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문제 정의
- 그러나 기존의 항암제의 사용에는 부작용이 있어, 그 사용에 제약을 받고 있다. 따라서 이번 연구에서는 이러한 부작용을 줄이고 항암효과를 증대시키기 위한 일환으로, 면역 증강에 탁월한 활성을 보이는 변이 효모 유래의 베타글루칸인 IS-2와 대표적인 항암제인 cisplatin의 병용 처리에 의한 cytokine의 변화와 종양 전이 억제력을 조사하여 항암제 사용시의 보조제로써의 가능성을 확인해 보았다.
- 이번 연구에서는 항암제 사용에 있어서의 부작용을 완화하고 암세포 특이적인 항암활성을 높이기 위하여, 선행연구에서 활성이 확인된 효모변이주 유래의 베타글루칸과 cisplatin의 단독 및 병용 처리시의 면역관련 cytokine의 변화와 종양 전이 억제 등에 관하여 조사함으로써 부작용을 감소시키는 항암치료 보조제로서의 가능성을 평가하였다.
제안 방법
- BALB/c mouse에 colon26-M3.1 세포주를 마우스 당 3⨯104 cells를 정맥주사로 주입하였고, 암 접종 하루 후에 농도별로 베타글루칸 및 cisplatin을 단독 또는 병용 처리하였다. 암세포 주사 후에 2주 경과 후, 폐를 적출하여 Bouin's solution에 전이된 종양을 고정하였으며, 현미경으로 colony의 수를 확인하였다.
- S. cerevisiae 균주를 YDP 배지에 접종하여 대수기 중기까지 배양시킨 후 700 rpm 15분간 원심분리하고 1～2⨯108 cell/㎖가 되도록 희석하여 3회 멸균수로 세척하고 돌연변이원인 NTG(N-methyl-N'-nitro-guanidine, Sigma, USA)를 이용하여 생존율이 0.1%가 되도록 변이를 유발하였다.
- 고용량의 항암 화학요법은 암 증식 억제에 효과적이나 면역계의 심각한 손상을 초래하는 부작용이 있다. 따라서 이번 실험에서는 cisplatin의 암세포 전이가 최대로 발생하는 농도를 파악하기 위해 BALB/c mouse에 colon26-M3.1 lung carcinoma를 정맥주사하여 농도별(5～80 ㎍)로 cisplatin를 단독처리하고 암세포 전이의 양상을 조사하였다. 그 결과, 5～20 ㎍ 농도에서 전이정도가 증가하여 20 ㎍에서 가장 높은 암전이가 관찰되었으며, 고농도인 80 ㎍에서는 암 전이가 억제되었다(Fig.
- 2). 따라서 적은 용량으로 cisplatin의 부작용을 줄이고 항암능력을 극대화하기 위해, 가장 높은 암 전이를 보인 20㎍ 농도를 기준으로 IS-2와 WT를 병용 처리하여 암 전이 억제능을 측정하였다.
- 마우스를 경추탈골법으로 희생시킨 후에 비장을 무균적으로 적출하여 10% FBS와 항생제(100 U/㎖ of penicillin, 100 ㎍/㎖ of streptomycin)가 함유된 RPMI-1640 배양액으로 세척 후에 분쇄하여 세포를 유리시켰다. 분리된 세포액은 lysing buffer(BD Biosciences, USA)를 이용하여 적혈구를 제거한 후에 혈구계수기를 이용하여 세포수를 측정하였다.
- 암세포 주사 후에 2주 경과 후, 폐를 적출하여 Bouin's solution에 전이된 종양을 고정하였으며, 현미경으로 colony의 수를 확인하였다.
- 이번 연구에서는 IS-2 단독 투여 후, 담암 마우스의 비장세포를 F/T lysates로 재자극하여 대표적인 면역조절 관련 cytokine인 IFN-γ, IL-10 그리고 IL-12의 변화를 관찰하였다.
- 종양 전이 억제능을 평가하기 위해서 마우스 폐암 세포주인 colon26-M3.1 세포주가 사용되었으며, 배양조건은 열처리로 비활성화한 FBS 6%, 비필수 아미노산, penicillin 100 U/㎖ 그리고 streptomycin 100 ㎍/㎖가 첨가된 EMEM 배지에서 37℃, 5% CO2의 배양조건을 유지하였다.
- 효모의 변이의 유도와 선별은 Carlton 등(1981)과 Park 등(2003)의 방법을 응용하여 사용하였다. S.
대상 데이터
- 실험동물은 6주령의 암컷 BALB/c mouse를 (주)나라바이오텍으로부터 구입하여, 건국대학교 동물사육실내의 SPF실에서 1주일간 적응시킨 후에 사용하였다.
데이터처리
- Significance difference between normal and control was determined by Student’s t-test(✝<0.001).
- 모든 실험결과의 측정치는 mean±S.E로 나타내었고, 각 평균치간 차이에 대한 유의성은 GraphPad Prism(version 2.0, USA)를 이용하여 Student’s t-test와 one way analysis of variance(ANOVA)로 분석하였다.
- 0, USA)를 이용하여 Student’s t-test와 one way analysis of variance(ANOVA)로 분석하였다. 사후검정으로 Tukey test를 5% 유의수준으로 시행하였다.
이론/모형
- IS-2와 WT 그리고 cisplatin을 단독 혹은 병용 처리한 마우스 비장세포 배양액 내의 cytokine(IL-2, IL-4, IL-10, IL-12, GMCSF, IFN-γ)의 농도는 ELISA kit(Pharmingen Co., USA)를 이용하여 측정하였으며, 회사의 실험 방법에 준하였다.
- 세포벽으로부터 베타글루칸의 추출은 Kelly & Edmund(2001)의 방법을 응용하여 이용하였다.
성능/효과
- Fig. 3에서 보이는 바와 같이 IS-2 및 WT의 단독처리가 cisplatin의 단독처리보다 암 전이를 유의적(p<0.01)으로 억제하였고, 각각의 베타글루칸과 cisplatin의 병용 처리가 단독 처리보다 높은 암전이 억제능을 나타내었다.
- Th1 type cytokine인 INF-γ, IL-2는 tumor control 군에 비하여 cisplatin 혹은 IS-2를 단독처리할 경우에 유의한 차이를 보이지 않았으나, cisplatin과 IS-2를 병용 처리한 결과에서는 tumor control에 비하여 cytokine의 생산량이 유의적으로(p<0.05) 높았다.
- 결론적으로 IS-2의 처리는 항원제시세포의 분화를 촉진하는 GM-CSF의 생산유도능과 함께, 종양에 대하여 살해능을 가진 effector cytotoxic T lymphocyte의 유도에 직접 관여하는 IFN-γ 및 IL-2의 생산활성을 증진시킴으로써 암에 대한 치료효과를 증진시키는 보조제(adjuvant)로써의 활성이 있는 것으로 보인다.
- 1 lung carcinoma를 정맥주사하여 농도별(5～80 ㎍)로 cisplatin를 단독처리하고 암세포 전이의 양상을 조사하였다. 그 결과, 5～20 ㎍ 농도에서 전이정도가 증가하여 20 ㎍에서 가장 높은 암전이가 관찰되었으며, 고농도인 80 ㎍에서는 암 전이가 억제되었다(Fig. 2). 따라서 적은 용량으로 cisplatin의 부작용을 줄이고 항암능력을 극대화하기 위해, 가장 높은 암 전이를 보인 20㎍ 농도를 기준으로 IS-2와 WT를 병용 처리하여 암 전이 억제능을 측정하였다.
- 그 결과, IS-2는 면역을 증강하는 Th1 type cytokine인 INFγ, IL-2 및 IL-12, 분비를 증가시키는 반면, 면역 억제를 보이는 Th2 type의 cytokine인 IL-4 및 IL-10 분비는 억제하였다.
- IL-10은 주로 Th1 type cytokine 합성 저해인자로, IFN-γ와 상반된 역할을 보이는 cytokine으로 macrophage의 항원제시 반응을 저해시킨다(Fiorentino 등 1991; Lin & Karin 2007). 따라서, 이번 실험결과에서 면역관련 cytokine의 생성과 억제에 IS-2가 효과적으로 작용하여 면역력을 증강시키는 것이 확인되었다.
- 또한, 백혈구 증식을 돕는 GM-CSF와 같은 cytokine의 분비도 증가시켰다. 종양세포 전이 억제를 확인한 실험에서는 cisplatin과 IS-2의 병용 처리가 가장 높은 전이 억제력을 나타내었다.
- 01)으로 억제하였고, 각각의 베타글루칸과 cisplatin의 병용 처리가 단독 처리보다 높은 암전이 억제능을 나타내었다. 특히, IS-2와 cisplatin의 병용 처리가 WT과의 처리에 비해서도 높은 전이 억제 활성을 보였다.
후속연구
- 이러한 결과를 종합해 볼 때, 변이를 유발한 S. cerevisiae 균주의 세포벽에서 추출한 베타글루칸인 IS-2는 Th1과 Th2 Type cytokines의 분비를 조절하여 소량의 cisplatin 투여로도 항암효과를 증강시키며, 이러한 IS-2의 특성은 cisplatin 투여에 의한 부작용을 완화하고 항암효능을 증강시킬 수 있는 보조제로써의 충분한 개발 가능성을 시사해준다.
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