정상세포뿐 만 아니라 형질 전환된 세포의 증식조절에 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 COX-2는 전사조절인자인 NF-${\kappa}B$에 의해서 조절되며, 염증반응에 있어서 중요한 역할을 하는 PGE2의 생성에 관여하는 것으로 알려져 있다. 본 연구에서는 U937 인체혈구세포에서 염증유발인자인 PMA에 의해서 유발되는 염증반응에 있어서 중요한 역할을 하는 COX-2 및 COX-2의 산물인 PGE2와 COX-2의 발현에 영향을 미치는 전사조절인자인 NF-${\kappa}B$의 발현에 협죽도 잎 및 줄기의 에탄올 추출물인 ENIL 및 ENIS가 어떠한 영향을 미치는 지를 조사하였다. PMA가 처리된 U937 세포에서 COX-1의 발현에는 아무런 영향을 미치지 못하였지만 COX-2의 발현 증가가 유도되었고 이에 따른 PGE2의 생성이 증가되었다. PMA에 의해서 증가된 COX-2의 발현이 ENIS 선처리에 의하여 거의 완벽하게 억제되었고 그에 따른 PGE2의 생성도 현저하게 감소되었다. ENIS에 의한 COX-2의 발현 및 PGE2의 생성억제가 전사조절인자인 NF-${\kappa}B$와 상관성이 있는지를 조사한 결과, 핵 내로의 NF-${\kappa}B$ 이동이 ENIS 선처리에 의하여 억제되는 것으로 나타났다. 이는 ENIS가 NF-${\kappa}B$의 활성 억제를 통하여 COX-2의 발현 및 PGE2의 생성을 효과적으로 억제함으로서 항염증 효능을 가진다는 것을 의미하는 결과이다. 하지만 ENIL의 경우에는 이상에서와 같은 이러한 변화들이 매우 약하게 나타나는 것으로 조사되어 ENIS와 비교해서 항염증 효능이 낮은 것으로 나타났다. 본 연구 결과는 협죽도의 항염증기전에 대한 생화학적 해석 및 이를 활용한 향후 지속적인 연구를 위한 귀중한 자료가 될 것으로 생각된다.
정상세포뿐 만 아니라 형질 전환된 세포의 증식조절에 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 COX-2는 전사조절인자인 NF-${\kappa}B$에 의해서 조절되며, 염증반응에 있어서 중요한 역할을 하는 PGE2의 생성에 관여하는 것으로 알려져 있다. 본 연구에서는 U937 인체혈구세포에서 염증유발인자인 PMA에 의해서 유발되는 염증반응에 있어서 중요한 역할을 하는 COX-2 및 COX-2의 산물인 PGE2와 COX-2의 발현에 영향을 미치는 전사조절인자인 NF-${\kappa}B$의 발현에 협죽도 잎 및 줄기의 에탄올 추출물인 ENIL 및 ENIS가 어떠한 영향을 미치는 지를 조사하였다. PMA가 처리된 U937 세포에서 COX-1의 발현에는 아무런 영향을 미치지 못하였지만 COX-2의 발현 증가가 유도되었고 이에 따른 PGE2의 생성이 증가되었다. PMA에 의해서 증가된 COX-2의 발현이 ENIS 선처리에 의하여 거의 완벽하게 억제되었고 그에 따른 PGE2의 생성도 현저하게 감소되었다. ENIS에 의한 COX-2의 발현 및 PGE2의 생성억제가 전사조절인자인 NF-${\kappa}B$와 상관성이 있는지를 조사한 결과, 핵 내로의 NF-${\kappa}B$ 이동이 ENIS 선처리에 의하여 억제되는 것으로 나타났다. 이는 ENIS가 NF-${\kappa}B$의 활성 억제를 통하여 COX-2의 발현 및 PGE2의 생성을 효과적으로 억제함으로서 항염증 효능을 가진다는 것을 의미하는 결과이다. 하지만 ENIL의 경우에는 이상에서와 같은 이러한 변화들이 매우 약하게 나타나는 것으로 조사되어 ENIS와 비교해서 항염증 효능이 낮은 것으로 나타났다. 본 연구 결과는 협죽도의 항염증기전에 대한 생화학적 해석 및 이를 활용한 향후 지속적인 연구를 위한 귀중한 자료가 될 것으로 생각된다.
Nerium indicum, an India-Pakistan-originated shrub belonging to the oleander family, is reported to possess many pharmacological activities including cardiac muscle stimulation, and anti-diabetes, anti-angiogenesis, anti-cancer and neuro-protective activities. However, the anti-inflammatory properti...
Nerium indicum, an India-Pakistan-originated shrub belonging to the oleander family, is reported to possess many pharmacological activities including cardiac muscle stimulation, and anti-diabetes, anti-angiogenesis, anti-cancer and neuro-protective activities. However, the anti-inflammatory properties of N. indicum were unclear. In this study, we investigated the effects of ethanol extract of the N. indicum leaf and stem (ENIL and ENIS) on the expression of anti-inflammatory mediators in U937 human pre-monocytic cell models. In U937 cells stimulated with phorbol 12-myristate-13-acetate (PMA), pre-treatment with ENIS significantly inhibited the expression of both cyclooxygenase-2 (COX-2) mRNA and protein, which are associated with inhibition of the release of prostaglandin $E_2\;(PGE_2)$, whereas the inhibitory effects appeared weakly in ENIL. Moreover, ENIS significantly attenuated PMA-induced IkappaB ($I{\kappa}B$) degradation and suppressed elevated nuclear factor kappa B (NF-${\kappa}B$) nuclear translocation. Taken together, these findings provide important new insights that N. indicum exhibits anti-inflammatory properties by suppressing the transcription of pro-inflammatory cytokine genes through the NF-kB signaling pathway.
Nerium indicum, an India-Pakistan-originated shrub belonging to the oleander family, is reported to possess many pharmacological activities including cardiac muscle stimulation, and anti-diabetes, anti-angiogenesis, anti-cancer and neuro-protective activities. However, the anti-inflammatory properties of N. indicum were unclear. In this study, we investigated the effects of ethanol extract of the N. indicum leaf and stem (ENIL and ENIS) on the expression of anti-inflammatory mediators in U937 human pre-monocytic cell models. In U937 cells stimulated with phorbol 12-myristate-13-acetate (PMA), pre-treatment with ENIS significantly inhibited the expression of both cyclooxygenase-2 (COX-2) mRNA and protein, which are associated with inhibition of the release of prostaglandin $E_2\;(PGE_2)$, whereas the inhibitory effects appeared weakly in ENIL. Moreover, ENIS significantly attenuated PMA-induced IkappaB ($I{\kappa}B$) degradation and suppressed elevated nuclear factor kappa B (NF-${\kappa}B$) nuclear translocation. Taken together, these findings provide important new insights that N. indicum exhibits anti-inflammatory properties by suppressing the transcription of pro-inflammatory cytokine genes through the NF-kB signaling pathway.
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문제 정의
따라서 본 연구에서는 협죽도의 항염증 효과 및 그에 따른 생화학적 기전의 해석을 위하여 협죽도 잎의 에탄올 추출물 (ethanol extract of N. indicum leaf, ENIL)과 줄기의 에탄올 추출물(ethanol extract of N. indicum stem, ENIS)이 인체혈구세포인 U937 세포에서 PMA에 의하여 인위적으로 유발된 COX-2 발현 및 PGE2의 생성과 연관된 전사조절인자인 NF-κB 의 활성에 어떠한 변화가 유발되는지를 조사하여 유의적인 결과를 얻었기에 이를 보고하는 바이다.
본 연구에서는 PMA에 의해 유발된 COX-2의 과발현 현상이 ENIL 및 ENIS에 의하여 억제될 수 있을지를 확인하기 위하여 각각의 시료를 5 μg/ml의 농도로 단독 처리하였을 경우와 1시간 선처리한 다음 PMA 40 nM을 처리하였을 경우에 유발되는 COX-2의 발현 변화를 전사 및 번역 수준에서 비교하였다.
본 연구에서는 U937 인체혈구세포에서 염증유발인자인 PMA에 의해서 유발되는 염증반응에 있어서 중요한 역할을 하는 COX-2 및 COX-2의 산물인 PGE2와 COX-2의 발현에 영향을 미치는 전사조절인자인 NF-κB의 발현에 협죽도 잎 및 줄기의 에탄올 추출물인 ENIL 및 ENIS가 어떠한 영향을 미치는 지를 조사하였다.
제안 방법
본 실험에 사용된 협죽도는 부산시 영도구에서 채집된 것을 동정하여 사용하였다. ENIL 및 ENIS를 얻기 위하여 채집된 협죽도의 잎과 줄기를 각각 분리하여 흐르는 물로 충분히 세척하고 건조시킨 후 잘게 분쇄하였다. 건조된 협죽도의 잎과 줄기 100 g에 ethanol 1 l를 첨가하여 60℃, 150 rpm으로 3일간 교반 후 상층액만 분리하여 Whatman 필터(No.
PGE2 생성양의 변화 측정을 위한 PGE2 EIA kit는 Cayman Chemicals (Ann Arbor, MI, USA)에서 구입하였으며, PGE2의 양을 측정하기 위하여 정상 및 다양한 농도의 ENIL 및 ENIS를 1시간 선 처리 후 PMA (40 nM)를 처리한 배지에서 6시간 동안 U937 세포를 배양시킨 다음 상층액만 이용하여 제시된 방법에 따라 처리한 다음 ELISA reader를 이용하여 420 nm의 흡광도를 이용하여 반응의 정도를 측정하였다.
고정된 세포를 PBS에 부유시킨 후 cytospin을 이용하여 slide glass 위에 세포를 부착시키고 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, Sigma) 용액을 처리하여 염색하였다.
다양한 실험 조건에서 세포의 전체적 형태 변화 여부를 조사하기 위하여 도립 현미경(inverted microscope, Carl Zeiss) 을 이용하여 200배의 배율로 관찰하였다. 또한 동일한 조건에서의 핵의 형태적 변화를 관찰하기 위하여 37% formaldehyde 용액과 PBS를 1:9의 비율로 섞은 fixing solution을 모아진 세포에 첨가하여 상온에서 10분 동안 고정하였다.
또한 PMA는 강력한 PKC activator로서 성장인자들, 호르몬 및 세포의 성장과 분화를 조절하는 cytokine에 의한 기전을 연구하는데 사용되며, cytokine 및 LPS와 마찬가지로 여러 세포들에서 COX-2의 발현 및 PGs의 생성을 증가시키는 것으로 알려져 있다[18,29,32]. 따라서 U937 세포에 PMA를 처리하였을 경우 염증 유발에 있어서 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 COXs의 발현에 어떠한 영향을 미치는 지를 western blot으로 관찰하였다. 먼저 PMA 의 농도별 처리에 따른 변화를 관찰한 결과, Fig.
따라서 이후의 실험은 5 μg/ml 농도의 ENIL 및 ENIS를 사용하여 진행하였다.
전이가 끝난 membrane에 1 항체를 처리하여 상온에서 2시간 이상 또는 4℃에서 over night 시킨 다음 2차 항체를 사용하여 상온에서 1시간 정도 반응시켰다. 반응이 끝난 후 PBS-T (0.1% Tween in PBS)로 충분히 세척하고 Enhanced Chemiluminoesence (ECL) 용액(Amersham Life Science Corp.)을 적용시킨 다음 암실에서 X-ray film에 감광시켜 특정단백질의 양을 분석하였다.
개/ml의 개수로 well 당 2 ml씩 분주한 다음 ENIL 및 ENIS를 적정농도로 처리하여 배양하였다. 시료 처리 6시간 후 상층액을 제거하고 세포만 남긴 다음 PBS를 1 ml 첨가하여 잘 섞은 후 세포 부유 액과 0.5% trypan blue (Gibco BRL)를 동량으로 넣어 2분간 처리하고 도립 현미경(Carl Zeiss, Germany)을 이용하여 살아 있는 세포를 계수하였다. 이에 따른 결과를 Microsoft EXCEL program을 사용하여 분석하였다.
, Carlsbad, CA, USA)을 이용하여 total RNA를 분리하고 정량한 다음 primer, DEPC water 그리고 ONE-STEP RT-PCR PreMix Kit (Intron, Korea)를 넣고 Mastercycler gradient (Eppendorf, Hamburg, Germany)를 이용하여 증폭한 다음 1% agarose gel을 이용하여 100 V에서 전기영동을 하였다. 전기영동으로 DNA 분리가 끝난 gel을 ethidium bromide (EtBr)를 이용하여 염색한 후 UV 하에서 확인하였다. 이때 housekeeping 유전자인 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) 유전자를 internal control로 사용하였다.
준비된 세포를 대상으로 TRIzol reagent (Invitrogen Co., Carlsbad, CA, USA)을 이용하여 total RNA를 분리하고 정량한 다음 primer, DEPC water 그리고 ONE-STEP RT-PCR PreMix Kit (Intron, Korea)를 넣고 Mastercycler gradient (Eppendorf, Hamburg, Germany)를 이용하여 증폭한 다음 1% agarose gel을 이용하여 100 V에서 전기영동을 하였다. 전기영동으로 DNA 분리가 끝난 gel을 ethidium bromide (EtBr)를 이용하여 염색한 후 UV 하에서 확인하였다.
고정된 세포를 PBS에 부유시킨 후 cytospin을 이용하여 slide glass 위에 세포를 부착시키고 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, Sigma) 용액을 처리하여 염색하였다. 형광 현미경을 이용하여 400배의 배율로 세포의 핵의 형태 변화를 관찰하였다.
대상 데이터
(Santa Cruz, CA, USA) 에서 구입하였다. Immunoblotting을 위해 2차 항체로 사용된 peroxidase-labeled donkey anti-rabbit 및 peroxidase-labeled sheep anti-mouse immunoglobulin은 Amersham Life Science Corp. (Arlington Heights, IL, USA)에서 구입하였다.
mRNA 분석을 위하여 사용된 primer는 Bioneer (Taejeon, Korea)에서 구입하였으며(Table 1), 단백질 분석을 위하여 사용된 actin, COX-1, COX-2, NF-κB 및 IκB 항체는 Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA, USA) 에서 구입하였다.
본 실험에 사용된 협죽도는 부산시 영도구에서 채집된 것을 동정하여 사용하였다. ENIL 및 ENIS를 얻기 위하여 채집된 협죽도의 잎과 줄기를 각각 분리하여 흐르는 물로 충분히 세척하고 건조시킨 후 잘게 분쇄하였다.
실험에 사용된 인체혈구세포인 U937 세포는 한국생명공학연구소에서 분주 받았으며, 10% fetal bovine serum (FBS)에 1%의 penicillin 및 streptomycin (Biofluids, Rockville, MD, USA)이 포함된 RPMI-1640 배지(Gibco BRL, Grand Island, NY, USA)를 사용하여 37℃ 및 5% CO2 조건 하에서 배양하였다.
데이터처리
5% trypan blue (Gibco BRL)를 동량으로 넣어 2분간 처리하고 도립 현미경(Carl Zeiss, Germany)을 이용하여 살아 있는 세포를 계수하였다. 이에 따른 결과를 Microsoft EXCEL program을 사용하여 분석하였다.
배양이 끝난 다음 MTT 시약을 제거하고 DMSO 를 1 ml씩 분주하여 well에 생성된 formazin을 모두 녹인 후 96 well plate에 200 μl씩 옮겨서 ELISA reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)로 540 nm에서 흡광도를 측정 하였다. 측정은 모두 세 번을 하였으며, 그에 대한 평균값과 표준 오차를 Microsoft EXCEL program을 사용하여 분석하였다.
이론/모형
ENIL 및 ENIS를 단독 처리했을 경우와 PMA와 동시 처리 했을 경우에 U937세포의 생존율 및 증식에 미치는 영향을 알아보기 위하여 hemocytometer 및 MTT assay를 이용하였다. Fig.
The cells were incubated with the indicated concentrations of ENIL and ENIS (A and B) or 40 nM of PMA for 7 hr after 1 hr pretreatment with 5 μg/ml of ENIL and ENIS (C and D). The rate of cell proliferation was measured by the Hemocytometer and metabolic-bye-based MTT assay. The data shown are means±SD of three independent experiments.
5), 250 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% NP-40, 1 mM phenymethylsulfonyl fluoride (PMSF), 5 mM dithiothreitol (DTT)]를 첨가하여 4℃에서 1시간 동안 반응시킨 후, 14,000 rpm으로 30분간 원심분리하여 그 상층액을취하였다. 상층액의 단백질 농도는 Bio-Rad 단백질 정량 시약 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) 사용방법에 따라 정량 한 다음 동량의 Laemmli sample buffer (Bio-Rad)를 섞어서 sample을만들었다. 이렇게 만든 동량의 단백질을 sodium dodecyl sulphate (SDS)-polyacrylamide gel을 이용하여 전기영동으로 분리한 다음 nitrocellulose membrane (Schleicher and Schuell, Keene, NH, USA)으로 electroblotting에 의해 전이시켰다.
성능/효과
ENIS에 의한 COX-2의 발현 및 PGE2의 생성 억제가 전사조절 인자인 NF-κB와 상관성이 있는지를 조사한 결과, 핵 내로의 NF-κB 이동이 ENIS 선처리에 의하여 억제되는 것으로 나타났다.
PMA가 처리된 U937 세포에서 COX-1의 발현에는 아무런 영향을 미치지 못하였지만 COX-2의 발현 증가가 유도되었고 이에 따른 PGE2의 생성이 증가되었다. PMA에 의해서 증가된 COX-2의 발현이 ENIS 선처리에 의하여 거의 완벽하게 억 제되었고 그에 따른 PGE2의 생성도 현저하게 감소되었다. ENIS에 의한 COX-2의 발현 및 PGE2의 생성 억제가 전사조절 인자인 NF-κB와 상관성이 있는지를 조사한 결과, 핵 내로의 NF-κB 이동이 ENIS 선처리에 의하여 억제되는 것으로 나타났다.
PMA와 ENIL 및 ENIS 처리에 따른 U937 세포의 전체적인 형태 변화를 알아보기 위하여 ENIL 및 ENIS를 1시간 선처리후 PMA를 6시간 동안 처리한 다음 ENIL 및 ENIS를 6시간 처리하였을 경우 Fig. 2A에서 보는 바와 같이 세포의 밀도에큰 변화가 없었으며 전체적인 세포의 형태도 큰 변화가 없음을 알 수 있었다. 또한 상기와 동일한 조건으로 처리된 U937세포의 핵의 형태 변화를 조사한 결과에서도 Fig.
결론적으로 협죽도 추출물은 NF-κB의 활성 억제를 통한 COX-2의 발현을 억제함으로서 PGE2의 생성을 억제함으로서 항염증 효능을 나타낸다고 생각된다.
3A에 나타난 바와 같이 COX-1의 경우는 아무런 변화가 관찰되지 않았지만 COX-2의 경우는 20 nM의 농도에서부터 강하게 발현되는 것을 확인 할 수 있었다. 다음으로 PMA 처리시간에 따른 COX-2의 발현 정도를 관찰한 결과, Fig. 3B에 나타난 바와 같이 COX-2의 경우에는 PMA 처리 1시간까지는 발현양의 변화가 나타나지 않았지만 2시간째부터 발현양의 증가가 나타나기 시작하여 6시간 처리군에서 현저하게 증가하는 것을 관찰할수 있었다. 이상의 결과를 살펴볼 때 PMA는 U937 세포의 생존율 및 증식과 더불어 COX-1의 발현에는 큰 영향을 미치지 못하지만 염증발현에 중요한 역할을 하는 COX-2의 발현을 증가시킨다는 것을 알 수 있었다.
다음으로 생존율 및 증식에 큰 영향을 미치지 않는5 μg/ml의 농도로 각각의 시료를 1시간 선처리한 다음 염증유발물질로서 PMA를 처리하여 6시간 경과 후 변화를 관찰한결과, Fig. 1C 및 D에 나타난 바와 같이 ENIL 및 ENIS 처리군 모두에서 세포의 생존율 및 증식에 큰 영향을 미치지 못하는 것을 알 수 있었다.
다음은 PMA에 의하여 유발된 NF-κB 의 핵 내로의 이동이 ENIL 및 ENIS에 의하여 억제되는지의 여부를 확인한 결과, Fig. 6B에 나타낸 바와 같이 PMA 처리에 의하여 세포질에서 핵 내로의 NF-κB 이동이 ENIS에 의하여 현저하게 억제되었음을 알 수 있었으며, 동시에 세포질에 존재하는 IκB의 발현도 매우 회복되는 것으로 나타났다.
따라서 ENIL 및 ENIS 가 NF-κB의 발현에 어떠한 영향을 미치는지를 확인한 결과, Fig. 6A에 나타난 바와 같이 NF-κB의 경우 PMA 처리농도및 시간 의존적으로 핵 내로의 이동이 증가되었음을 알 수있었으며, 세포질에서 NF-κB와 결합하고 있는 IκB의 발현은 상대적으로 감소되었다.
뿐만 아니라 PGE2는 염증성 질환을 포함한 다양한 생체반응에 있어서도 세포분열이나 증식에 영향을 줌으로서 각종 질병의 유발과 진행에 관여하며, PMA는 이러한 PGE2의 발현을 증가시키는 것으로 보고되고 있다[21,37]. 따라서 PGE2 생성에 있어서 ENIL 및 ENIS가 어떠한 영향을 미치는지를 조사한 결과는 Fig. 5에 나타난 바와 같으며, 결과에서 알 수 있듯이 정상 및 ENIL 및 ENIS이 단독 처리된 경우에는 PGE2 생성에 큰 변화가 나타나지 않았지만, PMA 처리에 의한 PGE2의 생성 증가는 ENIS 선처리에 의하여 매우 억제됨을 알 수 있었으며, ENIL를 선처리하였을 경우에는 PGE2의 억제 현상이 약하게 나타났다. 이상의 결과를 살펴볼 때 ENIS는 COX-2의 발현억제와 이로 인한 PGE2의 생성 저해작용이 ENIL 보다 효과적이었음을 알 수 있었다.
2A에서 보는 바와 같이 세포의 밀도에큰 변화가 없었으며 전체적인 세포의 형태도 큰 변화가 없음을 알 수 있었다. 또한 상기와 동일한 조건으로 처리된 U937세포의 핵의 형태 변화를 조사한 결과에서도 Fig. 2B에서와같이 염색질 응축에 의한 apoptosis가 일어난 세포에서 전형 적으로 관찰되는 apoptotic body가 관찰되지 않았고 핵의 형태가 뚜렷하게 정상으로 염색되는 것을 알 수 있었다. 이상의 결과는 ENIL 및 ENIS와 PMA의 단독 또는 복합 처리에 따른 U937 세포의 생존율 및 증식에 대한 결과와 잘 부합되었다.
따라서 U937 세포에 PMA를 처리하였을 경우 염증 유발에 있어서 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 COXs의 발현에 어떠한 영향을 미치는 지를 western blot으로 관찰하였다. 먼저 PMA 의 농도별 처리에 따른 변화를 관찰한 결과, Fig. 3A에 나타난 바와 같이 COX-1의 경우는 아무런 변화가 관찰되지 않았지만 COX-2의 경우는 20 nM의 농도에서부터 강하게 발현되는 것을 확인 할 수 있었다. 다음으로 PMA 처리시간에 따른 COX-2의 발현 정도를 관찰한 결과, Fig.
2B에서와같이 염색질 응축에 의한 apoptosis가 일어난 세포에서 전형 적으로 관찰되는 apoptotic body가 관찰되지 않았고 핵의 형태가 뚜렷하게 정상으로 염색되는 것을 알 수 있었다. 이상의 결과는 ENIL 및 ENIS와 PMA의 단독 또는 복합 처리에 따른 U937 세포의 생존율 및 증식에 대한 결과와 잘 부합되었다. 즉 이러한 조건은 ENIL 및 ENIS의 단독 처리에 의하여 세포독성을 나타내지 않음을 의미한다.
5에 나타난 바와 같으며, 결과에서 알 수 있듯이 정상 및 ENIL 및 ENIS이 단독 처리된 경우에는 PGE2 생성에 큰 변화가 나타나지 않았지만, PMA 처리에 의한 PGE2의 생성 증가는 ENIS 선처리에 의하여 매우 억제됨을 알 수 있었으며, ENIL를 선처리하였을 경우에는 PGE2의 억제 현상이 약하게 나타났다. 이상의 결과를 살펴볼 때 ENIS는 COX-2의 발현억제와 이로 인한 PGE2의 생성 저해작용이 ENIL 보다 효과적이었음을 알 수 있었다.
3B에 나타난 바와 같이 COX-2의 경우에는 PMA 처리 1시간까지는 발현양의 변화가 나타나지 않았지만 2시간째부터 발현양의 증가가 나타나기 시작하여 6시간 처리군에서 현저하게 증가하는 것을 관찰할수 있었다. 이상의 결과를 살펴볼 때 PMA는 U937 세포의 생존율 및 증식과 더불어 COX-1의 발현에는 큰 영향을 미치지 못하지만 염증발현에 중요한 역할을 하는 COX-2의 발현을 증가시킨다는 것을 알 수 있었다.
하지만 ENIL을 선처리 하였을 경우에는 PMA에 의하여 증가된 COX-2의 발현감소 정도가 약하게 나타났다. 즉 염증반응에 중요한 역할을 하는 COX-2의 발현억제 정도에 있어서 ENIL 에 비하여 ENIS의 효과가 더욱 뛰어나다는 것을 알 수 있었다.
하지만 ENIL 처리군에서는 NF-κB의 핵 내 이동 억제의 정도가 ENI 처리군에 비하여 다소 약한 것으로 나타났다.
이는 ENIS가 NF-κB의 활성 억제를 통하여 COX-2의 발현및 PGE2의 생성을 효과적으로 억제함으로서 항염증 효능을 가진다는 것을 의미하는 결과이다. 하지만 ENIL의 경우에는 이상에서와 같은 이러한 변화들이 매우 약하게 나타나는 것으로 조사되어 ENIS와 비교해서 항염증 효능이 낮은 것으로 나타났다. 본 연구 결과는 협죽도의 항염증기전에 대한 생화학적 해석 및 이를 활용한 향후 지속적인 연구를 위한 귀중한 자료가 될 것으로 생각된다.
후속연구
하지만 ENIL의 경우에는 이상에서와 같은 이러한 변화들이 매우 약하게 나타나는 것으로 조사되어 ENIS와 비교해서 항염증 효능이 낮은 것으로 나타났다. 본 연구 결과는 협죽도의 항염증기전에 대한 생화학적 해석 및 이를 활용한 향후 지속적인 연구를 위한 귀중한 자료가 될 것으로 생각된다.
결론적으로 협죽도 추출물은 NF-κB의 활성 억제를 통한 COX-2의 발현을 억제함으로서 PGE2의 생성을 억제함으로서 항염증 효능을 나타낸다고 생각된다. 아울러 이러한 협죽도의 항염증 효능에 실질적인 역할을 하는 성분에 대한 추가적인 연구가 진행되어야 할 것이다.
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