본 연구는 마전자(Strychnos nux-vomica) 추출물의 항산화 활성 및 $\alpha$-glucosidase 저해활성을 측정하였다. 먼저, 마전자를 각각의 용매로 추출하여 페놀 함량을 알아본 결과 100 g당 SNM에서 71.43 mg을 함유하고 있으며, SNE에서는 24.51 mg, SNA에서는 11.17 mg을 함유하고 있었다. DPPH 라디칼 소거능은 SNM, SNE가 1 mg/mL의 농도에서 50% 정도의 활성을 나타내 항산화 효과가 있다는 것을 확인할 수 있었다. 또한 $200\;{\mu}M$$H_2O_2$에 의한 DNA 손상에 대해 마전자 추출물의 보호 효과를 확인할 수 있었다. SNM의 $\alpha$-glucosidase 저해활성 측정 시 SNM 1 mg/mL의 농도에서 12.8%의 억제 활성을 나타내었고, SNM 처리시간을 증가시킬 경우 그 활성도가 유의적으로 증가하는 것을 보였다. 이상의 결과로 마전자 추출물의 항산화 활성 및 SNM의 $\alpha$-glucosidase 억제 활성을 확인할 수 있었다.
본 연구는 마전자(Strychnos nux-vomica) 추출물의 항산화 활성 및 $\alpha$-glucosidase 저해활성을 측정하였다. 먼저, 마전자를 각각의 용매로 추출하여 페놀 함량을 알아본 결과 100 g당 SNM에서 71.43 mg을 함유하고 있으며, SNE에서는 24.51 mg, SNA에서는 11.17 mg을 함유하고 있었다. DPPH 라디칼 소거능은 SNM, SNE가 1 mg/mL의 농도에서 50% 정도의 활성을 나타내 항산화 효과가 있다는 것을 확인할 수 있었다. 또한 $200\;{\mu}M$$H_2O_2$에 의한 DNA 손상에 대해 마전자 추출물의 보호 효과를 확인할 수 있었다. SNM의 $\alpha$-glucosidase 저해활성 측정 시 SNM 1 mg/mL의 농도에서 12.8%의 억제 활성을 나타내었고, SNM 처리시간을 증가시킬 경우 그 활성도가 유의적으로 증가하는 것을 보였다. 이상의 결과로 마전자 추출물의 항산화 활성 및 SNM의 $\alpha$-glucosidase 억제 활성을 확인할 수 있었다.
The physiological activities of Strychnos nux-vomica extracts were investigated through the total phenolic contents (TPC), 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical scavenging activity (RSA), comet assay, and $\alpha$-glucosidase inhibitory activity. S. nux-vomica extracts were prepare...
The physiological activities of Strychnos nux-vomica extracts were investigated through the total phenolic contents (TPC), 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical scavenging activity (RSA), comet assay, and $\alpha$-glucosidase inhibitory activity. S. nux-vomica extracts were prepared with methanol, ethanol, and acetone. The methanol extract showed the highest phenolic content (71 mg/100 g gallic acid equivalents). Pretreatment with S. nux-vomica extracts resulted in significant reductions in oxidative DNA damage at all of the concentrations tested ($1{\sim}50\;{\mu}g/mL$). The $\alpha$-glucosidase inhibitory activity of a methanol extract was 12.8% at the concentration of 1 mg/mL. Therefore, these results indicate that S. nux-vomica might be a noble potential candidate exhibiting antioxidant and $\alpha$-glucosidase inhibitory activity.
The physiological activities of Strychnos nux-vomica extracts were investigated through the total phenolic contents (TPC), 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical scavenging activity (RSA), comet assay, and $\alpha$-glucosidase inhibitory activity. S. nux-vomica extracts were prepared with methanol, ethanol, and acetone. The methanol extract showed the highest phenolic content (71 mg/100 g gallic acid equivalents). Pretreatment with S. nux-vomica extracts resulted in significant reductions in oxidative DNA damage at all of the concentrations tested ($1{\sim}50\;{\mu}g/mL$). The $\alpha$-glucosidase inhibitory activity of a methanol extract was 12.8% at the concentration of 1 mg/mL. Therefore, these results indicate that S. nux-vomica might be a noble potential candidate exhibiting antioxidant and $\alpha$-glucosidase inhibitory activity.
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문제 정의
따라서 본 연구에서는 천연자원으로부터 항산화 활성과 α-glucosidase 저해활성 효과를 가진 천연물을 탐색하기 위한 목적으로 마전자 추출물의 생리활성을 측정하여 그 효능을 밝히고자 하였다.
이들 물질은 phenolic hydroxyl기를 가지고 있기 때문에 단백질 및 기타 거대 분자들과 결합하려는 성질을 가지고 있으므로 항산화 효과 등의 생리활성 기능도 가진다(28). 본 논문에서는 polyphenol성 물질인 gallic acid 를 기준으로 하여 추출물 중의 polyphenol성 물질의 함량을 알아보고자 하였다. 마전자 추출물(SNM, SNE, SNA)의 총 페놀 함량을 측정한 결과, 표준물질인 gallic acid를 기준으로 SNM, SNE 및 SNA에서의 총 페놀 함량은 각각 71.
본 연구는 마전자(Strychnos nux-vomica) 추출물의 항산화 활성 및 α-glucosidase 저해활성을 측정하였다.
가설 설정
1)Means with the same letter among samples are not significantly different (p<0.05).
2)Means with the same letter among samples are not significantly different (p<0.05).
제안 방법
20 μg/ mL 농도의 ethidium bromide로 핵을 염색하여 커버글래스로 덮은 뒤 형광현미경(Leica, Wetzlar, Germany) 상에서 관찰하였다.
3종류의 마전자 추출물(SNM, SNE, SNA)을 각각 1, 5, 10, 50 μg/mL의 농도로 백혈구에 처리하고 37℃에서 30분간 반응시킨 후 백혈구에 산화적 손상을 주기 위해 200 μM의 hydrogen peroxide(H2O2)를 4 ℃에서 5분간 처리한 뒤 PBS로 세척하였다.
20 μg/ mL 농도의 ethidium bromide로 핵을 염색하여 커버글래스로 덮은 뒤 형광현미경(Leica, Wetzlar, Germany) 상에서 관찰하였다. CCD camera(Nikon, Tokyo, Japan)를 통해 보내진 각각의 세포핵 이미지는 comet image analyzing system(Komet 5.0, Kinetic Imaging, Liverpool, UK)이 설치된 컴퓨터 상에서 분석하였다. 백혈구의 H2O2에 의한 DNA 손상 및 각 시료에 의한 손상억제 정도는 핵으로부터 이동해서 꼬리 부분으로 떨어져 나간 꼬리 부분 내 DNA %함량(tail intensity)을 측정하여 나타내었다.
백혈구의 H2O2에 의한 DNA 손상 및 각 시료에 의한 손상억제 정도는 핵으로부터 이동해서 꼬리 부분으로 떨어져 나간 꼬리 부분 내 DNA %함량(tail intensity)을 측정하여 나타내었다. 각각의 처리구에서 2개의 슬라이드를 만들어 각각 100개 세포의 DNA 손상 정도를 측정하고 각 처리구는 최소 3회 반복 실험하였다.
마전자 15 g를 100 mL의 methanol, ethanol 및 acetone 용매에 첨가하여 상온에서 3일간 정치시켜 추출한 다음 여과지(Whatman No.1, Advantec, Tokyo, Japan)를 이용하여 여과를 하였다. 여과된 추출물은 회전감압농축기(EYELA, Tokyo, Japan)를 이용하여 40℃에서 감압농축을 하였으며, methanol 추출물은 SNM, ethanol 추출물은 SNE 그리고 acetone 추출물은 SNA라 명명을 하였다.
0, Kinetic Imaging, Liverpool, UK)이 설치된 컴퓨터 상에서 분석하였다. 백혈구의 H2O2에 의한 DNA 손상 및 각 시료에 의한 손상억제 정도는 핵으로부터 이동해서 꼬리 부분으로 떨어져 나간 꼬리 부분 내 DNA %함량(tail intensity)을 측정하여 나타내었다. 각각의 처리구에서 2개의 슬라이드를 만들어 각각 100개 세포의 DNA 손상 정도를 측정하고 각 처리구는 최소 3회 반복 실험하였다.
Lysis가 끝난 후, 슬라이드를 전기영동 수조에 배열하고 4 oC의 전기영동 buffer(300 mM NaOH, 10 mM Na2EDTA, pH>13)를 채워 20분 동안 unwinding 시켜 DNA의 alkali labile sites가 드러나게 한 후 25 V/300±3 mA의 전압을 걸어 20분간 전기영동을 실시하였다. 빛에 의해 DNA 가 부가적으로 손상되는 것을 방지하기 위해 위의 과정은 전기영동 수조를 어두운 천으로 덮은 채 실시하였다. 전기영동이 끝난 후 0.
1, Advantec, Tokyo, Japan)를 이용하여 여과를 하였다. 여과된 추출물은 회전감압농축기(EYELA, Tokyo, Japan)를 이용하여 40℃에서 감압농축을 하였으며, methanol 추출물은 SNM, ethanol 추출물은 SNE 그리고 acetone 추출물은 SNA라 명명을 하였다. 항산화 활성 및 α-glucosidase 저해활성을 확인하기 위하여 각각의 추출물은 DMSO와 methanol에 녹여 사용하였다.
2 mM DPPH 용액 80 μL를 첨가하여 vortex mixer로 10초 동안 진탕하고 실온에서 10분 방치 후 492 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때라디칼 소거활성은 시료 첨가구와 무첨가구의 흡광도 차이를 백분율(%)로 구하였다.
즉, 마전자 추출물 200 μL에 1 N Folin-Ciocalteau reagent 200 μL를 첨가하여 실온에서 3분간 방치후 10% Na2CO3 200 μL를 첨가하였다.
총 페놀 함량은 Singleton과 Rossi(31)의 방법을 변형하여 측정하였다. 즉, 마전자 추출물 200 μL에 1 N Folin-Ciocalteau reagent 200 μL를 첨가하여 실온에서 3분간 방치후 10% Na2CO3 200 μL를 첨가하였다.
항산화 활성 및 α-glucosidase 저해활성을 확인하기 위하여 각각의 추출물은 DMSO와 methanol에 녹여 사용하였다.
이후 꺼내어 10분 정도 차가운 상태를 유지시켜주고 10μL에 glucose kit 1 mL을 첨가시켜 37oC, 5분 incubation한후 흡광도 405 nm에서 측정하여 그 수치를 이용하였다. 효소 처리 시간에 따른 변화를 알아보기 위하여 위의 방법과 동일하게 하되 enzyme solution과 extracts solution을 처리하는 시간을 5, 10, 20, 40분을 처리하여 실험을 실시하였다.
대상 데이터
(St. Louis, MO, USA)에서 구입을 하였으며, α-glucosidase 저해활성 효과를 확인하기 위해 rat intestinal acetone powder(Sigma Chemical Co.)와 glucose kit(Bio Clinical system, Anyang, Korea)를 사용하였다.
본 실험에서 사용한 마전자(Strychnos nux-vomica)는 2009년 6월 경남 마산시 (주)금강제약으로부터 제공을 받아 실험에 사용하였다. 항산화 효과를 측정하기 위해 사용한 시약으로 Folin-Ciocalteau's phenol, 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl과 comet assay에 사용된 시약인 hydrogen peroxide, Histopaque 1077, low melting point agaroses, normal melting point agarose Triton X-100, disodium salt ethylenediaminetetraacetic acid, Tris-buffer, sodium chloride, sodium hydroxide, ethidium bromide, potassium chloride, potassium phosphate, sodium hydrogen phosphate, sodium Na2CO3 등은 Sigma Chemical Co.
신선한 전혈 5 mL을 Histopaque 1077을 이용해 백혈구만을 분리해 낸 후 본 실험에 사용하였다. 3종류의 마전자 추출물(SNM, SNE, SNA)을 각각 1, 5, 10, 50 μg/mL의 농도로 백혈구에 처리하고 37℃에서 30분간 반응시킨 후 백혈구에 산화적 손상을 주기 위해 200 μM의 hydrogen peroxide(H2O2)를 4 ℃에서 5분간 처리한 뒤 PBS로 세척하였다.
데이터처리
실험을 통하여 얻어진 결과는 SPSS/Windows 14.0(Statistical Package for the Social Sciences, SPSS Inc., Chicago, IL, USA) program을 이용하여 평균±표준편차로 나타내었고, 실험군 간의 평균값의 통계적 유의성은 p<0.05 수준에서 Duncan's multiple range test에 의해 검정하였다.
성능/효과
250 μg/mL, 500 μg/mL, 1000 μg/mL에서 4.3%, 8.5%, 12.8%로 농도 의존적 활성이 보였으며, SNM 처리 시간을5 min, 10 min, 20 min, 40 min로 하였을 때 시간 의존적으로 활성이 증가하는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 2B).
17 mg을 함유하고 있었다. DPPH 라디칼 소거능은 SNM, SNE가 1 mg/mL의 농도에서 50% 정도의 활성을 나타내 항산화 효과가 있다는 것을 확인할 수 있었다. 또한 200 μM H2O2에 의한 DNA 손상에 대해마전자 추출물의 보호 효과를 확인할 수 있었다.
SNM의 αglucosidase 저해활성 측정 시 SNM 1 mg/mL의 농도에서 12.8%의 억제 활성을 나타내었고, SNM 처리시간을 증가시킬 경우 그 활성도가 유의적으로 증가하는 것을 보였다.
건강한 성인의 백혈구에 산화적 스트레스를 유도하는 200 μM H2O2 처리 시 DNA 손상은 유의적으로 증가한 반면, 마전자 추출물 첨가에 의해그 손상은 유의적으로 감소되었다.
또한 200 μM H2O2에 의한 DNA 손상에 대해마전자 추출물의 보호 효과를 확인할 수 있었다.
항산화 효과 측정하는 실험 중 DPPH는 실제 항산화 효과와 연관성이 있으며 α-tocopherol, ascorbic acid, polyhydroxy 방향족 화합물 등의 항산화제에 의해 환원되어 짙은 자색이 노란색으로 탈색되는 정도를 측정하는 것으로, 항산화 물질의 수소공여능으로 알려져 있다(30). 마전자 추출물 SNM, SNE, SNA에 대한 항산화 효과를 DPPH 실험으로 측정한 결과 Table 2와 같이 SNM에서는 농도 1 mg/mL에서 50.06%를 나타내었고, SNE에서는 53.96%를 나타내었으며, SNA에서는 30.01%로 나타났으며, 이는 positive control 로 사용한 vit C의 81.73%보다는 낮은 수준의 항산화 활성을 보였다. 이런 결과는 총 페놀 함량에 포함되어 있는 물질에 의해 SNM에서는 농도에 따라 증가함을 확인하였으나, SNE 에서는 페놀 함량에 비해 높은 DPPH 라디칼 소거능이 증가하는 점은 페놀성 화합물 이외의 에탄올 추출물에 함유되어 있는 성분이 DPPH 라디칼을 소거시키는 것으로 생각된다.
본 논문에서는 polyphenol성 물질인 gallic acid 를 기준으로 하여 추출물 중의 polyphenol성 물질의 함량을 알아보고자 하였다. 마전자 추출물(SNM, SNE, SNA)의 총 페놀 함량을 측정한 결과, 표준물질인 gallic acid를 기준으로 SNM, SNE 및 SNA에서의 총 페놀 함량은 각각 71.43, 24.51 및 11.17 mg/100 g이었다. 이상의 결과는 마전자 100 g당 추출물 속에서 함유하고 있는 polyphenol 성분의 양을 나타낸 것으로 SNM에서 페놀 함량이 가장 높은 것을 확인할 수 있었다(Table 1).
마전자 추출물에 따른 DNA 손상 억제정도 비교 시 50 μg/mL에서 메탄올이 48.7%로 가장 높았고, 에탄올 40.0%, 아세톤 35.0% 순서로 총 페놀 함량의 결과와 일치하는 것으로 나타났는데, 이는 Park 등 (35)의 결과에서도 가공방법에 따른 마늘의 페놀함량이 높을수록 H2O2 유도 DNA 손상 억제 정도가 높아졌음을 확인할 수 있었다.
본 연구는 마전자(Strychnos nux-vomica) 추출물의 항산화 활성 및 α-glucosidase 저해활성을 측정하였다. 먼저, 마전자를 각각의 용매로 추출하여 페놀 함량을 알아본 결과 100 g당 SNM에서 71.43 mg을 함유하고 있으며, SNE에서는 24.51 mg, SNA에서는 11.17 mg을 함유하고 있었다. DPPH 라디칼 소거능은 SNM, SNE가 1 mg/mL의 농도에서 50% 정도의 활성을 나타내 항산화 효과가 있다는 것을 확인할 수 있었다.
73%보다는 낮은 수준의 항산화 활성을 보였다. 이런 결과는 총 페놀 함량에 포함되어 있는 물질에 의해 SNM에서는 농도에 따라 증가함을 확인하였으나, SNE 에서는 페놀 함량에 비해 높은 DPPH 라디칼 소거능이 증가하는 점은 페놀성 화합물 이외의 에탄올 추출물에 함유되어 있는 성분이 DPPH 라디칼을 소거시키는 것으로 생각된다. 이 점은 추후 분리정제를 통하여 단일물질로 분리한 후 작용하는 화합물의 구조를 확인할 수 있을 것으로 생각된다.
17 mg/100 g이었다. 이상의 결과는 마전자 100 g당 추출물 속에서 함유하고 있는 polyphenol 성분의 양을 나타낸 것으로 SNM에서 페놀 함량이 가장 높은 것을 확인할 수 있었다(Table 1). Xu 등(29)은 토후박 추출물 CH2Cl2 분획의 총 페놀함량은 57.
8%의 억제 활성을 나타내었고, SNM 처리시간을 증가시킬 경우 그 활성도가 유의적으로 증가하는 것을 보였다. 이상의 결과로 마전자 추출물의 항산화 활성 및 SNM의 α-glucosidase 억제 활성을 확인할 수 있었다.
이상의 결과로부터 SNM은 positive control로 시중에 시판되고 있는 제약제품으로 α-glucosidase 억제제인 acarbose와 비교하면 α-glucosidase의 저해활성이 낮은 것으로 보이지만, SNM이 추출물인 점을 감안한다면 충분히 α-glucosidase 저해를 통해 당뇨병 치료제로써의 가능성을 확인시켜 주었다.
후속연구
이런 결과는 총 페놀 함량에 포함되어 있는 물질에 의해 SNM에서는 농도에 따라 증가함을 확인하였으나, SNE 에서는 페놀 함량에 비해 높은 DPPH 라디칼 소거능이 증가하는 점은 페놀성 화합물 이외의 에탄올 추출물에 함유되어 있는 성분이 DPPH 라디칼을 소거시키는 것으로 생각된다. 이 점은 추후 분리정제를 통하여 단일물질로 분리한 후 작용하는 화합물의 구조를 확인할 수 있을 것으로 생각된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
마전자의 생리활성 기능은?
마전자(Strychnos nux-vomica)는 마전과에 속하는 상록교목인 마전나무 과실의 종자로 과육 속에 있는 3～5개의 씨가 한약재로 사용되고 있으며, 냄새는 거의 없고, 맛은 매우 쓰며(22), 인도, 미얀마, 베트남, 태국, 스리랑카, 오스트레일리아의 북구, 중국의 운남 지방 등에서 주로 생산되고 있다(23). Brusine과 strychnine 등의 성분을 함유한 마전자의 생리활성에 관한 보고는 항암 효과, 진통 효과, 항알레르기 효과, 중추신경계 및 소화계통에 대한 작용 등이 있지만(24-27), 항산화 활성과 항당뇨 효과에 관한 보고는 되어 있지 않다.
마전자란?
마전자(Strychnos nux-vomica)는 마전과에 속하는 상록교목인 마전나무 과실의 종자로 과육 속에 있는 3～5개의 씨가 한약재로 사용되고 있으며, 냄새는 거의 없고, 맛은 매우 쓰며(22), 인도, 미얀마, 베트남, 태국, 스리랑카, 오스트레일리아의 북구, 중국의 운남 지방 등에서 주로 생산되고 있다(23). Brusine과 strychnine 등의 성분을 함유한 마전자의 생리활성에 관한 보고는 항암 효과, 진통 효과, 항알레르기 효과, 중추신경계 및 소화계통에 대한 작용 등이 있지만(24-27), 항산화 활성과 항당뇨 효과에 관한 보고는 되어 있지 않다.
α-glucosidase 저해제의 종류는?
당뇨병의 치료제 개발을 위한 여러 기전 중 하나인 α-glucosidase 저해제는 소장에 존재하는 이당류의 소화 효소인 α-glucosidase를 억제하여 이당류가 단당류로 분해되는 것을 막아 소장 융털에서의 흡수를 지연시켜 식후 혈당의 급격한 증가를 막아주어 약화된 췌장에서 분비되는 인슐린만으로도 혈당 조절을 가능하게 하는 기전을 이용하는 치료제이다 (15). 이러한 치료제의 종류로는 acarbose, voglibose, miglitol이 있으며, 그 외로도 천연물 유래의 추출물 등이 보고되어 있다(16-18). 그러나 α-glucosidase 저해제 또한 부작용이 존재하며, 효소의 활성을 저해하여 분해되지 않은 이당류가 대장으로 넘어가 대장에 존재하는 박테리아로 인해 분해되어 가스, 설사, 변비 등 배설에 관련된 질환을 야기할수 있다(19,20).
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