
- 즉, 세포배양 상등액 50 μl와 Griess시약 (1% sulfanilamide in 5% phosphoric acid + 1% α-naphthylamide in H2O)50 μl를 96 well plates에 혼합하고 암실에서 10분 동안 반응시킨 후 540 nm에서 Titertek Multiskan Automatic ELISA microplate reader (Model MCC/340, Huntsville, AL)로 흡광도를 측정하였다.
- 68 g을 얻었으며, 사용 때까지 -20℃에서 보관하였다. 한련초 추출물의 수율은 2.84 %였으며 in vitro처치시에는 DMSO에 녹여 사용하였으며, in vivo실험에서는 PEG에 녹여 사용하였다.
- 한련초추출물 (EH)의 항염증 효능을 평가하기 위하여, LPS로 활성화된 설치류 대식세포주인 Raw 264.7 cells에서의 NO의 생성량, iNOS, COX-2, p-I κ B α , NF κ B의 발현 및 IL-1β, IL-6, TNF- α , PGE2에 미치는 EH의 영향 및 carrageenan으로 유도된 rat의 paw edema에 미치는 영향을 살펴본 바 다음과 같은 결론을 얻었다.
대상 데이터
- LPS (Escherichia coli 026:B6; Difco, Detroit, MI, U.S.A.)와 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazoleum (MTT)은 Sigma (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였고, fetal bovine serum (FBS)과 antibiotics는 Gibco/BRL (Eggenstein, Germany)로부터 구입하였으며, Antibody는 BD Bioscience (San Jose, CA, USA), Cayman (Ann Arbor, Mi, USA), Zymed (San Francisco, CA, USA)에서 구입하였고, NC paper는 Schleicher & Schuell (Dassel, Germany )에서 구입하였다.
- TNF-α, IL-1β와 IL-6의 ELISA Kit는 Pierce endogen (Rockford, IL, USA)에서 구입하였다.
- 실험과정의 모든 cells은 80∼90%의 confluence에서 실험하였고, 20 passages를 넘기지 않은 cell만 사용하였다.
- 실험동물은 4주령 된 Sprague-Dawley계 수컷 흰쥐를 Samtaco Bio Korea (오산, 한국)로부터 공급받아 1주일 동안 실험실환경에 적응시킨 후 실험에 사용하였으며, 사육실 환경은 온도 20-23℃, 습도 60%, 12시간 light/dark cycle을 유지하고, 사료 (Nestle Purina Petcare Korea, Seoul, Korea)와 음료는 자유롭게 섭취하도록 하였다.
- 한국세포주연구재단 (Seoul, Korea)에서 구입한 Murine macrophage cell line인 Raw 264.7 cells 은, Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)에 10% fetal bovine serum (FBS), 100 U/㎖ penicillin 및 100 μg/㎖ streptomycin을 혼합한 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 incubator (Sanyo, Japan)에서 배양하였다.
- 한련초 (EH)는 대원약업사 (대구, 한국)에서 구입하여 관능평가를 한 후, 200 g을 MeOH 1 L에 넣고 72시간 추출한 후 추출물을 거어즈로 1차 여과하고 3000×g에서 3분간 원심분리하였다.
데이터처리
- with three separate experiments. One-way ANOVA was used for comparisons of multiple group means followed by Newman - Keuls test.
- 실험 결과는 mean ± S.D.로 나타내었으며, 처치군간의 유의성은 one way analysis of varience (ANOVA)로 검정한 후 Newman-Kleuls test로 검정하였다.
이론/모형
- 핵분획은 Cho등의22) 방법에 따라 제조하였다.
성능/효과
- 1. LPS에 의해 증가된 NO는 EH 25, 50, 100 μ g/㎖의 전처치에 유의하게 억제되었으며, EH+LPS는 LPS 단독처치군에 비교하여 세포독성을 나타내지 않았다.
- 2. EH는 LPS로 증가된 TNF-α, IL-1β, IL-6, PGE2등의 염증매개물을 유의하게 억제하였다.
- 3. EH는 LPS에 의해 증가된 iNOS의 발현을 유의하게 감소시켰으며, LPS에 의해 증가된 COX-2 activity를 유의하게 억제하였다.
- 4. EH는 LPS에 의해 증가된 NF κ B의 억제단백질인 I κ B α 의 인산화를 억제하고, 또한 핵분획 에서의 NF κ B의 발현량을 억제하였다.
- 5. EH는 carrageenan으로 유도된 rat의 paw edema에 대하여 부종정도를 유의하게 억제하였으며, 염증조직에서의 침윤염증세포 및 두께를 유의성있게 감소시켰다.
- 그러나, COX-2는 LPS 처리시에는 발현이 다량 증가되었으나, EH는 전 농도에서 COX-2의발현을 억제하지 못하였다. EH가 COX-2의 발현을 억제하지 못한 까닭에, COX-2의 activity를 평가한 결과, COX-2 activity는 LPS에 의하여서는 유의하게 증가되었으며, EH는 전 농도에서 유의하게 COX-2의 activity를 감소시켰다. 이러한 결과는 EH가 NO를 억제함에는 iNOS의 억제에서 기인하고, PGE2를 억제하는 데에는 COX-2 단백질의 발현을 억제함에서 기인하는 것이 아니라, COX-2 activity를 억제함에서 기인함을 나타내고 있다.
- LPS 처치시에는 iNOS의 발현이 유의하게 증가 되었으나, EH 25, 50, 100 μg/㎖을 처치한 실험 군에서는 iNOS의 발현량이 모두 유의하게 감소하 였다.
- 이전의 연구들처럼24-32) LPS군에서는 control군에 비교하여 NO의 생성량이 유의하게 증가하였으며, 이러한 NO의 증가는 EH 25, 50, 100 μg/㎖에 의하여 유의한 억제를 나타내었다. 또한, 동일 농도, 동일 시간에서 EH+LPS는 LPS 단독처리군에 비교하여 유의한 세포독성을 나타내지 않았다. 이러한 결과는 한련초가 NO의 생성억 제에 직접 관여됨을 의미한다.
- 본 실험에서 LPS는 유의성있게 PGE2의 생성을 증가시켰으며, EH는 25, 50, 100 μg/㎖에서 LPS로 유도된 PGE2를 유의성 있게 감소시켰다.
- 본 실험의 결과, 발등피부의 두께는 carrageenan 군이 1.88 ± 0.13 mm였으며, dexamethasone 처치군에서는 0.80 ± 0.07로 유의하게 감소하였으며, EH 0.1 g/kg를 처치한 실험군에서는 1.86 ± 0.12로 유의한 변화를 나타내지 않았으나, EH 0.3 g/kg를 처치한 실험군에서는 1.12 ± 0.18로 유의한 감소를 유도하였다.
- 본 연구에서 LPS는 TNF-α 및 IL-6의 분비를 유의성 있게 증가시켰으며, 이러한 증가는 EH 25, 50, 100 μg/㎖의 농도에서 유의성 있게 감소하였다.
- 본 연구에서 p-IκBα는 LPS 처치에 의하여 CON에 비교하여 유의하게 증가하 였으나, EH의 전처치에 의하여 유의하게 감소되었다.
- 본연구의 결과, 부종 발의 발등 조직 및 발바닥 조직에서 침윤 염증세포의 수는 이전의 보고와 같이21-24) carrageenan군에서 유의성 있게 증가하였으며, dexamethasone 및 EH 0.1, 0.3 g/kg의 전처 치에 의해 유의하게 감소되어, EH가 in vitro에서 뿐만아니라, in vivo에서도 유의한 항염증작용을 나타내었다.
- 부종 발의 발바닥 조직에서의 침윤염증세포는 carrageenan군에서 1061.00 ± 166.18 cells/mm2로 유의한 증가를 나타내었다.
- 이러한 결과로 보아, EH의 항염증작용은 I κ B α 의 인산화를 억제하여 NFκB가 핵으로 전위되는 기전을 억제하고, 그 결과로 염증매개물질을 억제함을 나타낸다.
후속연구
- 과 Viburnum trilobum 50, 100, 500 μg의 농도에서 의존적으로 억제되지 못한 결과를 보고한 적이 있으며, Yoon 등32)의 연구에서도 IL-3, IL-17이 농도의존적으로 억제되지 못한 결과를 제시한 적이 있으나, 이러한 이유에 대하여서는좀 더 연구의 필요성이 있을 것으로 생각된다.
- 한의학 개념으로 구강으로 투여되는 모든 水穀 은 腐熟과 運化에 의해 효능을 나타내는 것처럼, 일반적으로 한약재의 조추출물은 소화관을 통과하 면서 다양한 효소 및 장내 미생물의 영향을 받게 되고 또한 흡수에 있어서도 다양한 변수가 존재하므로, in vitro의 결과가 in vivo에 바로 적용되기가 쉽지 않다. 그러나 본 연구에서 사용된 EH는 in vitro뿐만 아니라, in vivo에서도 유의한 결과를 유도하였으므로, EH는 염증성질환의 예방과 치료에 적극적으로 응용될 수 있을 것으로 판단된다.
- 이러한 결과로 보아, EH의 항염증작용은 I κ B α 의 인산화를 억제하여 NFκB가 핵으로 전위되는 기전을 억제하고, 그 결과로 염증매개물질을 억제함을 나타낸다. 또한 carrageenan으로 유도된 rat의 paw edema에 대하여 부종의 정도 및 염증반응을 유의성 있게 억제하였으므로, EH는 과도한 염증성 질환의 예방과 치료에 적극 활용될 수 있을 것으로 판단된다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.