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문제 정의
- 인삼 유효성분의 인체내 최대흡수를 통하여 인삼의 효능을 극대화시킬 필요가 있고, 본 연구에서는 이를 위한 한 가지 방법으로 몇 가지 균주를 이용하여 인삼을 발효시켜 특성 조사 및 효능 검정을 실시하였고, 향후 인삼의 발효를 통하여 효능을 증진시키는 새로운 물질의 분리나 임상생화학적 효과를 토대로 한 기능성식품 개발의 기초 자료 제공하고자 실시하였다.
제안 방법
- 즉, 시료 추출물 1 ㎎을 95% 에탄올 1 mL에 용해시키고 Folin-Ciocalteau 1 mL를 첨가하여 27℃ 수욕조에서 혼합하였다. 5분 정도 경과 후 Na2CO3 포화 용액 1 mL를 가하여 혼합하고 실온에서 1시간 동안 방치한 다음 UV/VIS spectrophotometer (UV-1250, Shimadzu, Japan)를 사용하여 725 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 이 때, tannic acid를 이용한 표준곡선은 최종농도가 0, 12.
- delbrueckii subsp. bulgaricus, L. fermentum, S. thermophilus, B. longum및 S. cerevisiae의 생장정도를 조사하였다.
- 기본배지에 인삼추출액을 0, 0.3, 0.6, 0.9, 1.2 및 1.5%의 농도로 처리하여 배지 내에서 LP, LD, LF, ST, BI 및 SA 등 6개 균주의 생장정도를 조사하였다. 추출물의 농도가 낮을 수록 세균수가 많고 추출물의 농도가 높아질수록 세균수가 적어지는 경향이었으며,추출물의 농도가 0.
- 6%일 때 가장 생장이 좋았다. 따라서 본 연구에서는 인삼추출액의 농도를 0.3%로 조정한 다음 발효시험을 실시하였다.
- 발효전후에 Protopanaxadoil (PPD)계에 속하는 Rb1, Rb2, Rb3, Rc, Rd, Rg3, Rh2, Compound K와 Protopanaxatriol (PPT)계에 속하는 Re, Rg1, Rg2, Rh1, Rf 등 13종의 ginsenoside 함량을 분석하였다. 우선 추출 후 동결건조 한 sample 0.
- 시작 시간으로부터 6분이 경과한 시간에 1 M NaOH 2 mL를 가하고 증류수를 추가로 가하여 10 mL으로 만든 다음 골고루 섞었다. 분홍색을 띄는 시료를 510 ㎚ 파장에서 흡광도를 측정하여 L당 catechin equivalent (CE) ㎎으로 환산하여 플라보노이드 함량을 표시하였다.
- 이 혼합 시료를 암소에서 30분간 반응 시킨 후 517 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 수소전자공여능은 각 실험을 3회 반복하여 평균을 낸 다음 대조구에 대한 흡광도의 감소 정도를 다음 식에 의하여 계산하였다.
- 시료 추출물을 수소전자공여능에 의해 항산화활성을 측정하였다 (Boo et al., 2009). 여러 농도의 시료를 에탄올에 용해하여, 900 µL의 DPPH 용액 (100 µM)과 각 시료 100 µL를 혼합하여 교반하였다.
- , Rh1, Rf 등 13종의 ginsenoside 함량을 분석하였다. 우선 추출 후 동결건조 한 sample 0.2 g을 20 mL Vial에 넣고 MeOH 10 mL를 첨가하여 10분간 Ultrasonication을 실시한 다음 0.45 ㎛ filter로 filtering하여 HPLC로 분석하였으며, 분석조건은 Table 1과 같다.
- 1과 같으며, 피부직삼 농축액 9 mL와 조효소 21 mL를 증류수 3,000 mL에 넣은 후 50℃에서 2시간 효소 반응 시켰다. 이것을 95℃에서 10분간 살균 후 실온에서 서서히 식힌 다음 미리 활성화 시킨 6종의 발효 균주를 각각 4%씩 넣은 후 LP와 SA는 30℃에서, LD, LF, ST 및 BI는 37℃에서 각각 24, 48, 72시간 동안 배양하였다. 그 후 배양액을 45℃ 수욕상에서 rotary vaccum evaporator로 농축한 다음 −45℃ deep freezer에 12시간 두었다가 freeze dryer에 넣고 동결건조 하였다.
- 시료 중 총 플라보노이드 함량은 Zhishen 등 (1999)이 개발한 분광분석법을 이용하여 측정하였다. 즉, 증류수 4 mL이 들어있는 시험관에 시료 1 mL를 가하고 5분이 경과한 다음 5% NaNO2 0.3 mL과 10% AlCl3 0.3 mL를 차례로 가하였다. 대조군은 시료 대신 증류수 1 mL를 가하였다.
대상 데이터
- delbrueckii subsp. bulgaricus KCCM35463 (LD), L. fermentum KCCM 40401 (LF), Streptococcus thermophilus KCCM35496 (ST), Bifidobacterium longum KCCM11953 (BL) 및 Saccharomyces cerevisiae KCCM 50549 (SA) 등 6개 균주를 사용하였다.
이론/모형
- SOD 유사활성 측정은 Marklund와 Marklund (1974)의 방법에 따라 과산화수소 (H2O2)로 전환시키는 반응을 촉매하는 pyrogallol의 생성량을 측정하여 SOD 유사활성으로 나타내었다. 즉 일정농도의 시료 0.
- 시료 중 총 플라보노이드 함량은 Zhishen 등 (1999)이 개발한 분광분석법을 이용하여 측정하였다. 즉, 증류수 4 mL이 들어있는 시험관에 시료 1 mL를 가하고 5분이 경과한 다음 5% NaNO2 0.
- 총 폴리페놀 함량은 Folin-Denis법 (Folin and Denis, 1912)을 응용하여 측정하였다. 즉, 시료 추출물 1 ㎎을 95% 에탄올 1 mL에 용해시키고 Folin-Ciocalteau 1 mL를 첨가하여 27℃ 수욕조에서 혼합하였다.
성능/효과
- Compound K의 함량은 LP발효추출물을 제외하고는 무발효 < 효소발효 < 효소 + 발효균주 처리구의 순이었으며, 또한 발효시간의 경과와 함께 증가하는 경향이었다.
- LP발효추출물의 경우 19.48 ± 0.28%에서 30.72 ±0.85%로 매우 높은 값을 나타냈고 발효시간이 길어질수록 함량이 높아지는 유의성 있는 결과를 나타내어 LP발효추출물이 가장 좋은 결과를 나타냈다 (Fig. 6).
- Rg1은 BI, LD, LF, LP 및 ST발효에 의해서는 상당량 감소하였으나 SA와 E 발효에 의한 감소는 매우 적었다. Rd의 함량은 BI, LD, LP 및 ST 발효에 의해 감소하는 경향이나 E, LF 및 SA에 의한 발효시에는 오히려 증가되었다. Rg3는 모든 처리구에서 함량이 비슷하게 나타나 발효의 유무에 관계없었으나 LD발효에 의해서만 약간 증가하였다.
- , Re 및 Rf의 함량은 상당량 감소하였다. Rg1은 BI, LD, LF, LP 및 ST발효에 의해서는 상당량 감소하였으나 SA와 E 발효에 의한 감소는 매우 적었다. Rd의 함량은 BI, LD, LP 및 ST 발효에 의해 감소하는 경향이나 E, LF 및 SA에 의한 발효시에는 오히려 증가되었다.
- SA 발효추출물의 경우 24시간 발효에서 117.08 ± 0.34 ㎎/10 g나타났으며, 72시간 발효시에는 156.45 ± 1.29 ㎎/10 g으로 가장 높게 나타나 공시발효균주 중에서 가장 좋은 결과를 나타냈으며 그 다음으로는 LP발효추출물이 높은 것으로 조사되었다 (Fig. 3).
- 66%로 나타났으며, BI, SA 및 ST 24시간 발효추출물 및 BI발효추출물을 제외하고는 LD, LP, LF, SA, ST 및 E 48시간 이상 발효추출물에서 모두 80% 이상의 높은 아질산염 소거능을 나타냈다. pH에 따른 아질산염 소거능의 유의차는 나타나지 않았으며, 발효 미생물간에도 유의차는 거의 없었다. 또한 합성 항산화제인 BHT의 아질산염 소거능은 pH2.
- 또한 합성 항산화제인 BHT의 아질산염 소거능은 pH2.5 및 pH 4.2에서 각각 84.76 ± 0.13%과 84.98 ± 0.11%로 나타나고 있어 인삼 발효물이 합성항산화 제인 BHT와 같은 정도로 나타냈다 (Fig. 5).
- 무발효처리나 효소단독 발효의 경우에 비하여 BI, LD, LF, LP, ST 및 SA 발효에 의해 Rb1, Rb2, Rb3, Re 및 Rf의 함량은 상당량 감소하였다. Rg1은 BI, LD, LF, LP 및 ST발효에 의해서는 상당량 감소하였으나 SA와 E 발효에 의한 감소는 매우 적었다.
- 발효 인삼추출물의 플라보노이드 함량을 측정한 결과 무발효추출물 (18.06 ± 0.90 ㎎/10 g)보다 높게 나타났다.
- 발효미생물에 따라서는 BI, LD, SA 및 ST발효추출물은 10% 이하의 낮은 SOD 유사 활성을 나타낸 반면, LF발효추출물은 10.24 ± 0.28%에서 12.85 ± 0.57로 나타났으며, 발효시간에 따른 차이는 나타나지 않았다.
- 전체적으로는 발효시에 무발효추출물의 폴리페놀 함량보다는 낮았다. 발효시간 변화에 따른 폴리페놀 함량은 BI, LD, LP, LF 및 SA 발효추출물에서는 발효시간이 길어지면 증가하는 경향을 나타냈으며, ST발효추출물에서는 감소하였다. E발효추출물의 경우는 48시간 발효까지는 폴리페놀 함량이 증가하였으나 72시간 발효에서는 오히려 함량이 감소하였다 (Fig.
- 발효인삼의 폴리페놀류 함량 측정 결과, 무발효 추출물은 61.92 ± 0.26 ㎎/10 g로 나타났고, BI, LD, LF, LP 및 ST발효추출물은 9.18 ± 0.39~17.05 ± 0.77 ㎎/10 g으로 나타나 E발효추출물의 11.92 ± 0.26~28.41 ± 0.39 ㎎/10 g보다 낮게 나타났지만 SA발효추출물에서는 E발효추출물보다 오히려 높게 나타냈다.
- 5). 이러한 결과는 한약재 열수추출물의 1 ㎎/mL 농도, pH 4.2에서 아질산염 소거능은 산수유 52.98%, 결명자 22.3%, 감국 41.33%, 배초향 32.15%, 뽕나무 잎 48.32%, 두충 27.36%, 오가피 66.19%, 당귀 23.11%, 울금 50.73% 등의 보고 (Ju et al., 2006)나 유자씨 44.3% (Woo et al., 2009)와 비교하면 매우 높은 값을 나타내고 있어 발효 인삼의 경우 매우 높은 아질산염 소거능을 가지고 있음을 알 수 있었다.
- 인삼발효물을 1,000 ppm의 농도로 DPPH radical 소거활성을 측정한 결과 같은 농도에서 측정한 천연항산화제인 비타민 C의 57.66 ± 0.98%와 비교할 때, 무발효추출물은 45.37 ± 0.62%, E발효추출물은 42.68 ±1.27~46.36 ± 0.77%, BI발효추출물은 33.98 ± 1.17 ~ 38.77 ± 1.01%, LD발효추출물은 35.89 ± 0.84~44.41 ± 1.20%, LP발효추출물은 43.85 ± 1.44~50.51 ± 0.77%, LF발효추출물은 37.33 ± 1.37~55.62 ± 0.33%, SA발효추출물은 48.68 ± 1.05~54.90 ± 1.59% 그리고 ST발효추출물은 24.11 ± 1.41~38.30 ± 1.21%로 천연항산화제인 비타민C와 유사하거나 약간 낮은 값을 나타내어 발효인삼의 DPPH radical 소거활성이 우수함을 알 수 있었다 (Fig. 4).
- 인삼발효추출물을 1,000 ppm의 농도로 아질산염 소거능을측정한 결과, pH2.5 및 pH 4.2에서 무발효추출물은 각각 81.78 ± 0.06% 및 81.28 ± 0.66%로 나타났으며, BI, SA 및 ST 24시간 발효추출물 및 BI발효추출물을 제외하고는 LD, LP, LF, SA, ST 및 E 48시간 이상 발효추출물에서 모두 80% 이상의 높은 아질산염 소거능을 나타냈다.
- 인삼발효추출물을 10mg/mL의 농도로 SOD 유사활성을 측정한 결과 무발효 추출물은 19.22 ± 0.51%의 소거능을 나타냈으며, E발효추출물의 경우 48시간 발효에서 21.08 ± 0.28%로 증가한 후 72시간 발효에서는 감소하였다.
- 39 ㎎/10 g보다 낮게 나타났지만 SA발효추출물에서는 E발효추출물보다 오히려 높게 나타냈다. 전체적으로는 발효시에 무발효추출물의 폴리페놀 함량보다는 낮았다. 발효시간 변화에 따른 폴리페놀 함량은 BI, LD, LP, LF 및 SA 발효추출물에서는 발효시간이 길어지면 증가하는 경향을 나타냈으며, ST발효추출물에서는 감소하였다.
- 5%의 농도로 처리하여 배지 내에서 LP, LD, LF, ST, BI 및 SA 등 6개 균주의 생장정도를 조사하였다. 추출물의 농도가 낮을 수록 세균수가 많고 추출물의 농도가 높아질수록 세균수가 적어지는 경향이었으며,추출물의 농도가 0.3~0.6%일 때 가장 생장이 좋았다. 따라서 본 연구에서는 인삼추출액의 농도를 0.
- Compound K의 함량은 LP발효추출물을 제외하고는 무발효 < 효소발효 < 효소 + 발효균주 처리구의 순이었으며, 또한 발효시간의 경과와 함께 증가하는 경향이었다. 특히 SA 발효추출물의 Compound K의 함량이 가장 많이 증가하였으며, BI, LD 및 LF 등의 발효추출물이 Compound K의 함량이 증가하는 것으로 나타나 이들은 인삼발효균주로서의 이용 가치가 높은 것으로 판단되었다. 한편 무발효 처리구에서도 홍삼에서 많이 검출되는 Rg3, Rh2 및 Compound K 등이 검출되었는데, 이는 발효과정의 추출물 살균과정에서 온도 (80℃ 및 95℃) 처리에 따른 결과인 것으로 추론되나 추후 좀 더 자세한 검토가 이루어져야 할 것으로 사료된다.
후속연구
- Total sapogenin 함량은 발효하기 전 (64.45 ㎎/g)에 비하여 발효균주의 종류나 시간에 따라 약간의 차이는 있으나 10.87~40.66 ㎎/g으로 대체적으로 줄어드는 것으로 나타났는데, 이것은 발효처리에 의해 조사대상이 된 13종의 sapogenin 이외의 성분으로 전환 된 것이 아닌가 추정되나 추후 이에 대한 자세한 검토가 필요할 것으로 사료된다.
- 특히 SA 발효추출물의 Compound K의 함량이 가장 많이 증가하였으며, BI, LD 및 LF 등의 발효추출물이 Compound K의 함량이 증가하는 것으로 나타나 이들은 인삼발효균주로서의 이용 가치가 높은 것으로 판단되었다. 한편 무발효 처리구에서도 홍삼에서 많이 검출되는 Rg3, Rh2 및 Compound K 등이 검출되었는데, 이는 발효과정의 추출물 살균과정에서 온도 (80℃ 및 95℃) 처리에 따른 결과인 것으로 추론되나 추후 좀 더 자세한 검토가 이루어져야 할 것으로 사료된다.
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