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문제 정의
- 가용성 상태의 칼슘은 침전되어 분변으로 배설되는 것보다 소장에서의 흡수율이 높다. 본 실험은 유산균에 의해서 칼슘이 얼마나 동화될 수 있는가를 조사하기 위하여 배양 상등액에서의 칼슘 함량을 평가하여 감소 또는 증가된 칼슘량을 조사하였다. 실험에 사용한 대조구는 사용한 10% 탈지유를 유산균 배양이 아닌 순수한 젖산으로 pH를 조절하여 분석하였다.
- 본 연구는 여러 곳에서 순수 분리한 22종의 유산균을 대상으로 proteolytic 활성을 평가하여 CPP 생산을 극대화시킬 수 있는 유산균을 선발하고자 하였으며 Cottage 치즈 및 요구르트와 같은 발효유제품 제조에 기초자료를 제공할 목적으로 수행하였다.
제안 방법
- 8% agarose gel로 전기영동을 실시하여 확인하였으며, PCR product purification kit(Intron, Korea)를 사용하여 정제하였다. DNA 염기서열은 ABI 3730xl 자동 염기서열 분석기를 이용하였으며, 분석결과는 NCBI blast(www.ncbi.nih.gov/blast/)의 database를 이용하여 조사하였다.
- PCR premix(Bioneer, Cat No. K-2012)에 증류수 17 µL, forward primer 1 µL, reverse primer 1 µL, DNA 1 µL를 첨가하여 혼합한 후 PCR을 수행하였다.
- PCR 조건은 94℃에서 5분간 처리 후, 94℃에서 1분, 62℃에서 40초, 72℃에서 40초로 30 cycles을 반복하였으며, 72℃에서 40초로 반응을 종료하였다. PCR 반응산물을 0.8% agarose gel로 전기영동을 실시하여 확인하였으며, PCR product purification kit(Intron, Korea)를 사용하여 정제하였다. DNA 염기서열은 ABI 3730xl 자동 염기서열 분석기를 이용하였으며, 분석결과는 NCBI blast(www.
- 김치, 치즈, 요구르트 및 신생아의 분변을 시료로 사용하여 MRS agar(Difco, USA)에 37℃에서 48시간 동안 배양한 다음 유백색 집락을 띄는 균주를 선택하여 순수 분리하였다. 균주의 보존을 위하여 모든 균주를 MRS broth에 3회 계대 배양한 다음, 원심분리(VS-4000N, Vision, Korea; 4,000 rpm, 20 min)하여 세포 침전물에 탈지분유(10%), glucose(2%), yeast extract (0.3%)가 함유된 배지를 제조하여 혼합하였다. 이것을 vial에 1 mL씩 분주하여 동결건조하고 -80℃의 냉동고에 보관하면서 사용하였다.
- 16 g을 4 mL의 에탄올에 각각 용해시켰다. 그 다음 dithiothreitol 99%(DTT) 0.176 g을 넣고 총 volume이 200 mL이 되도록 증류수로 맞춰 OPA reagent를 만들었다. OPA reagent 3 mL과 단백질 가수분해물 400 µL을 혼합하여 2분 후에 340 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 김치, 치즈, 요구르트 및 신생아의 분변을 시료로 사용하여 MRS agar(Difco, USA)에 37℃에서 48시간 동안 배양한 다음 유백색 집락을 띄는 균주를 선택하여 순수 분리하였다. 균주의 보존을 위하여 모든 균주를 MRS broth에 3회 계대 배양한 다음, 원심분리(VS-4000N, Vision, Korea; 4,000 rpm, 20 min)하여 세포 침전물에 탈지분유(10%), glucose(2%), yeast extract (0.
- 대조구로는 10% 탈지분유에 lactic acid를 이용하여 pH를 4.5로 조정한 후 3,000 rpm에서 10분간 원심 분리한 다음 상등액을 0.45 µm syringe filter로 여과하여 평가하였다.
- 본 실험에 사용된 유산균의 경우, 세포내(intracellular) 효소와 세포외(extracellular) 효소로 각각 나누어 proteolytic 활성을 평가하였다. 세포내 효소에 의한 proteolytic 활성은 E.
- CPP는 casein 중 serine의 hydroxyl(-OH) 잔기에 인산기가 결합되어 있는 형태이기 때문에 serine의 함량을 조사함으로써 간접적으로 CPP 함량을 평가할 수 있다. 본 실험에서는 CPP의 이러한 특성을 이용하여 22종 유산균을 우유배지에서 배양한 다음, 상등액에 존재하는 유리된 serine의 양을 조사함으로써 배양 전 serine의 양과 비교하였다(Fig. 1).
- CPP는 체내에 칼슘 흡수를 촉진시켜 주는 것으로 알려져 있다. 본 실험에서는 우유단백질인 casein에 형광물질인 fluorescein isothiocyanate(FITC)를 표지시켜 측정하는 방법을 사용하였다. 우유 중의 casein은 fluorescein thiocarbamoyl 형태로 FITC와 반응하고, 이 기질이 trypsin, chymotrypsin, elastase, subtilisin, thermolysin 등과 같은 단백질 분해효소에 의해 가수분해 되는 성질을 이용하여 casein 분해 활성을 형광도로 측정하는 방법이다(Twining, 1984).
- 본실험에서는 유산균의 proteolytic 활성 측정을 위해 단백질 분해효소 중 하나인 trypsin을 대조구로 하여 casein을 분해시키는 능력을 비교하였다.
- 상기방법으로 동결 건조된 CPP enrichment를 1 g/mL이 되도록 potassium phosphate buffer에 녹인 후 원심분리 하여 상등액을 시료로 o-phthaldialdehyde(OPA) 방법을 사용하여 시료중의 CPP 함량을 평가 하였다(Church et al., 1983). OPA 방법은 di-sodium tetraborate 7.
- 본 실험은 유산균에 의해서 칼슘이 얼마나 동화될 수 있는가를 조사하기 위하여 배양 상등액에서의 칼슘 함량을 평가하여 감소 또는 증가된 칼슘량을 조사하였다. 실험에 사용한 대조구는 사용한 10% 탈지유를 유산균 배양이 아닌 순수한 젖산으로 pH를 조절하여 분석하였다. 대조군의 유리 칼슘함량은 9.
- 유산균 배양상등액과 유산균 세포질에 존재하는 proteinase의 활성을 평가하기 위하여 fluorescein isothiocyanate(FITC)가 표지된 casein을 기질로 사용하여 형광 spectrophotometer(Synergy HT, BIO Tek, Winooski, USA)를 이용하여 평가하였다. FITC-labeled casein(Sigma, Product Code PF0100) 기질 20 µL에 시료 10 µL를 incubation buffer(20 mM sodium phosphate-150 mM sodium chloride, pH 7.
- 유제품, 김치 및 신생아 분변 등에서 유산균을 분리하여 우유 casein을 분해시켜 배양상등액에 존재하는 serine의 함량을 측정함으로써 간접적으로 CPP 생산을 평가하였다. CPP 생산 능력은 OPA방법으로 측정했을 때 E.
- 칼슘 함량은 QuantichromTM calcium assay kit(BioAssay systems, USA)를 사용하여 96-well plate에 각각 5 µL씩 넣고 612 nm에서 흡광도를 측정하였으며, calcium standard curve와 비교하여 함량을 계산하였다.
- OPA reagent 3 mL과 단백질 가수분해물 400 µL을 혼합하여 2분 후에 340 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로는 serine를 이용하여 그 함량을 계산하였다.
이론/모형
- Casein phosphopeptide (CPP) content of cell-free supernatants prepared from reconstituted skim milk fermented by lactic acid bacteria at 37℃. CPP content calculated by o-phthaldialdehyde spectrophotometric method. Results are means of at least four experiments.
- Sodium caseinate 분해물 제조는 Adamson과 Reynolds(1995), Corsetti 등(2003)의 방법에 따라 다음과 같이 수행하였다. Sodium-caseinate(Armor) 12.
성능/효과
- 22종의 유산균에서 E. faecalis A-4 및 A-5, 그리고 L. plantarum A-9균주를 제외한 나머지 19균주는 대조구보다 높은 peptide의 함량을 가지고 있었으며, 가장 높은 균주는 E. faecalis A-2 균주로 1.244 mg/mL로 나타났다. 그 밖에도 L.
- 유제품, 김치 및 신생아 분변 등에서 유산균을 분리하여 우유 casein을 분해시켜 배양상등액에 존재하는 serine의 함량을 측정함으로써 간접적으로 CPP 생산을 평가하였다. CPP 생산 능력은 OPA방법으로 측정했을 때 E. faecalis A-2 균주가 1.244 mg/mL로 가장 많은 peptide를 생산 하였다. 본 실험에 사용된 유산균의 경우, 세포내 효소와 세포외 효소로 각각 나누어 proteolytic 활성을 평가한 결과 세포내 효소에 의한 proteolytic 활성은 E.
- 22종에 대한 유산균을 16S rDNA sequence에 근거하여 동정한 결과는 Table 1에 표시된 바와 같다. MRS agar에 유산균을 도말하여 순수한 colony를 분리한 다음 Gram 염색하여 현미경으로 관찰한 결과 그 형태와 동정 결과가 모두 일치하였다. 선발된 유산균은 유산구균이 10균주, 유산간균이 12균주로 나타났다.
- Serine의 함량을 측정하여 CPP 함량을 간접 추정한 결과 peptide 함량은 0.760 mg/mL로 측정되었다. 비록 본 방법이 CPP 함량을 정확하게 측정 하는 것은 아니지만 손쉽게 사용할 수 있다는 장점이 있다고 판단되었다.
- plantarum A-14 균주에서 가장 높게 나타났다. 가용성 칼슘함량은 Leuconostoc mesenteroides A-1(11 mg/dL), E. durans A-16(10.481 mg/dL), 그리고 L. planatarum A-3(10.356 mg/dL) 균주의 경우에는 대조구보다 높은 유리 칼슘함량을 나타내었다. 따라서 이러한 유산균을 이용한다면 소장 내에서 칼슘 흡수를 극대화시킬 수 있는 장점이 있어 이들 유산균을 이용한 고칼슘 제품개발이 가능할 것이다.
- 1). 그러나 E. faecalis A-2 균주는 106 cfu/mL 수준으로 접종된 우유발효 실험에서 pH 4.5에 도달하는 시간이 30시간이 걸려 발효유에 적용하기에는 다소 무리가 있었지만 L. rhamnosus A-18 균주는 배양 12시간에 pH 4.5에 도달하여 발효유 제조에 무리가 없을 것으로 판단되었다(결과 미제시).
- 실험에 사용한 대조구는 사용한 10% 탈지유를 유산균 배양이 아닌 순수한 젖산으로 pH를 조절하여 분석하였다. 대조군의 유리 칼슘함량은 9.604 mg/dL로 측정되었으며, 유산균으로 발효과정을 거친 이후에 가용성 칼슘함량은 몇몇 균주를 제외하고 대부분의 시료에서 이보다 적은 것으로 나타났다. E.
- 2). 본 실험 결과 proteinase 활성은 E. faecalis A-2와 A-6, E. durans A-21 균주들의 경우 세포내 활성이 유의적으로 높은 활성을 보였으나, 대부분의 유산균에 있어서 세포내보다 세포외에서 더 높은 것으로 나타났다. 유산균의 proteolytic 활성은 casein을 작은 peptide나 아미노산 수준으로 분해시켜 세포안으로 운반해서 영양물질로 사용하기 때문에 세포외 효소활성이 높다.
- 244 mg/mL로 가장 많은 peptide를 생산 하였다. 본 실험에 사용된 유산균의 경우, 세포내 효소와 세포외 효소로 각각 나누어 proteolytic 활성을 평가한 결과 세포내 효소에 의한 proteolytic 활성은 E. faecalis A-6 균주가 가장 높은 것으로 나타났으며, 세포외 효소에 의한 proteolytic 활성은 L. plantarum A-14 균주에서 가장 높게 나타났다. 가용성 칼슘함량은 Leuconostoc mesenteroides A-1(11 mg/dL), E.
- 760 mg/mL로 측정되었다. 비록 본 방법이 CPP 함량을 정확하게 측정 하는 것은 아니지만 손쉽게 사용할 수 있다는 장점이 있다고 판단되었다.
- 본 실험에 사용된 유산균의 경우, 세포내(intracellular) 효소와 세포외(extracellular) 효소로 각각 나누어 proteolytic 활성을 평가하였다. 세포내 효소에 의한 proteolytic 활성은 E. faecalis A-6 균주가 가장 높은 것으로 나타났으며, 세포외 효소에 의한 proteolytic 활성은 L. plantarum A-14 균주에서 가장 높게 나타났다(Fig. 2). 본 실험 결과 proteinase 활성은 E.
- 선발된 유산균은 유산구균이 10균주, 유산간균이 12균주로 나타났다. 유산구균의 경우 대부분 유아분변에서 채취된 것으로 Enterococcus faecalis가 10균주 중 5균주로 나타났고, 유산간균의 경우 Lactobacillus plantarum이 12균주 중에서 10균주로 대다수를 차지하는 것으로 나타났으며 이들은 모두 김치에서 분리되었다. 일차적인 동정은 API 50 CH를 이용하였으며, 여기서 얻어진 결과와 16S rDNA 분석 결과와 다소 다른 균주가 있었으나, 16S rDNA 분석결과가 99%의 정확성을 지니는 것으로 나타나 16S rDNA 동정결과를 기초로 선발된 미생물의 속명과 종명을 결정하였다(Table 1).
- 유산구균의 경우 대부분 유아분변에서 채취된 것으로 Enterococcus faecalis가 10균주 중 5균주로 나타났고, 유산간균의 경우 Lactobacillus plantarum이 12균주 중에서 10균주로 대다수를 차지하는 것으로 나타났으며 이들은 모두 김치에서 분리되었다. 일차적인 동정은 API 50 CH를 이용하였으며, 여기서 얻어진 결과와 16S rDNA 분석 결과와 다소 다른 균주가 있었으나, 16S rDNA 분석결과가 99%의 정확성을 지니는 것으로 나타나 16S rDNA 동정결과를 기초로 선발된 미생물의 속명과 종명을 결정하였다(Table 1).
후속연구
- 이러한 유리 칼슘의 감소는 세포성분으로 동화되어 이용되었거나 단순 침전에 의한 것으로 생각될 수 있으나, 본 실험에서는 pH를 모두 조정하였기 때문에 단순 침전보다는 유산균 세포에서 동화되었을 것으로 추정되었다. 그러나 유산균 이용성에 대한 기작은 좀더 연구가 진행되어야 명확한 동화기전이 밝혀질 것이다.
- 대조구로 사용된 trypsin과 유산균의 proteinase 활성을 비교해 보았을 때 그 차이가 크지는 않았지만 세포 침전물이나 배양 상등액에서 모두에서 proteolytic 활성을 보여 이를 이용한 다양한 제품개발을 위한 기초자료로 사용이 가능 할 것으로 판단되었다.
- acidophilus의 유산균에 단백질 가수 분해 활성이 있다고 보고하였으며 Koroleva 등(1983), Klaver 등(1993), Singh와 Sharma(1983)도 유산균에 단백질 가수 분해 활성이 있다고 보고하였다. 따라서 본 실험에서 평가된 일부 유산균은 간접적으로 CPP 생산 능력이 있다고 판단되며, 이를 이용하여 CPP 생산 능력이 있는 유제품의 개발이 가능할 것으로 기대된다.
- 356 mg/dL) 균주의 경우에는 대조구보다 높은 유리 칼슘함량을 나타내었다. 따라서 이러한 유산균을 이용한다면 소장 내에서 칼슘 흡수를 극대화시킬 수 있는 장점이 있어 이들 유산균을 이용한 고칼슘 제품개발이 가능할 것이다.
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