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호알칼리성 Bacillus pseudofirmus HS-54가 생산하는 알칼리성 Protease의 특성
Characterization of an Alkaline Protease from an Alkalophilic Bacillus pseudofirmus HS-54 원문보기

Korean journal of microbiology = 미생물학회지, v.47 no.3, 2011년, pp.194 - 199  

방성호 (한서대학교 생명과학과) ,  정인실 (한서대학교 생명과학과)

초록
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알칼리성 protease를 생산하는 호알칼리성 균주를 분리하여 Bacillus pseudofirmus HS-54로 동정하였고, HS-54가 생산하는 알칼리성 protease를 ammonium sulfate 침전, DEAE cellulose chromatography, sephadex G-100 gel filtration을 통과시켜 정제하였는데, 정제된 protease의 분자량은 27 kDa이었다. 정제된 효소의 반응최적 pH는 10.0이었고 pH 7.0-11.0에서 비교적 안정하였다. 또한 정제된 효소의 반응최적 온도는 $50^{\circ}C$이었고 $10-55^{\circ}C$에서 안정하였다. 금속이온에 대한 영향은 $Ca^{2+}$$Mg^{2+}$ 등에 의해 효소활성이 촉진되었으나, $Hg^{2+}$, $Zn^{2+}$, $Cu^{2+}$, $Al^{3+}$ 등에 의해서 효소활성이 저해되었다. 본 효소는 PMSF에 의해 강하게 저해를 받는 것으로 보아 serine protease에 속하는 것으로 판단된다.

Abstract AI-Helper 아이콘AI-Helper

An alkalophilic bacterium producing alkaline protease was isolated from waste water and solar saltern sample and identified as Bacillus pseudofirmus HS-54 based on morphological, biochemical characteristics as well as 16S-rRNA gene sequencing. The HS-54 protease was purified to homogeneity using amm...

주제어

AI 본문요약
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제안 방법

  • B. pseudofirmus HS-54 배양액에서 균체를 제거한 조효소액을 ammonium sulfate (30-80%)로 침전시킨 단백질을 20 mM phosphate buffer (pH 7.5)에 녹여 DEAE cellulose column과 sephadex G-100 column에 주입하여 용출시켜 효소를 정제하였다(자료 미제시). 이상의 정제과정을 요약하면 Table 1과 같으며 최종 수율은 2.
  • HS-54의 동정을 위해 그람염색, 포자염색 및 주사 전자현미경(JEOL, JSM-5600)을 이용하여 형태적 특성을 확인하였고, 생리생화학적 특성을 확인하기 위하여 인돌생성 유무, MR-VP 시험, catalase와 oxidase 활성시험, citrate 이용 여부 시험, 탄소원 이용 여부 시험 등을 수행하였다. ㈜솔젠트에 의뢰하여 16S rRNA 유전자 염기서열을 확인하였는데, 분리 세균의 16S rRNA 유전자는 8F (5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′)와 1492R (5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)을 primer로 이용하여 PCR을 수행해서 증폭하고 염기서열을 확인했으며, 여러 균주들과의 상동성을 National Center for Biotechnology Information (NCBI)의 Basic Logical Alignment Search Tool (BLAST)를 통하여 확인하고, 분리균주를 동정하였다.
  • Protease 저해제의 영향: B. pseudofirmus HS-54의 알칼리성 protease의 활성에 미치는 다양한 저해제의 영향을 조사하였다[Table 3]. HS-54의 알칼리성 protease는 PMSF에 의해 강한 저해작용을 받았다.
  • ㈜솔젠트에 의뢰하여 16S rRNA 유전자 염기서열을 확인하였는데, 분리 세균의 16S rRNA 유전자는 8F (5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′)와 1492R (5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)을 primer로 이용하여 PCR을 수행해서 증폭하고 염기서열을 확인했으며, 여러 균주들과의 상동성을 National Center for Biotechnology Information (NCBI)의 Basic Logical Alignment Search Tool (BLAST)를 통하여 확인하고, 분리균주를 동정하였다.
  • 금속 이온의 영향: B. pseudofirmus HS-54에서 정제한 알칼리성 protease의 활성에 미치는 다양한 금속이온(Na+, K+, Ca2+, Mg2+, Cu2+, Zn2+, Hg2+, Fe3+, Al3+ 등)의 영향을 조사하기 위하여 최종 농도가 1 mM과 5 mM이 되도록 해당 금속이 온의 금속염을 첨가하여 50°C에서 30분간 효소를 전처리시킨 후 효소의 잔존 활성을 조사하였다[Table 2].
  • 금속염의 영향: 정제한 효소의 활성에 미치는 금속염의 영향을 조사하기 위하여 다음의 금속염[NaCl, KCl, CaCl2, FeCl3, MgSO4, CuSO4, HgCl2, MnSO4, ZnCl2, AlK(SO4), AgNO3, BaCl2]들을 최종농도가 1 mM과 5 mM이 되도록 각각 첨가하여 50°C에서 30분간 효소를 처리한 후 효소의 활성을 조사하였다.
  • 단백질 분해효소 저해제의 영향: 정제한 효소의 활성에 영향을 주는 여러 가지 저해제의 효과를 조사하기 위하여 다음의 저해제[PMSF; phenylmethanesulfonyl fluoride, SDS; sodiumdodecyl sulfate, EDTA; ethlenediaminetetraacetic acid, EGTA; ethylene glycol-bis-(β-aminoethyl ether) N,N,N',N'-tetra-acetic acid, L-cysteine]들을 최종농도가 1 mM과 5 mM 또는 0.5%가 되도록 각 저해제를 첨가하여 50℃에서 30분간 반응시킨 후 효소의 잔존활성을 조사하였다.
  • 1 M Na2HPO4-NaOH buffer로 각각 pH별로 기질용액을 만들어 최적온도인 50℃에서 30분간 반응시켜 그 활성을 측정하였다. 또한 정제한 효소의 pH 안정성을 조사하기 위하여 위 buffer들을 이용하여 pH 5.0에서 12.0까지 각각의 pH를 조절하여 50℃에서 30분간 처리한 후 최적 pH인 10.0으로 조정한 후에 잔존활성을 조사하였다.
  • 0으로 하여 0℃-80℃까지 각 온도별로 30분간 효소 반응시킨 후 효소활성을 측정하였다. 또한 정제한 효소의 열안정성을 조사하기 위하여 0℃에서 80℃까지 각 온도 별로 30분간 열처리한 후 최적온도인 50℃에서 기질과 반응시켜 그 잔존활성을 조사하였다.
  • 본 연구에서는 충남 서북부 일대의 폐수 및 염전에서 호알칼리성 세균을 분리하던 중, 알칼리 영역의 pH에서 높은 protease 활성을 나타내는 Bacillus 속 균주 HS-54를 분리·동정하였고, HS-54가 생산하는 protease를 분리·정제하고 그 특성을 확인하였다.
  • 분리용 고체배지에 희석된 시료를 도말하여 28°C에서 2일간 배양한 후, 생육이 좋고 단일 집락 주변에 상대적으로 커다란 투명환(clear zone)을 형성하는 균주들을 일차 선별하였다.
  • 알칼리성 protease의 활성은 Yanagida 등(32)의 방법을 변형하여 측정하였다. 기질용액(0.
  • 분리용 고체배지에 희석된 시료를 도말하여 28°C에서 2일간 배양한 후, 생육이 좋고 단일 집락 주변에 상대적으로 커다란 투명환(clear zone)을 형성하는 균주들을 일차 선별하였다. 이들 중 상대적 활성이 강하고 생육정도가 우수한 균주들을 이차 선별하였고, 이차 선별된 균주들의 효소활성을 측정하여 가장 높은 알칼리성 protease를 생성하는 HS-54을 선별하였다.
  • SDS-PAGE는 Laemmli의 방법(23)으로 acrylamide 함량은 10%로 하여 수행하였다. 전기영동 후, coomassie brilliant blue R 250으로 염색하였고, 탈색액(acetic acid 70 ml, methanol 930 ml, DW 1,000 ml)으로 탈색하여 관찰하였다. 분자량 측정을 위한 표준단백질 시료는 Bio-Rad 사의 phosphorylase b (97.
  • 충남 서북부 일대의 축사 폐수 및 염전에서 채취한 시료를 멸균된 증류수로 희석하여 분리용 고체배지에 접종하여 균주를 분리하였다. 호알칼리성이면서 protease를 생산하는 균주를 분리하기 위한 배지는 LB 고체배지를 기본으로 하여 pH를 10.0으로 조정하기 위해 멸균된 Na2CO3 (20%, w/v)를 첨가하였고 protease 생성을 확인하기 위해 1.5% skim milk (w/v)를 첨가한 것을 사용하였다. 알칼리성 protease 생산용 배지는 분리용 배지에서 한천을 제외한 액체배지를 사용하였다.
  • 회수한 침전물은 탈염 후, 20 mM phosphate buffer (pH 7.5)로 용해시키고 미리 평형화한 DEAE-cellulose column (1.5×20 cm)에 주입하여 NaCl 용액(0.05-0.5 M)을 이용한 농도구배법으로 용출한 후 활성성분을 회수하였다.
  • 효소 활성은 이 효소반응물을 30분 동안 실온에서 방치한 뒤 원심분리(4℃, 12,000×g, 15 min)하여 상등액을 취해 UV-spectrophotometer (SPECTRO UV-VIS RS)로 흡광도(A280)를 측정함으로써 결정하였다.
  • 효소의 정제를 위해 HS-54를 대량배양하여 얻은 조효소액을 ammonium sulfate (30-80%)로 분별침전시키고 원심분리하여 침전물을 회수하였다. 회수한 침전물은 탈염 후, 20 mM phosphate buffer (pH 7.
  • 효소의 최적 pH 및 pH 안정성: B. pseudofirmus HS-54의 protease의 최적 활성 pH를 알아보기 위하여 pH (5.0-12.0) 별로 50℃에서 30분간 반응시켜 그 활성을 측정·비교하였다[Fig. 3].
  • 효소의 최적 pH 및 안정성: 정제한 효소의 최적 pH를 조사하기 위하여 pH 5.0-6.0은 0.1 M citric acid-NaOH buffer, pH 7.0-9.0은 0.1 M Tris-HCl buffer, pH 10.0은 0.1 M NaHCO3-NaOH buffer, pH 11.0-12.0은 0.1 M Na2HPO4-NaOH buffer로 각각 pH별로 기질용액을 만들어 최적온도인 50℃에서 30분간 반응시켜 그 활성을 측정하였다. 또한 정제한 효소의 pH 안정성을 조사하기 위하여 위 buffer들을 이용하여 pH 5.
  • 효소의 최적온도 및 열안정성: 정제한 효소의 최적온도를 조사하기 위하여 반응액의 pH를 최적 pH인 10.0으로 하여 0℃-80℃까지 각 온도별로 30분간 효소 반응시킨 후 효소활성을 측정하였다. 또한 정제한 효소의 열안정성을 조사하기 위하여 0℃에서 80℃까지 각 온도 별로 30분간 열처리한 후 최적온도인 50℃에서 기질과 반응시켜 그 잔존활성을 조사하였다.

대상 데이터

  • 전기영동 후, coomassie brilliant blue R 250으로 염색하였고, 탈색액(acetic acid 70 ml, methanol 930 ml, DW 1,000 ml)으로 탈색하여 관찰하였다. 분자량 측정을 위한 표준단백질 시료는 Bio-Rad 사의 phosphorylase b (97.4 kDa), bovine serum albumin (66.2 kDa), ovalbumin (45 kDa), carbonic anhydrase (31 kDa), trypsin inhibitor (21.5 kDa), lysozyme (14.4 kDa)를 사용하였다.
  • 5% skim milk (w/v)를 첨가한 것을 사용하였다. 알칼리성 protease 생산용 배지는 분리용 배지에서 한천을 제외한 액체배지를 사용하였다. 분리용 고체배지에 희석된 시료를 도말하여 28°C에서 2일간 배양한 후, 생육이 좋고 단일 집락 주변에 상대적으로 커다란 투명환(clear zone)을 형성하는 균주들을 일차 선별하였다.
  • 충남 서북부 일대의 축사 폐수 및 염전에서 채취한 시료를 멸균된 증류수로 희석하여 분리용 고체배지에 접종하여 균주를 분리하였다. 호알칼리성이면서 protease를 생산하는 균주를 분리하기 위한 배지는 LB 고체배지를 기본으로 하여 pH를 10.

이론/모형

  • SDS-PAGE는 Laemmli의 방법(23)으로 acrylamide 함량은 10%로 하여 수행하였다. 전기영동 후, coomassie brilliant blue R 250으로 염색하였고, 탈색액(acetic acid 70 ml, methanol 930 ml, DW 1,000 ml)으로 탈색하여 관찰하였다.
  • 단백질의 농도는 Bradford의 방법(5)으로 bovine serum albumin (Bio-Rad)을 표준시료로 하여 측정하였다.
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질의응답

핵심어 질문 논문에서 추출한 답변
미생물의 protease는 어떠한 장점이 있는가? Protease는 동·식물과 세균, 곰팡이 등의 다양한 미생물에서 생산되는데, 동물과 식물에서 유래한 protease는 다양한 산업적 수요를 충당하기에 공급이 제한되어 있다(26). 그러므로 안정성과 생산성, 비용절감 등 경제적인 면이나 공업적 규모의 활용 측면에서 많은 장점이 있는 미생물 유래의 protease를 생산하기 위하여 많은 연구가 진행되고 있다(11, 12, 28).
본 연구에서 충남 서북부 일대의 폐수 및 염전에서 분리한 Bacillus 속 균주 HS-54란 무엇인가? 본 연구에서는 충남 서북부 일대의 폐수 및 염전에서 호알칼리성 세균을 분리하던 중, 알칼리 영역의 pH에서 높은 protease 활성을 나타내는 Bacillus 속 균주 HS-54를 분리·동정하였고, HS-54가 생산하는 protease를 분리·정제하고 그 특성을 확인하였다.
Protease은 어떻게 구분할 수 있는가? 전 세계 효소판매량의 약 60%를 차지하고 있는 protease는 세제산업, 피혁가공, 식품산업 등 각종 산업분야에 널리 응용되고 있다(11, 17, 22). Protease는 활성부위에 존재하는 주요 기능기에 따라 serine protease, aspartic protease, cysteine protease, metallo protease의 4종류로 구분하거나 효소 활성의 최적 pH에 따라 산성 protease, 중성 protease, 알칼리성 protease로 분류하기도 한다. Protease는 동·식물과 세균, 곰팡이 등의 다양한 미생물에서 생산되는데, 동물과 식물에서 유래한 protease는 다양한 산업적 수요를 충당하기에 공급이 제한되어 있다(26).
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