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문제 정의
- 15,16) 큰도둑놈의 갈고리에 대한 약리활성과 식물화학적 성분연구는 지금까지 보고된 바가 없다. 본 연구는 큰도둑놈의갈고리의 DPPH free radical scavenging 효과가 있는 분획의 화합물을 분리하고 그 구조를 확인하여 이 식물이 천연 항산화제로서의 이용가능성을 알아보고자 하였다.
제안 방법
- DPPH free radical 소거법에 의한 항산화활성17) − 96 well plate에 시료를 EtOH로 각 농도별로 조제한 용액에1.5×10-4 M의 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) (EtOH)을 일정량씩 가하였다.
- 이들 중 항산화 활성이가장 강한 ethyl acetate분획에서 DPPH free radical 소거법을 지표로 항산화물질을 분리하였다. Ethyl acetate분획을Sephadex LH-20(MeOH) column chromatography를 실시한후 TLC 양상에 따라 6개 분획(E1-E6)으로 나누었다. 이 중 주요 반점을 나타낸 E3와 E4에서 물질 분리를 시도 하였다.
- 항산화효과는 시료를 첨가하지 않은 대조군의 흡광도와 비교하여 그래프로 나타내었다. 각 시료에 대한 DPPH radical 소거작용을 3회 반복하여 측정하였다.
- 추출 및 분리 − 신선한 큰도둑놈의갈고리 전초를 음건 세절한 다음 건조하여 얻은 시료 약 530 g을 methanol로 가끔 진탕하면서 5시간씩 50℃에서 3회 온침 추출하였다. 그 추출액을 수욕상에서 감압농축하여 methanol 엑스 약 63 g을얻었으며, 이 methanol 엑스에 증류수로 현탁시키고 상법에따라 동량의 n-hexane, methylene chloride, ethyl acetate 및n-butanol 의 순으로 용매 분획하여 12.18 g, 1.39 g, 1.29 g및 6.03 g의 분획물을 각각 얻었다. 이들 중 항산화 활성이가장 강한 ethyl acetate분획에서 DPPH free radical 소거법을 지표로 항산화물질을 분리하였다.
- Ethyl acetate분획을Sephadex LH-20(MeOH) column chromatography를 실시한후 TLC 양상에 따라 6개 분획(E1-E6)으로 나누었다. 이 중 주요 반점을 나타낸 E3와 E4에서 물질 분리를 시도 하였다. E3를 CHCl3 : MeOH : H2O (35:10:1) 혼합용매로 silica gel column chromatography를 수행하여 6개의 소분획 (E31-E36)으로 나누고 E34으로부터 화합물 1 (8 mg)을 얻었다.
- 이상과 같이 큰도둑놈의갈고리 지상부의 methanol 추출물 중 소거활성이 가장 좋은 ethyl acetate 분획에서 물질 5종을 분리하여 그 구조를 동정하였다. 이 화합물들은 본 식물에서 처음 보고되는 화합물이다.
- 이상으로 compound 4를 genistein-7-O-β-D-glucopyranoside (genistin)로 추정하였으며, 이를 문헌22)치와 비교하여 확인하였다.
- 13C-NMR spectrum의 양상도 화합물 1의 rhamnose 대신 glucose로 추정되는peak들을 제외하고 화합물 1과 매우 유사하게 나타났다. 이상으로 화합물 3의 구조는 kaempferol glycoside로 추정하고 기존 문헌20,21)상의 data와 비교하여 kaempferol-3-O-glucopyranoside (astragalin)로 이를 확정하였다 (Fig. 1).
- 13C-NMR spectrum의 양상도 화합물 1과 유사하며 화합물 2에서 확인된 rutinose로 추정되는 peak들이 확인되었다. 이상으로 화합물 5는 kaempferol에 rutinose가 결합한 화합물로 추정되었으며 이를 문헌23)치와 비교하여 kaempferol-3-O-rutinoside로 확인하였다.
- 이상의 결과로 화합물1은 kaempferol-3-O-α-L-rhamnopyranoside (afzeline)로 추정하였으며, 기존문헌18) data와 비교하여 이를 확정하였다(Fig. 1).
- 추출 및 분리 − 신선한 큰도둑놈의갈고리 전초를 음건 세절한 다음 건조하여 얻은 시료 약 530 g을 methanol로 가끔 진탕하면서 5시간씩 50℃에서 3회 온침 추출하였다.
대상 데이터
- 추출 및 분획용 시약은 1급 용매를 사용하였으며, TLC 및 column용 시약 등은 1급 용매를 재증류하여 사용하거나, 특급시약을 사용하였다. Column chromatography용 silica gel은 Kiesel gel 60 (Art. 1.07734, 230-400 mesh, Merck)이며, molecular sieve column chromato-graphy용 packing material은 Sephadex LH-20 (Pharmacia)을 사용하였다. TLC plate는 Kiesel gel 60 F254 precoated plate (Art.
- 10초간 진탕한 후 37℃에서 30분간방치한 후 microplate reader를 이용하여 515 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조약물은 L-ascorbic acid와 BHA (butylated hydroxy anisole)를 사용하였다. 항산화효과는 시료를 첨가하지 않은 대조군의 흡광도와 비교하여 그래프로 나타내었다.
- 07752, Merck)를 사용하였다. 발색시약으로는 10% H2SO4 (in EtOH) 시약을 사용하였으며, UV의 검색은 254, 365 nm에서 하였다.
- 시약 및 기기 − 실험에 사용한 기기로는 1H-NMR 및 13C-NMR spectrum은 Jeol JMN-EX 400 spectrometer (Japan)를 이용하여 확보하였다.
- 실험재료 − 본 실험에 사용한 큰도둑놈의갈고리는 2008년 10월에 전북 순창군에서 채취하였으며, 정확히 감정한 후에 음건세절하여 실험에 사용하였다.
이론/모형
- 03 g의 분획물을 각각 얻었다. 이들 중 항산화 활성이가장 강한 ethyl acetate분획에서 DPPH free radical 소거법을 지표로 항산화물질을 분리하였다. Ethyl acetate분획을Sephadex LH-20(MeOH) column chromatography를 실시한후 TLC 양상에 따라 6개 분획(E1-E6)으로 나누었다.
성능/효과
- 13C-NMR spectrum에서 δ 104.7 (C-1")과 102.3 (C-1'")에서 2개의 anomeric carbon signal로 추정되는 peak가 관찰되어 2 mole의 sugar가 결합되어 있음을 확인할 수 있었다.
- 1H-NMR spectrum에서 δ 8.42 (1H, s)에서 isoflavone의 2번 위치의 특징적인 proton signal로 추정되는 peak가 관찰되었으며, δ 7.38 (2H, d, J = 8.8 Hz)과 6.82 (2H, d, J = 8.8 Hz)에서 B-ring의 o-coupling에 기인한 signal이 확인되었다.
- 또한 δ 6.71 (1H, d, J = 2.4 Hz)과 6.46 (1H, d, J = 2.4 Hz)에서 A-ring의 6번과 8번 위치의 proton이 m-coupling하는 것이 관찰되었으며, δ 5.05 (1H, d, J = 7.2 Hz)에서anomeric proton으로 추정되는 proton signal이 확인되었다.
- 이 화합물들은 모두 본 식물로부터 처음분리·보고되는 화합물이며, 화합물 2가 가장 강한 DPPH radical 소거 효능을 보여 주었다.
- 이상의 data로 화합물 1은 kaempferol 골격의 flavonoid 화합물로 추정되었으며, δ 5.31에서 anomeric proton (J = 1.1 Hz)으로 추정되는 peak가 관찰되었고, δ 0.88 에서 rhamnose 특유의 methyl peak가 확인되었다.
- 이상의 결과로 화합물 2는 quercetin에 2개의 당 glucose와 rhamnose로 이루어진 rutinose를 가지고 있는 화합물로 추정하였으며, 문헌19)조사 결과 quercetin-3-O-[α-L-rhamnopyranosyl(1→6)-β-D-glucopyranoside] (rutin)으로 확정하였다(Fig. 1).
- 이러한 결과는 catechol 부분구조를 가지는 물질이 항산화 효능을 가진다는 보고24)와 일치한다. 이상의 결과를 살펴보면 큰도둑놈의갈고리의 methanol 추출물 중의 DPPH free radical 소거활성은 주로 ethyl acetate 분획물에 존재하는 화합물에 기인한 것으로 생각되며, 그 중에서도 rutin 등의 flavonoid계 화합물에 의한 것으로 사료된다.
- 큰도둑놈의갈고리 지상부의 methanol추출물 중 ethyl acetate분획에서 5종의 화합물을 단리하였으며, 이들의spectral data로부터 구조를 확인한 결과 kaempferol-3-O-rhamnopyranoside (afzeline) (1), quercetin-3-O-[α-L-rhamno-pyranosyl(1→6)-β-D-glucopyranoside] (rutin) (2), kaempferol-3-O-glucopyranoside (3), genistein-7-O-β-D-glucopyranoside(genistin) (4) 및 kaempferol-3-O-rutinoside (5)로 각각 확인·동정하였다.
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