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문제 정의
- 본 연구에서는 기존의 polyester 염색가공폐수의 처리공정으로부터 중화과정을 생략할 수 있는 방안 개발의 일환으로, 강알칼리성 영역에서 색도를 제거하는 호알칼리성 미생물을 개발하고, 개발한 호알칼리성 미생물의 특성과 염료에 대한 색도제거효율에 대해 조사하고자 한다.
제안 방법
- YBE-12의 분리배지에서 인원 및 칼륨원으로 사용한 KH2PO4의 농도에 따른 균주성장과 염료제거효율을 알아보기 위하여 KH2PO4를 전혀 첨가하지 않은 배지와 KH2PO4의 농도를 각각 0.05%(w/v), 0.1%(w/v), 0.2%(w/v), 0.3%(w/v), 0.4%(w/v), 0.5%(w/v)으로 달리 한 배지에서 YBE-12를 24시간 회분식으로 배양한 후 KH2PO4농도에 따른 균주성장과 염료제거효율을 조사하여 그 결과를 Fig. 6에 나타내었다. Fig.
- 균체의 성장은 일정량의 sample를 증류수로 10배 희석한 후 UV-VIS. spectrophotometer(Phar-macia Biochrom 4060)를 이용 660nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 다량영양소(macronutrients)에 따른 호알칼리성 미생물 YBE-12의 균주성장 및 염료제거를 위한 특성조사로부터, 배지의 조성은 증류수 1L에 대해 yeast extract 0.25%(w/v), polypeptone 0.25%(w/v), KH2PO4 0.1%(w/v), MgSO4·7H2O 0.02%(w/v), Na2CO3 1.0%(w/v)로 결정하였다.
- 미생물의 성장과 염료제거가 가장 잘 이루어지는 초기 pH를 알아보기 위해, yeast extract 0.25%(w/v), polypepton 0.25%(w/v), KH2PO4 0.1%(w/v), MgSO4·7H2O 0.02%(w/v)와 Disperse Red 60이 0.01%(w/v) 포함된 액체배지에 Na2CO3를 첨가하여 초기 pH를 조절하였으며 pH6 ~pH11범위내에서 pH를 1씩 변화시킨 배양액을 만들었다.
- 선발한 균주를 염료제거와 균주성장에 대한 특성조사는 250ml용 Erlenmeyer flask에 50ml의 액체 배지를 넣고 균주를 접종한 후 회분식으로 배양하면서 수행하였다.
- 선발한 알칼리성 균주를 이용하여 회분식으로 6종류의 염료를 사용하여 색도제거 실험을 하였다. 이들 염료중의 3종류는 분산염료인 Disperse Red 60(anthraquinone 계), Disperse Blue 87 (anthraquinone 계), Disperse Yellow 64(quinoline 계)이고, 나머지 3종류는 수용성염료인 Acid Red 138(azo 계), Acid Blue 193(monoazo 계), Direct Yellow 28(azo 계)이다.
- 토양, 하천수 등의 시료를 채취하여 염료가 포함된 배지에 접종하여 배양한 다음 염료농도가 낮아진 배지에서 미생물들을 순수분리 하였다. 순수분리한 미생물들을 염료가 포함된 배지에 각각 24시간 배양하여 가장 염료농도가 가장 낮아진 배지에서 배양한 균주를 선발하였다.
- 0%(w/v)으로 하고, 배양온도는 35℃, 배양 초기 pH는 pH10으로 결정하였다. 여기서 Na2CO3를 비교적 많이 첨가한 것은 pH를 조절하여 알카리성 염료용액을 만들기 위해 첨가한 것으로, 이미 Fig 4.에서 본 바와 같이 초기 pH 10에서 세포성장과 염료제거효율이 가장 우수하였는데, 이때 초기 pH 10을 맞추기 위해 Na2CO3가 1.0%(w/v)포함된 배양액을 최적 배지조성으로 하였다.
- 여기서 초기 pH8은 Na2CO3 0.09(w/v), 초기 pH9은 Na2CO3 0.20(w/v), 초기 pH10은 Na2CO3 1.00(w/v), 초기 pH11은 Na2CO3 2.20(w/v) 되게 첨가하여 조절하였으며, 초기 pH6과 초기 pH7은 황산용액을 소량 첨가하여 조절하였다.
- 염료제거효율은 배양액 1ml를 취하여 n-buthanol 4ml와 혼합한 다음 두 액의 상이 완전하게 구분이 될 때 상등부의 butanol층만을 취하여 원심분리 후 염료의 특정 peak가 나타나는 파장에서 흡광도를 측정하였다. 염료는 각기 특성 peak를 나타내는 파장이 있는데 각 염료들의 특성 파장에서 흡광도와 염료의 양에 대한 calibration curve를 작성하고 이것을 염료 농도 분석에 이용하였다.
- 염료제거 및 균주성장을 위한 최적온도, 최적초기 pH와 배지성분 각각의 최적함량 등을 조사하였다.
- 염료제거균주 YBE-12의 균주성장과 염료제거효율에 미치는 질소원의 영향을 알아보기 위해 균주 분리에 사용한 배지의 조성에서 질소원을 다르게 하여 회분식으로 35℃에서 24시간 배양한 다음 균주의 성장과 염료제거효율을 조사하고, 그 결과를 Table 3에 나타내었다. 질소원은 12종류를 사용하였으며, 이 중 5종류의 질소원은 유기 질소원과 무기 질소원을 1:1로 혼합하여 사용하였고 7종류의 질소원은 유기 질소원 또는 무기 질소원을 단독으로 사용하였다.
- 염료제거균주 YBE-12의 특성조사에는 분산 염료 Disperse Red 60만 넣고 사용하였으므로, 이번에는 특성조사에서 결정한 배지조성에 각종 염료들을 Erlenmeyer flask에 각각 100mg/L 가 되게 넣고 YBE-12를 24시간 회분식으로 배양하면서 시간에 따른 각 염료들의 농도변화를 조사하여 그 결과를 Fig. 8과 Fig. 9에 나타내었다. Fig.
- 염료제거균주 분리를 위해 사용한 배지에 MgSO4·7H2O의 농도가 YBE-12의 균주성장과 염료제거효율에 어떤 영향을 미치는지 알아보기 위하여, MgSO4·7H2O를 첨가하지 않은 배지와 MgSO4·7H2O 농도를 각각 0.01%(w/v), 0.02%(w/v), 0.03%(w/v), 0.04%(w/v), 0.05%(w/v), 0.07%(w/v), 0.10%(w/v)로 달리한 배지에서 YBE-12를 24시간 회분식으로 배양한 뒤 균주성장과 염료제거효율을 조사하여 그 결과를 Fig. 7에 나타내었다.
- 염료제거균주 분리에 사용한 배지의 조성은 증류수 1L에 대해 yeast extract 0.25%(w/v), polypepton 0.25%(w/v), KH2PO4 0.1%(w/v), MgSO4 · 7H2O 0.02%(w/v), Na2CO3 1.0%(w/v)로 하였고, 액체배지에는 여기에 염료를 100mg/L 되게 넣고, 고체배지에는 여기에 염료를 1,000mg/L 되게 넣고 agar powder를 1.5%(w/v)추가하였다.
- 염료제거효율은 배양액 1ml를 취하여 n-buthanol 4ml와 혼합한 다음 두 액의 상이 완전하게 구분이 될 때 상등부의 butanol층만을 취하여 원심분리 후 염료의 특정 peak가 나타나는 파장에서 흡광도를 측정하였다. 염료는 각기 특성 peak를 나타내는 파장이 있는데 각 염료들의 특성 파장에서 흡광도와 염료의 양에 대한 calibration curve를 작성하고 이것을 염료 농도 분석에 이용하였다.
- 염색폐수의 색도제거를 위해 염료제거기능이 우수한 호알칼리성 균주를 분리하였다. 선발한 균주는 동정결과 Pseudomonas sp.
- 온도가 미생물의 성장과 염료 제거에 미치는 영향을 알아보기 위해, Disperse Red 60이 포함된 배지에 YBE-12를 접종하고 배양온도를 25℃에서 45℃까지 5℃간격으로 조정하여 24시간 회분식으로 배양한 다음 각 배양온도에서 균주성장과 염료제거효율을 측정하여 Fig. 3에 나타내었다. Fig.
- 이 결과에서 YBE-12 균주성장과 염료제거를 위한 MgSO4·7H2O 최적농도는 0.05%였으나, MgSO4·7H2O 농도 0.02%일 때의 염료제거효율과 크게 차이가 나지 않았으므로 경제성등을 고려하여 배지조성 중 MgSO4·7H2O의 주입농도를 0.02%(w/v)로 결정하였다.
- 20(w/v) 되게 첨가하여 조절하였으며, 초기 pH6과 초기 pH7은 황산용액을 소량 첨가하여 조절하였다. 이 배양액 50ml를 각각 250ml용 Erlenmeyer flask에 넣고 YBE-12를 접종하여 35℃에서 24시간 회분식으로 배양하여 미생물 성장과 염료제거효율을 조사하였으며, 이 결과를 Fig. 4에 나타내었다. Fig.
- 고체배지에서 성장한 미생물들중 주위에 clear zone이 형성된 colony를 선택하여 계대배양을 통해 순수 분리하였다. 이와 같은 방법으로 염료제거능을 가진 미생물 10종류를 Disperse Red 60이 포함된 액체배지에 각각 접종하고 35℃에서 24시간 배양한 다음, 배양액의 초기 염료농도와 24시간 배양 후 염료농도를 측정하여 염료제거효율을 계산하여 Table 1에 나타내었다. Table 1에서 보는 바와 같이 염료를 가장 많이 제거시킨 균주번호 4를 염색폐수의 색도제거 연구 및 실험를 위한 균주로 최종 선발하였다.
- 토양, 하천수 등의 시료를 멸균 증류수에 현탁시킨 후 현탁액을 Disperse Red 60이 100mg/L 되게 포함된 액체배지에 접종하고 35℃에서 배양한 다음 각 액체배지의 염료농도를 측정하여 이 중 염료농도가 낮아진 액체배지의 배양액을 Disperse Red 60이 포함된 고체배지에 도말하고 배양하였다. 고체배지에서 성장한 미생물들중 주위에 clear zone이 형성된 colony를 선택하여 계대배양을 통해 순수 분리하였다.
- 토양, 하천수 등의 시료를 채취하여 염료가 포함된 배지에 접종하여 배양한 다음 염료농도가 낮아진 배지에서 미생물들을 순수분리 하였다. 순수분리한 미생물들을 염료가 포함된 배지에 각각 24시간 배양하여 가장 염료농도가 가장 낮아진 배지에서 배양한 균주를 선발하였다.
대상 데이터
- 이와 같은 방법으로 염료제거능을 가진 미생물 10종류를 Disperse Red 60이 포함된 액체배지에 각각 접종하고 35℃에서 24시간 배양한 다음, 배양액의 초기 염료농도와 24시간 배양 후 염료농도를 측정하여 염료제거효율을 계산하여 Table 1에 나타내었다. Table 1에서 보는 바와 같이 염료를 가장 많이 제거시킨 균주번호 4를 염색폐수의 색도제거 연구 및 실험를 위한 균주로 최종 선발하였다.
- 에 의한 azo계 염료의 분해에 대한 연구4,5), azo redutase에 의한 azo계 염료의 분해 mechanism에 대한 연구, algae에 의한 염료분해 연구6)와 actinomycetes에 의한 염료분해에 대한 연구7,8)가 있었다. 이들 연구에서는 중 성영역에서 활성을 띄는 미생물을 이용하였다. 물리적 또는 화학적인 염료의 제거 방법으로는 활성탄 등을 이용한 흡착법9), 과산화 수소(Fenton's reagent), 염소 및 오존을 이용한 산화법10,11), 고분 자막을 이용한 분리법등이 있었다.
- 염료제거균주 YBE-12의 균주성장과 염료제거효율에 미치는 질소원의 영향을 알아보기 위해 균주 분리에 사용한 배지의 조성에서 질소원을 다르게 하여 회분식으로 35℃에서 24시간 배양한 다음 균주의 성장과 염료제거효율을 조사하고, 그 결과를 Table 3에 나타내었다. 질소원은 12종류를 사용하였으며, 이 중 5종류의 질소원은 유기 질소원과 무기 질소원을 1:1로 혼합하여 사용하였고 7종류의 질소원은 유기 질소원 또는 무기 질소원을 단독으로 사용하였다. 각각의 질소원의 함량은 배지용액의 용량에 대해 0.
이론/모형
- 주사전자현미경(SEM)(Hitachi, S-4300)을 사용하여 선발한 염료제거 미생물의 형태를 관찰하였고, 미생물의 동정은 한국과학기술원 생명공학연구소 유전자원센터 유전자은행에 의뢰하였다.
성능/효과
- 8에서 보면 24시간 배양 후 가장 많이 제거된 염료는 Disperse Blue 87이며 이 염료는 배양 6시간 후 본격적으로 제거되기 시작했고 배양 20시간 후 염료제거효율이 75%로 제거가 거의 완료된 것으로 볼 수 있으며, 24시간 배양 후 염료제거효율은 76%였다. Disperse Yellow 64는 배양 4시간 후 급격히 제거가 시작되었으며 배양 18시간 후 염료제거효율이 70%로 제거가 거의 정지된 것으로 볼 수 있으며, 24시간 배양 후 염료제거효율은 71%였다. Disperse Red 60은 배양 8시간 후 염료가 본격적으로 제거되기 시작하여 배양 22시간 후 염료제거효율은 58%로 제거가 거의 정지된 것으로 볼 수 있으며, 24시간 배양 후에도 염료제거효율 58%였다.
- 4에 나타내었다. Fig. 4에서 보면 초기 pH6에서 24시간 배양한 후 염료제거효율은 10.2%, 초기 pH7에서 염료제거효율은 10.5%, 초기 pH8에서 염료제거효율은 31.1%, 초기 pH9에서 염료제거효율은 32.7%, 초기 pH10에서 염료제거효율은 36.7%였고 초기 pH11에서 염료제거효율은 13.3% 였다. 가장 우수한 미생물 성장과 염료제거효율을 보여준 초기pH는 pH10이였으며, 초기 pH8과 초기 pH9에서 염료제거효율은 31%이상으로 우수하였고, 반면에 초기 pH6, 초기 pH7, 초기 pH11에서는 염료제거효율은 13.
- Fig. 4와 Fig. 5의 결과들로 부터 염료제거 균주 YBE-12는 알칼리성 영역에서 염료제거효율이 우수하였으며, 초기 pH9, pH10, pH11의 염료용액에 이 균주를 배양하였을 때 배지의 pH가 낮아지는 것을 볼 수 있었다.
- 8은 Disperse Red 60(anthraquinone 계), Disperse Blue 87(anthraquinone 계), Disperse Yellow 64(quinoline 계)가 각각 함유된 배지에서 YBE-12를 24시간 회분식으로 배양하였을 때 시간의 경과에 따른 각 분산염료들의 염료제거효율을 나타낸 것이다. Fig. 8에서 보면 24시간 배양 후 가장 많이 제거된 염료는 Disperse Blue 87이며 이 염료는 배양 6시간 후 본격적으로 제거되기 시작했고 배양 20시간 후 염료제거효율이 75%로 제거가 거의 완료된 것으로 볼 수 있으며, 24시간 배양 후 염료제거효율은 76%였다. Disperse Yellow 64는 배양 4시간 후 급격히 제거가 시작되었으며 배양 18시간 후 염료제거효율이 70%로 제거가 거의 정지된 것으로 볼 수 있으며, 24시간 배양 후 염료제거효율은 71%였다.
- 1%였다. KH2PO4농도 0.2%(w/v)및 0.3%(w/v)에서 염료제거효율은 각각 442.% 및 42.7%였고, KH2PO4농도 0.05%(w/v) 및 0.4%(w/v)에서 염료제거효율은 각각 33.6%와 31.5%로 양호한 결과를 보였으며, KH2PO4첨가되지 않은 배지와 KH2PO4농도가 0.5%(w/v)인 배지에서는 21.7%와 26.4%였다. 이 결과에서 염료제거균주 YBE-12의 균주성장과 염료제거를 위한 KH2PO4농도는 0.
- MgSO4·7H2O 농도 0.02%(w/v) ~ 0.04%(w/v)에서 염료제거효율은 46.1% ~ 48.5%로 MgSO4·7H2O 농도 0.05%(w/v)에서의 염료제거효율과 크게 차이가 나지 않았으며, MgSO4·7H2O가 첨가되지 않은 배지와 MgSO4·7H2O 농도 0.01%(w/v)인 배지에서 염료제거효율은 각각 28.6%와 30.6%였다.
- YBE-12로 명명하였다. YBE-12의 특성조사 결과 균주성장과 염료제거를 위한 최적 배양온도는 35℃, 최적 초기 pH는 10.0이었으며, 30~40℃의 온도범위에서 Disperse Red 60 제거효율은 33.5~36.9%였고 초기 pH8~pH10의 범위에서 Disperse Red 60 제거효율이 31.1~36.7%로 넓은 온도범위와 비교적 넓은 알칼리성 영역의 pH 범위에서 우수한 염료제거효율을 보였다. 다량영양소(macronutrients)에 따른 호알칼리성 미생물 YBE-12의 균주성장 및 염료제거를 위한 특성조사로부터, 배지의 조성은 증류수 1L에 대해 yeast extract 0.
-
3% 였다. 가장 우수한 미생물 성장과 염료제거효율을 보여준 초기pH는 pH10이였으며, 초기 pH8과 초기 pH9에서 염료제거효율은 31%이상으로 우수하였고, 반면에 초기 pH6, 초기 pH7, 초기 pH11에서는 염료제거효율은 13.3% 이하로 저조하였다. 초기 pH가 8,9,10인 알칼리성인 합성염료용액에서 YBE-12가 우수한 염료제거효율
- 가장 우수한 염료제거효율을 보여준 MgSO4·7H2O 농도는 0.05% (w/v)였고 이 농도에서 염료제거효율은 50.0%였다.
- 각각의 질소원에 대한 염료제거효율을 살펴보면 24시간 회분식 배양 후 yeast extract를 사용한 배지에서 염료제거효율은 38%, polypeptone을 사용한 배지에서 염료제거효율은 23%, peptone을 사용한 배지에서 염료제거효율은 21%였으며, yeast extract + NaCO3를 사용한 배지에서 염료제거효율이 9%, polypeptone + NaCO3를 사용한 배지에서 6%였으며 나머지 질소원에서는 염료가 제거되지 않았다.
- 7%였다. 균주성장과 염료제거를 위한 최적 배양온도는 35℃였고, 30~40℃의 넓은 온도범위에서 우수한 염료제거효율을 보였으며, 실험에 적용한 온도범위 내에서 균주성장과 염료제거가 모두 이루어졌다. 실제 현장의 염색폐수처리장에 유입되는 종합 염색폐수의 수온은 통상 30℃를 넘으며 계절과 기후에 따라 온도변화가 심하고 여름철에는 수온이 약 40℃까지 된다.
- 0%(w/v)로 결정하였다. 선발한 미생물을 계대배양하면서 활성화시킨 다음 이 미생물을 이용하여 분산염료와 수용성염료를 회분식으로 염료제거실험을 한 결과, 24시간 배양 후 Disperse Blue 87은 76%, Disperse Yellow 64는 71%, Disperse Red 60은 58%, Acid Blue 193은 93%, Acid Red 138은 94% Direct Yellow 23은 90% 각각 제거되었다.
- 이 결과들을 고찰해 보면 염료제거 균주 YBE-12는 강알칼리성의 염색폐수를 중화공정 없이 바로 처리할 수 있으며, 처리수의 pH도 법적규제치(pH5.8~8.6)의 상한선인 pH8.6에 가깝게 내려가므로 최종 방류전에 필요에 따라 약간의 중화처리만 해 주면 될 것이므로 기존의 polyester 염색가공폐수처리의 중화공정에 사용하는 황산의 소모량을 대폭 줄일 수 있을 것으로 판단된다.
- 이 실험에서 특이한 현상이 발생하였는데 MgSO4·7H2O의 농도가 0.05%(w/v) 보다 많은 주입량을 배지에 혼합시 미세한 결정의 침전물이 형성되었으며, 배양시간과 MgSO4·7H2O 농도를 더욱 증가시키면 침전물의 부피와 양도 더욱 증가하였다.
- 이상의 결과에서, 알카리성 염료용액의 색도제거를 위한 호알카리성 염료제거균주 YBE-12 을 배양하기위한 배지조성은 증류수 1L에 대하여 yeast extract 0.25%(w/v), polypepton 0.25%(w/v), KH2PO4 0.1%(w/v), MgSO4·7H2O 0.02%(w/v), Na2CO3 1.0%(w/v)으로 하고, 배양온도는 35℃, 배양 초기 pH는 pH10으로 결정하였다.
-
3% 이하로 저조하였다. 초기 pH가 8,9,10인 알칼리성인 합성염료용액에서 YBE-12가 우수한 염료제거효율
을 보였다. - 한편, 배양 24시간째 염료제거효율을 보면 먼저 염료제거가 시작된 Disperse Yellow 64가 Disperse Blue 87보다 염료제거효율이 낮았으며, 가장 늦게 염료제거가 시작된 Disperse Red 60은 가장 적게 염료가 제거되어 염료제거 시작시간과 염료제거효율은 크게 상관없는 것으로 판단된다.
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