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문제 정의
- 하지만 운동과 전침이 운동실조와 같은 신경행동학적 장애를 치료하기 위해 임상에서 널리 사용되고 있음에도 불구하고, 이를 통한 치료적 중재가 어떠한 기전을 통해 운동기능 회복을 촉진하는지에 대해 알려진 바가 부족하다. 그러므로 본 연구에서는 3-AP에 의한 운동실조 흰쥐에게 운동과 전침을 적용하여 운동기능 회복과 후지의 근활성도, BDNF 농도에 대한 치료적 근거를 마련할 뿐만 아니라 새로운 치료적 중재에 접근할 수 있는 토대를 마련하고자 한다.
제안 방법
- 실험동물은 생후 12주령의 체중 290±10g의 SpagueDawley계 수컷 흰쥐 30마리를 이용하였고, 실험실은 일정한 조건(온도 22±2℃, 습도 55±5%)을 유지하였다. 1일 12시간의 광주기와 12시간의 암주기를 적용하였고, 실험 기간 동안 물과 먹이는 자유롭게 섭취하도록 하였다. 실험동물은 6마리씩 5군으로 체중이 비슷한 것끼리 배정하여 3-AP를 투여하지 않은 대조군과 3-AP를 투여한 실험군(3-AP군), 3-AP 투여 후 로타로드 운동을 적용한 운동군, 전침을 적용하는 전침군, 로타로드 운동과 전침을 함께 적용하는 운동전침군으로 분류하였다.
- 침전극의 삽입으로 인한 삽입전위가 2-3초 이내에 소실되면, 체중지지를 하지 않는 상태로 실험쥐를 안정화시켜 활동전위를 10초 동안 3회 반복 측정하였다. 2분 간의 휴식기간을 준 다음, 체중지지를 하고 서 있는 동안 비복근의 활동전위를 10초 동안 3회 반복 측정하였다. 각각 측정된 10초 동안의 자료값을 RMS 처리한 후, 처음과 마지막 2초를 제외한 중간 6초 동안의 평균 근전도 신호량을 분석하였다.
- 3-AP 투여로 운동실조가 유발된 후지의 근활성도를 측정하기 위해, 비복근 근활성도를 근전도 MP-150 WSW(BIOPAC System Inc. CA, USA)로 측정하였다. 수집된 근전도 신호는 Acqknowledge 3.
- 3-AP(Sigma Chemical C., St. Louis, MO, USA)를 증류수에 녹여 50 mg/kg이 되도록 조제하여 복강 내 투여 하였다. 3-AP를 투여하고 1-6일 지난 후 하올리브핵이 제거되어 소뇌의 퍼킨제세포에 영향을 준다는 보고에 따라, 5일 후부터 실험을 실시하였다.
- Louis, MO, USA)를 증류수에 녹여 50 mg/kg이 되도록 조제하여 복강 내 투여 하였다. 3-AP를 투여하고 1-6일 지난 후 하올리브핵이 제거되어 소뇌의 퍼킨제세포에 영향을 준다는 보고에 따라, 5일 후부터 실험을 실시하였다. 모든 실험군의 쥐는 Watanabe 등(1997)에 의해 분류된 보행점수가 -2점에 해당되는 쥐들로 배치하였고, 균형 능력이 감소하여 머리와 앞다리, 체간이 좌우로 흔들리는 정도가 심한 실험쥐는 실험에서 배제하였다[표 1][32].
- Changes in the maximal height of vertical jump(MHVJ) after 3-AP treatment. The MHVJ was measured before and 7, 14days after apply of each interventions. The MHVJ significantly decreased upon 3-AP treatment compared with control group(p<.
- A change in the muscle activity after 3-AP treatment. The activities of gastrocnemius muscle were measured before and 7, 14days after apply of each interventions. The muscle activity significantly increased upon 3-AP treatment compared with control group(p<.
- 2분 간의 휴식기간을 준 다음, 체중지지를 하고 서 있는 동안 비복근의 활동전위를 10초 동안 3회 반복 측정하였다. 각각 측정된 10초 동안의 자료값을 RMS 처리한 후, 처음과 마지막 2초를 제외한 중간 6초 동안의 평균 근전도 신호량을 분석하였다. 근전도 신호량에 대한 표준화(normalization)는 서 있는 동안의 RMS 값을 안정상태의 RMS 값에 대해 표현하는 %RVC(Reference voluntary contraction)로 처리하였다[35].
- 로타로드 운동과 전침이 혈청 BDNF 농도에 미치는 영향을 알아보기 위해, 혈액을 원심분리 시킨 후 혈청의 BDNF 농도를 ChemikineTM Brain Derived Neurotrophic Factor(BDNF) 키트를 이용하여 효소면역측정법(Enzyme Immunoassay, EIA)으로 분석하였다. 96 well plate에 100㎕의 표준용액과 샘플을 첨가하고, 2∼8℃에서 12시간 동안 배양한 다음, 250㎕의 washing buffer를 사용하여 4회 수세하였다.
- Tetramethybenzidine(TMB)를 실온에서 따뜻하게 만들고, 각 well에 100㎕의 TMB/E 기질용액을 첨가하고 실온에서 15분 동안 배양하였다. 마지막으로 각 Well에 100㎕의 정지 용액을 첨가하여 반응을 정지 시키고, 450nm에서 각 well의 흡광도를 측정하였다.
- 근전도 신호량에 대한 표준화(normalization)는 서 있는 동안의 RMS 값을 안정상태의 RMS 값에 대해 표현하는 %RVC(Reference voluntary contraction)로 처리하였다[35]. 모든 실험군의 근활성도는 3-AP의 투여 5일 후 치료를 시작하기 전, 치료시작 7일, 그리고 14일에 측정하였다.
- 본 실험에서는 직경 7㎝, 15㎝간격의 칸막이가 6개로 구성되어 있고 높이가 60㎝의 회전 가능한 원통형의 봉으로 구성되어있는 로타로드(rotarod)를 이용하여 운동을 적용하였다. 운동군과 운동전침군은 3-AP 처치 5일 후부터 로타로드 운동을 20rpm의 회전속도로 매일 20분간 2주 동안 실시하였다[26].
- 1일 12시간의 광주기와 12시간의 암주기를 적용하였고, 실험 기간 동안 물과 먹이는 자유롭게 섭취하도록 하였다. 실험동물은 6마리씩 5군으로 체중이 비슷한 것끼리 배정하여 3-AP를 투여하지 않은 대조군과 3-AP를 투여한 실험군(3-AP군), 3-AP 투여 후 로타로드 운동을 적용한 운동군, 전침을 적용하는 전침군, 로타로드 운동과 전침을 함께 적용하는 운동전침군으로 분류하였다.
- 실험동물을 이용한 본 연구의 특성상, 비복근의 근활성도 측정을 위해 침전극을 이용하였고, 근전도 신호량을 표준화하기 위해 %RVC 방법을 적용하였다. %RVC는 힘이 적게 들어가는 동작인 경우 민감성을 높이기 위해 다양하게 사용되는 표준화 방법이다[35].
- 본 실험에서는 직경 7㎝, 15㎝간격의 칸막이가 6개로 구성되어 있고 높이가 60㎝의 회전 가능한 원통형의 봉으로 구성되어있는 로타로드(rotarod)를 이용하여 운동을 적용하였다. 운동군과 운동전침군은 3-AP 처치 5일 후부터 로타로드 운동을 20rpm의 회전속도로 매일 20분간 2주 동안 실시하였다[26].
- 운동실조로 인한 후지의 근활성도 변화를 측정하기 위해, 비복근 근활성도를 측정하였다. 3-AP군의 비복근 근활성도는 10.
- 또한 3-AP는 소뇌의 조롱박세포로 향하는 아래올리브핵을 선택적으로 파괴하기 때문에, 이를 이용한 많은 소뇌손상 모델의 연구들이 진행되어 왔다[38]. 이러한 결과를 토대로 본 연구에서는 흰쥐에게 3-AP를 투여하여 운동실조를 유발한 다음, 로타로드 운동과 전침을 적용하고, 최대수직점핑높이, 비복근의 근활성도와 혈청 BDNF 농도를 측정하였다. 3-AP 투여 5일 후 운동실조와 불안정한 보행, 균형감소와 같은 특이적인 소뇌손상 징후들이 관찰되었는데, 모든 실험군에서 골반과 꼬리를 위로 올리고 후지를 지나치게 굴곡 신전하며 걷는 mud-walking이 나타났다[8].
- 이상과 같이 3-AP 투여는 mud-walking과 같은 운동실조를 일으키고, 소뇌의 운동협응과 조절능력을 손상시켰다. 운동실조 유발 후 최대수직점핑높이의 감소 및 비복근 근활성도의 증가가 나타났으나, 로타로드 운동과 전침 적용 이후 최대수직점핑높이는 증가하였고, 비복근 근활성도는 감소하는 경향을 보였다.
- 족삼리(슬관절에서 약 10㎜ 아래, 전경골근 위)의 위치는 선행연구를 참고하여 확인하였다[27-30][33]. 전침 적용 시 실험동물을 움직이지 못하도록 고정틀에 고정한 후, 족삼리에 해당하는 전경골근 부위를 소독하고, 전침 치료기구(Es-160, ITO, Japan)를 이용하여 1.5V, 2㎐, 0.1㎳로 매일 15분간 2주 동안 적용하였다[31].
-
2.3 전침적용
전침군과 운동전침군은 3-AP 처치 5일 후부터 족삼리 위치에 해당하는 전경골근에 전침을 적용하였다. 족삼리(슬관절에서 약 10㎜ 아래, 전경골근 위)의 위치는 선행연구를 참고하여 확인하였다[27-30][33].
- 실험쥐가 뛰어 오르는 동안 10초 간격으로 높이를 3회 측정하여 그 중 가장 높은 높이를 사용하였다[7]. 최대수직점핑높이는 3-AP의 투여 5일 후 치료를 시작하기 전, 치료시작 7일, 그리고 14일에 측정하였다.
- 근전도 신호수집을 위해 비복근은 슬와부의 중심선으로부터 하내측 표면에, 근복이 두드러진 부위에 침전극을 삽입하였다[34]. 침전극의 삽입으로 인한 삽입전위가 2-3초 이내에 소실되면, 체중지지를 하지 않는 상태로 실험쥐를 안정화시켜 활동전위를 10초 동안 3회 반복 측정하였다. 2분 간의 휴식기간을 준 다음, 체중지지를 하고 서 있는 동안 비복근의 활동전위를 10초 동안 3회 반복 측정하였다.
- 후지의 근력과 운동기능 회복을 평가하기 위해 최대 수직점핑높이 검사를 실시하였다. 전기(1.
대상 데이터
- 실험동물은 생후 12주령의 체중 290±10g의 SpagueDawley계 수컷 흰쥐 30마리를 이용하였고, 실험실은 일정한 조건(온도 22±2℃, 습도 55±5%)을 유지하였다.
데이터처리
- 0 프로그램을 사용하였다. 각 실험군 간의 최대수직점핑높이와 비복근 근활성도의 비교를 위해 이요인 분산분석(two-way ANOVA)를 실시하였다. 또한, 혈청 BDNF 농도의 변화를 비교하기위해 일원배치분산분석(one-way ANOVA)를 실시하였고, 각 실험군 간의 차이를 알아보기 위해 LSD 사후검정을 실시하였다.
- 근전도 신호의 표본추출율은 1,000Hz로 설정하였고, 주파수폭필터(band pass filter) 50～500Hz와 노치 필터(notch filter) 60Hz를 이용하였다. 각 실험군의 근전도 신호는 제곱 평균 제곱근법(Root mean square, RMS)으로 처리하여 분석하였다. 근전도 신호수집을 위해 비복근은 슬와부의 중심선으로부터 하내측 표면에, 근복이 두드러진 부위에 침전극을 삽입하였다[34].
- 각 실험군 간의 최대수직점핑높이와 비복근 근활성도의 비교를 위해 이요인 분산분석(two-way ANOVA)를 실시하였다. 또한, 혈청 BDNF 농도의 변화를 비교하기위해 일원배치분산분석(one-way ANOVA)를 실시하였고, 각 실험군 간의 차이를 알아보기 위해 LSD 사후검정을 실시하였다. 모든 통계검정의 유의수준 α는 0.
- 모든 실험 결과는 평균±표준편차로 표시하였고, 자료처리는 SPSS Win 17.0 프로그램을 사용하였다.
- CA, USA)로 측정하였다. 수집된 근전도 신호는 Acqknowledge 3.7.3 (BIOPAC System Inc. Santa Babara, USA)을 이용하여 분석하였다. 근전도 신호의 표본추출율은 1,000Hz로 설정하였고, 주파수폭필터(band pass filter) 50～500Hz와 노치 필터(notch filter) 60Hz를 이용하였다.
성능/효과
- 3-AP 투여로 운동실조가 유발된 실험군의 최대수직 점핑높이는 26.20±1.50㎝로 대조군39.20±1.00㎝에 비해 유의하게 낮게 나타났다(p<.05).
- 3-AP군의 비복근 근활성도는 10.49±0.33%로 나타나 대조군 7.89±0.15%에 비해 유의하게 높게 나타났다(p<.05).
- 로타로드 운동과 전침을 통한 운동기능의 회복 정도를 알아보기 위해 실시한 최대수직점핑높이의 측정은 운동기능 손상의 정도를 정량적으로 측정하는 방법이다[7]. 3-AP를 투여한 실험군의 최대수직점핑높이는 대조군보다 유의하게 감소하였고, 치료적 중재 이후 점점 증가하는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 점핑 운동학습을 시킨 흰쥐에서 조롱박세포 및 해마 피라미드 세포의 수가 증가하고, 내측 비복근의 근방추가 비대해졌다는 임재형[39]의 연구와 부분적으로 일치하는 것으로 생각된다.
- 이에 반해 혈청을 이용한 분석방법은 BDNF의 발현변화에 대한 정확한 분석이 가능하고, 실험의 효율성이 높은 것으로 알려져 있다[44]. 3-AP투여를 통해 운동실조가 유발된 실험동물의 혈청을 분리하여 BDNF를 분석한 결과, 대조군 보다 혈청 BDNF농도가 유의하게 증가한 것으로 나타났다. 이와 유사하게 Gama 등[45]은 정신분열증(schizophrenia) 및 조울증(bipolar disorder) 환자의 혈청 BDNF가 대조군에 비해 현저하게 증가하였다고 보고하였고, 이러한 환자에서 혈청 BDNF의 농도 증가는 임상학적 평가점수의 유의한 변화와 관련이 있는 것으로 나타났다[46].
- 대조군에 비해 3-AP군의 혈청 BDNF 농도는 유의하게 증가하였고, 치료적 중재를 적용한 각 실험군들의 BDNF 농도는 3-AP군에 비해 유의하게 감소하였으나(p<.05), 세 실험군 사이에는 유의한 차이가 나타나지 않았다[그림 4].
- 로타로드 운동과 전침을 14일 동안 적용한 다음, 측정한 혈청 BDNF 농도는 대조군 1.29±0.15 ng/㎖, 3-AP군 1.54±0.19 ng/㎖, 운동군 1.24±0.23 ng/㎖, 전침군 1.18±0.13 ng/㎖, 그리고 운동전침군 1.10±0.19 ng/㎖로 나타났다.
- 척수 손상을 가진 운동선수의 혈청 BDNF 농도는 정상인보다 6배 정도 증가된 것으로 나타났다[48]. 본 연구에서는 운동군과 전침군 및 운동전침군의 혈청 BDNF 농도가 3-AP군보다 유의하게 낮게 나타났는데, 이는 대조군의 혈청 BDNF 농도와 비슷한 수준이었다. 이를 통해 치료적 중재 이후 혈청 BDNF 농도가 감소하는 것을 알 수 있었다.
- 운동과 전침을 이용한 치료적 중재를 통해 최대수직점핑높이는 점점 증가하는 것으로 나타났는데, 치료 7일에는 운동군 32.25±1.28㎝, 전침군 31.50±1.41㎝, 운동전침군 34.50±2.98㎝로, 3-AP군 27.88±3.87㎝에 비해 유의하게 높은 것으로 나타났다(p<.05).
- 이상과 같이 3-AP 투여는 mud-walking과 같은 운동실조를 일으키고, 소뇌의 운동협응과 조절능력을 손상시켰다. 운동실조 유발 후 최대수직점핑높이의 감소 및 비복근 근활성도의 증가가 나타났으나, 로타로드 운동과 전침 적용 이후 최대수직점핑높이는 증가하였고, 비복근 근활성도는 감소하는 경향을 보였다. 혈청 BDNF 농도는 3-AP 투여 이후 증가하는 것으로 나타 났으나 치료적 중재 이후 대조군과 비슷한 수준으로 감소하였다.
- 운동실조로 인한 후지의 근활성도 변화를 알아보기 위하여 비복근 근활성도를 측정한 결과, 3-AP군의 비복근 근활성도는 대조군에 비해 유의하게 높게 나타났다. 3-AP 투여로 증가된 후지의 근활성도는 mudwalking과 같은 실조성 보행의 특성과 관련이 있으며, 주동근과 길항근의 동시수축으로 인해 발생되는 것으로 생각된다[10].
- 혈청 BDNF 농도는 3-AP 투여 이후 증가하는 것으로 나타 났으나 치료적 중재 이후 대조군과 비슷한 수준으로 감소하였다. 이러한 결과를 통해 운동과 전침을 이용한 치료적 중재는 운동실조 흰쥐의 운동기능 회복에 긍정적 효과를 가지는 것으로 생각된다. 또한 3-AP 투여로 증가된 혈청 BDNF 농도를 감소시켜, 소뇌병변에 대한 신경보호적 효과를 나타내는 것으로 사료된다.
- 본 연구에서는 운동군과 전침군 및 운동전침군의 혈청 BDNF 농도가 3-AP군보다 유의하게 낮게 나타났는데, 이는 대조군의 혈청 BDNF 농도와 비슷한 수준이었다. 이를 통해 치료적 중재 이후 혈청 BDNF 농도가 감소하는 것을 알 수 있었다. 이명화 등[49]은 좌골신경의 압박 손상을 가한 흰쥐에서 BDNF mRNA의 발현이 증가되었고 좌골신경 압박손상 후 수영운동을 실시하면 BDNF mRNA의 발현이 억제되었다고 보고하였다.
- 치료 7일에는 각 실험군의 근활성도가 운동군 10.43±0.22%, 전침군 10.60±0.20%, 운동전침군 10.10±0.22%로 나타나 3-AP군 11.25±0.31%에 비해 미세하게 감소하였으나, 대조군 7.96±0.19%보다 높게 나타났다.
후속연구
- 특히 아래올리브핵은 인체에서 근 수축 개시를 조절하는 중요한 시계(timekeeping)의 기능을 가지는 것으로 보고되고 있는데[41], 3-AP의 투여로 손상된 운동기능은 치료적 중재 이후 점차 회복되고 있는 것으로 생각된다. 따라서 소뇌병변 및 운동실조 환자에서 나타나는 근활성도의 변화 및 아래올리브핵에 의한 근 수축 개시시간 조절기전을 규명하기 위해서는 구체적인 표면근전도 연구가 필요할 것으로 사료된다.
- 그러나 치료적 중재를 통한 운동기능의 회복이 어떠한 기전을 통해 일어나는지에 대해서는 아직 밝혀지지 않은 부분이 많고, 운동실조를 평가하는 방법 또한 부족하다. 따라서 소뇌병변에 대한 손상 및 회복기전을 밝히기 위한 구체적인 추후 연구가 필요하며, 운동실조 평가를 위해 근수축 개시와 종료시간의 측정, 근피로도 측정과 같은 근전도 연구가 필요할 것으로 사료된다.
- 그러나 운동군과 전침군 및 운동전침군의 혈청 BDNF 농도는 서로 유의한 차이가 나타나지 않았다. 실험적으로 운동실조를 유발한 동물 모델에서 치료적 중재와 관련된 혈청 BDNF의 변화에 대한 연구가 매우 부족한 실정이며, 향후 치료적 중재의 적용기간, 적용시점 및 이와 관련된 혈청 BDNF에 대한 자세한 연구가 필요할 것으로 생각된다.
- %RVC는 힘이 적게 들어가는 동작인 경우 민감성을 높이기 위해 다양하게 사용되는 표준화 방법이다[35]. 향후, 보다 명확한 운동실조 평가를 위해서 실제 소뇌병변 환자를 대상으로 한 표면근전도 연구가 필요할 것으로 생각된다. 특히 아래올리브핵은 인체에서 근 수축 개시를 조절하는 중요한 시계(timekeeping)의 기능을 가지는 것으로 보고되고 있는데[41], 3-AP의 투여로 손상된 운동기능은 치료적 중재 이후 점차 회복되고 있는 것으로 생각된다.
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