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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 헛개나무 열매 열수추출물이 streptozotocin으로 유발된 당뇨병 이환 흰쥐에서 간의 항산화작용에 미치는 영향을 알아보고자 본 실험을 실시하였다.
제안 방법
- 이 반응액에 효소원 10 µl를 가하여 3 ml가 되게 하고 25℃, 240 nm에서 5분간 흡광도를 측정하였다. H2O2의 흡광도 변화와 H2O2의 mol 흡광도계수로 H2O2의 농도를 구해 효소활성도를 계산하였다.
- 이어서 상층액을 다시 325,000 rpm에서 1시간 동안 초원심분리(Beckman Optima TLX-120®, USA)하여 세포질 분획을 분리하였다. Mitochondria 분획은 0.25 M sucrose 용액에 현탁시킨 다음 다시 원심분리(13,000 rpm, 20 min, 4℃)시켜 얻은 침전물을 취하고 소량의 0.25 M sucrose 용액에 재현탁시켜 catalase 활성측정에 사용하였고, 세포질 분획은 SOD와 GSH-Px 활성도 측정에 이용하였다(Fig 1).
- 당뇨유발은 12시간 절식 후 STZ 60 mg/kg을 1회 복강투여 하였으며, 정상대조군(NC 군)은 동량의 증류수를 투여하였다. STZ 투여 12시간 경과 후 각각의 약물을 존데를 이용하여 1회 경구투여 하였으며, 전 실험기간 동안 사료와 물은 자유급식 시켰다.
- 내림대동맥에서 채혈한 혈액을 3,000 rpm에서 20분간 원심분리(Hanil micro-12, Korea) 후 혈청을 획득하여 자동혈청화학분석기(SpotchemTM SP-4110, 교토 다이이치. 일본)로 total cholesterol 및 glucose 함량을 측정하였다. Lipase는 서울임상병리검사센터 (대구시)에 의뢰하여 검사하였다.
- 실험동물은 일주일 간 적응사육을 시킨 후 증류수만을 투여한 정상대조군, 당뇨유발 후 증류수만을 투여한 당뇨유발군 (DC 군), 당뇨유발 후 헛개나무열매 열수추출물을 투여한 헛개나무 물추출물 투여군(HDT 군), 당뇨유발 후 glibenclamide를 투여한 대조약물 투여군(GLI군)으로 각각 16두씩 3군으로 나누었다. 당뇨유발은 12시간 절식 후 STZ 60 mg/kg을 1회 복강투여 하였으며, 정상대조군(NC 군)은 동량의 증류수를 투여하였다. STZ 투여 12시간 경과 후 각각의 약물을 존데를 이용하여 1회 경구투여 하였으며, 전 실험기간 동안 사료와 물은 자유급식 시켰다.
- 본 실험은 당뇨병성 rat에 미치는 헛개나무 열매의 항산화적 영향을 알아보고자 STZ투여로 유발된 당뇨쥐에서 각각 헛개나무 열매 열수추출물과 당뇨치료제인 glibenclamide를 투여하여 혈중 glucose, total cholesterol, lipase 함량 변화와 간조직에서 유리라디칼 제거효소인 항산화계 효소의 활성변화를 관찰하였다.
- 실험동물은 일주일 간 적응사육을 시킨 후 증류수만을 투여한 정상대조군, 당뇨유발 후 증류수만을 투여한 당뇨유발군 (DC 군), 당뇨유발 후 헛개나무열매 열수추출물을 투여한 헛개나무 물추출물 투여군(HDT 군), 당뇨유발 후 glibenclamide를 투여한 대조약물 투여군(GLI군)으로 각각 16두씩 3군으로 나누었다. 당뇨유발은 12시간 절식 후 STZ 60 mg/kg을 1회 복강투여 하였으며, 정상대조군(NC 군)은 동량의 증류수를 투여하였다.
- 실험동물은 채혈 전 12시간 동안 금식 후 ether로 마취하여 복부를 절개 후 내림대동맥에서 채혈하고 간을 적출한 다음 적출한 간은 phosphate buffered saline (PBS)로 장기표면의 혈액을 씻은 후 여지로 남아 있는 PBS를 제거한 다음−70℃에 냉동보관 후 항산화 활성검사에 이용하였다.
- 1 ml을 가하여 25℃에서 5분간 반응시킨 후 1 N HCl 50 µl를 가하여 반응을 종결시키고 420 nm에서 흡광도를 측정하였다. 효소 활성의 단위는 효소원을 넣지 않고 반응시킨 15 mM pyrogallol 용액의 자동산화를 50% 억제하는 단백질 양으로 정하였으며, 활성도 단위는 pyrogallol의 자동산화를 억제하는데 필요한 세포질 단백질에 대한 SOD unit로 하였다.
대상 데이터
- Streptozotocine (STZ)은 Sigma사로부터 구입하였으며, glibenclamide (GLI, Euglucon®tab)는 종근당 제약회사 제품을 기타 시약과 용매는 1급 또는 특급시약을 사용하였다.
- 대구시내의 한약재 상사에서 음건한 헛개나무 열매를 구입하여 분쇄한 후 분쇄물 100 g에 증류수 1L의 비율로 가하여 항온수조(140 rpm, 37℃, 4시간)에서 진탕하였다. 이를 저온 원심분리기(3000 rpm, 4℃, 20분간)에서 원심분리한 후 여과한 상층액을 회전진공농축기로 농축, 동결건조하여 냉동보관하였다.
- 실험동물로서 생후 6주령의 평균체중 200 g인 SpragueDawley계 수컷 rat 80마리 (오리엔트, 한국)를 1주일간 환경 적응 (온도: 21 ± 2℃, 습도: 60 ± 5%, 채광: 12-12 명암조명)을 시켰으며 물과 사료는 자유급식 하였다.
데이터처리
- 통계분석은 Mann-Whitney U-Wilcoxon Rank Sum W test (MW test; SPSS for windows, Release 6.1.3, SPSS inc., USA) 로서 유의성을 검증하였다.
이론/모형
- Catalase 활성도는 Aebi 방법(2)으로 측정하였다. 50 mM potassium phosphate buffer (pH 7.
- GSH-Px 활성도 측정은 Paglia의 방법(42)에 따라 산화형 glutathione (GSSG)이 glutathione reductase (GR)와 NADPH 에 의하여 환원될 때 NADPH의 흡광도가 340 nm에서 감소하는 정도를 측정하였다. 즉, 0.
- SOD 활성도는 알칼리 상태에서 pyrogallol의 자동산화에 의한 발색을 이용한 Marklund 방법(37)으로 측정하였다. 즉, 10 mM EDTA를 포함한 50 mM Tris HCl buffer (pH 8.
- 간 조직내의 mitochondria와 cytosol 분획의 단백질 함량은 bovine serum albumin (BSA)을 표준물질로 하여 Bradford 방법(10)에 의해 정량하였다.
성능/효과
- STZ 투여 1일째 GLI군이 NC군의 80 mg/dl에 비하여 62 mg/dl로 유의한(P < 0.05) 감소를 나타내었으며, 3일째에는 HDT군이 DC군 68 mg/dl에 비하여 55 mg/dl로서 유의한(P < 0.05) 감소를 나타내었다(Table 1).
- STZ 투여 1일째 NC군의 13.0 U/L에 비하여 DC군, GLI 군, HDT군이 각각 20.8, 22.0, 18.5 U/L 증가하였으며, 2일에는 18.0, 21.7, 21.0 U/L, 3일에는 19.0, 13.0, 20.4 U/L, 5일에는 18.9, 17.0, 14.5 U/L를 나타내었으나 유의성은 나타나지 않았다(Table 1).
- STZ 투여 후 2일째 HDT군이 1.0230 nmol/min/mg protein 으로 DC군 1.3448 nmol/min/mg protein에 비하여 유의한 (P < 0.0.5) 감소를 나타내었으나, 이후 5일째 NC군이 1.2233 nmol/min/mg protein에 비하여 GLI군은 2.7257 nmol/min/ mg protein, HDT군은 2.4387 nmol/min/mg protein으로 유의한(P < 0.05) 증가를 나타내었다(Fig 3).
- STZ 투여 후 2일째 NC군 128 mg/dl 비하여 DC군이 350 mg/dl로 유의한(P < 0.05) 증가를 나타내었다.
- STZ 투여 후 3일째 GLI군과 HDT군에서 NC군 1.1710µmol/min/mg protein에 비하여 각각 1.4745, 1.3442 µmol/ min/mg protein의 유의한(P < 0.05) 증가를 보였고, 실험 5일째부터 NC군 1.1825 µmol/min/mg protein 에 비하여 각각 1.8982, 1.9262 µmol/min/mg protein DC군 1.2294 µmol/min/ mg protein에 비하여 54.41 %, 56.68 %의 유의한(P < 0.05) 증가를 나타내었다(Fig 4).
- 실험결과 GSH-Px 함량은 SOD와 마찬가지로 STZ 투여 후 2일째 glucose 함량이 1일에 비하여 증가된 점에 비례하여 DC군에서는 증가를 나타낸 반면 GLI군 및 HDT군은 감소를 나타내었다. 그러나 전체적으로 glucose의 증가에 비례하여 증가되는 경향을 나타내었으며, 특히 투여 후 5일에는 NC군 1.2233 nmol/min/mg protein에 비하여 GLI군이 2.7257 nmol/min/mg protein, HDT군이 2.4387 nmol/min/ mg protein 으로 유의한 증가를 나타내었다.
- 그러나 투여 2일째를 제외한전 기간 중 glucose의 증가에 따라 NC군, DC군의 SOD 활성은 변화가 거의 없었으나 투여 3일에 GLI군과 HDT군의 SOD활성이 NC군에 비하여 1.4745, 1.3433 unit/mg protein 으로 유의한(P < 0.05) 증가를 나타내기 시작하여 투여 5일에 각각 NC군 1.1825 unit/mg protein 에 비하여 1.8982, 1.9262 unit/mg protein으로 유의한(P < 0.05) 증가를, DC군 1.2294 unit/mg protein에 비하여 유의한(P < 0.05) 증가를 나타내었다.
- Van Tol(46), Bar-on 등(5)은 당뇨쥐에서 당뇨가 진행될수록 혈중 very low density lipoprotein 제거율이 감소되어 혈중 중성지질이 증가된다고 하였으며, Bayda 등(7)은 STZ 유발당뇨에서 혈장 total cholesterol, triglycerides 및 low density lipoprotein 수치가 현저하게 증가한다고 하였다. 본 실험 결과 2일, 3일에 NC군에 비하여 DC군의 total cholesterol 수치가 증가된 점으로 미루어 지금까지의 보고와 일치하는 결과라 사료되며, DC군에 비하여 GLI군이 1일부터 3일까지는 낮은 수치를 기록하였으나 5일부터는 높은 수치를 나타내었다. 이에 비해 HDT군은 실험기간 동안 DC군에 비하여 낮은 경향을 나타낸바, 이러한 결과는 Baynes(8), West(48)가 보고한 당뇨병성 쥐에서의 total cholesterol 증가 경향과 일치하는 결과이지만 이러한 경향이 정상범위 내에서의 변화로 유의성은 인정되지 않았다.
- 본 실험 결과 STZ 투여 후 2일째는 DC군의 glucose 함량의 증가와 함께 catalase는 증가를 나타낸 반면 GLI군 및 HDT군에서는 catalase의 감소를 나타내었다. 그러나 SOD, GSH-Px와 유사하게 catalase 활성치는 전반적으로 증가경향을 나타내었다.
- 본 실험 결과 STZ투여 2일째에 glucose 함량이 STZ 투여 1일째에 비하여 증가를 나타내었으나, SOD 활성은 투여 1일째에 비하여 DC군에서 증가를 나타낸 반면 GLI군 및 HDT 군은 감소를 나타내었다. 그러나 투여 2일째를 제외한전 기간 중 glucose의 증가에 따라 NC군, DC군의 SOD 활성은 변화가 거의 없었으나 투여 3일에 GLI군과 HDT군의 SOD활성이 NC군에 비하여 1.
- 혈액내 Lipase 활성은 glucocorticoids 치료 및 여러 종류의 암 및 간담즙성 질병과 관련되어 활성화가 증가될 수 있고 (43), lipoprotein lipase는 triacylglycerol이 풍부한 lipoproteins 의 제거비율을 결정하는 내피에 있는 효소로 알려져 있다(44). 본 실험에서는 STZ 투여 1일째 NC군 13.0 U/L에 비하여 DC군, GLI군, HDT군이 각각 20.8, 22.0, 18.5 U/L 증가하였으며, 2일에는 18.0, 21.7, 21.0 U/L, 3일에는 19.0, 13.0, 20.4 U/L, 5일에는 18.9, 17.0, 14.5 U/L를 나타내었으나 유의성은 나타나지 않았으며, 모든 군에서 NC군에 비하여 증가하였다. 이러한 결과는 Aughsteen 등(3)이 보고한 STZ로 당뇨를 유발한 rat의 lipase가 증가한다는 보고와 일치하는 결과로 사료된다.
- 본 실험에서는 streptozotocin 투여 후 1일째부터 glucose의 수치가 현저하게 증가하기 시작하여 실험 종료일까지 glucose의 수치가 현저하게 증가한 바, 이러한 경향은 Bayda 등(6)이 hyperglycemia 동안 조직에서는 산소 유리라디칼의 형성이 증가된다고 한 보고와 Montilla 등(40)이 STZ 유발 당뇨모델 rat에서의 glycemia, glycosylated hemoglobin, cholesterol, Triglyceride 그리고 lipoperoxide 수치가 현저하게 증가한다는 보고와 일치하는 결과로 STZ에 의한 당뇨유발이 되었다는 것을 알 수 있었으며, 또한 glucose의 대사로 인한 유리라디칼의 증가도 나타난 것으로 추측할 수 있다. 실험 5일에는 HDT군이 DC군 및 GLI군에 비하여 증가율이 둔화된 점은 당뇨로 인한 체내 합병증 발생의 위험성이 DC군이나 GLI군에 비하여 낮을 것으로 사료되며, 또한 정상 상태에서 보다 유리라디칼의 위험성은 증가하겠으나 DC군이나 GLI군에 비하여 glucose의 자동산화증가나 항산화제의 활동 감소는 적을 것이라 사료되어 헛개나무에 혈당을 감소시키는 성분이 함유되었을 것이라 추측된다.
- 실험결과 GSH-Px 함량은 SOD와 마찬가지로 STZ 투여 후 2일째 glucose 함량이 1일에 비하여 증가된 점에 비례하여 DC군에서는 증가를 나타낸 반면 GLI군 및 HDT군은 감소를 나타내었다. 그러나 전체적으로 glucose의 증가에 비례하여 증가되는 경향을 나타내었으며, 특히 투여 후 5일에는 NC군 1.
- 05) 증가를 나타내었다. 이러한 결과는 당뇨병에서 산화적 스트레스를 일으키는 여러 종류의 원인(11,30,52) 중 내재성 항산화제의 감소를 배제시킬 수 있었으며, 또한 glucose의 자동산화가 증가 됨으로써 유리라디칼 산생이 증가되어 세포손상의 유발을 예방할 수 있는 내재성 항산화제인 SOD의 기능을 증강시키는 성분이 헛개나무에 함유되어 있음을 나타내는 것이라 하겠다.
후속연구
- 따라서 본 실험 결과 glucose 함량의 증가에 따라 내재성 항산화제인 SOD, GSH-Px, catalase가 증가하는 점으로 미루어 헛개나무 추출물에는 체내의 유리라디칼을 제거하여 당뇨의 합병증을 예방하고 세포손상을 예방하는 항산화 효소활성을 증강시키는 성분이 함유된 것으로 확인되었으나 그 정확한 물질에 관하여서는 앞으로 지속적인 연구가 필요한 것으로 사료된다.
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