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문제 정의
- 이에 본 연구에서는 최근 제기되고 있는 한방처방의 오남용으로 인한 독성과 안전성 문제에 대한 자료를 확보하기 위하여 식품의약품안전청 고시 제 2005-60호 의약품등의 독성시험방법의 “비임상시험 관리기준”(2005년 10월 25일)에 따라 암·수 ICR 마우스를 이용하여 귀비탕에 대한 단회투여독성을 실험적으로 평가하고자 하였다.
- 하지만 귀비탕의 효능에 대한 실험적 연구는 다양하게 이루어 졌으나, 그 안전성에 연구는 전무한 실정으로, 본 연구에서는 귀비탕의 안전성에 대한 자료를 마련하기 위하여 “의약품등의 독성시험기준(식품의약품안전청고시 제 2005-60호, 2005. 10.21)”에 의거하여 ICR 마우스에 대한단회투여 급성독성실험을 실시하였다.
- 본 연구에서는 귀비탕의 급성독성을 실험적으로 평가하고자 ICR 마우스에 시험물질을 투여한 후 임상증상 및 부검 소견, 치사율과 체중변화 등의 관찰 및 혈액학적검사를 실시한 결과 다음과 같은 결론을 얻었다.
제안 방법
- 5주령 마우스에 대한 단회투여 경구독성을 평가하기 위하여 귀비탕의 투여 용량은 경구투여 한계용량 5000 ㎎/㎏을 기준으로 하여 공비 0.5로 각각 3개 군을 설정하였으며, 대조군을 포함하여 암·수 ICR 마우스를 각각 4개의 용량군으로 나누었다.
- 5로 각각 3개 군을 설정하였으며, 대조군을 포함하여 암·수 ICR 마우스를 각각 4개의 용량군으로 나누었다. 투여 경로는 한방 임상에서 가장 널리 이용되고 있는 경구투여법을 이용하였으며, 각 용량군의 한약재는 투여 직전에 멸균생리식염수에 희석하여 실험에 공시하였다. 실험물질에 의한 독성을 평가하기 위하여 실험물질 투여 전 동물을 하룻밤 절식시켰으며, 경구투여용 일회용 존데와 주사관을 이용하여 배부 피부 고정법으로 몸체를 고정한 후 경구 투여 하였다.
- 투여 경로는 한방 임상에서 가장 널리 이용되고 있는 경구투여법을 이용하였으며, 각 용량군의 한약재는 투여 직전에 멸균생리식염수에 희석하여 실험에 공시하였다. 실험물질에 의한 독성을 평가하기 위하여 실험물질 투여 전 동물을 하룻밤 절식시켰으며, 경구투여용 일회용 존데와 주사관을 이용하여 배부 피부 고정법으로 몸체를 고정한 후 경구 투여 하였다.
- 임상 증상은 투여 직후부터 6시간 동안 매시간 관찰하였으며, 그 후 14일(1일 1회) 동안 일반증상 관찰법에 의하여 동물의 행동, 자극에 대한 반응성, 각성도 및 경계성, 자세 및 보행이상 등에 대한 일반 증상을 관찰하였으며21), 모든 동물에 대하여 투여 전과 투여 후 1, 3, 7, 14일에 체중변화를 측정하였다. 실험 동물을 희생하기 전날 밤 18시간 절식시킨 후 다음날 아침 Zoletil 50(Virbac S.
- , 모든 동물에 대하여 투여 전과 투여 후 1, 3, 7, 14일에 체중변화를 측정하였다. 실험 동물을 희생하기 전날 밤 18시간 절식시킨 후 다음날 아침 Zoletil 50(Virbac S.A, France)과 Xylazine hydrochloride(바이엘 코리아 주식회사, 경기도)을 복강 내 주사하여 마취시킨 후 개복하여 혈액을 채취하였다. 혈액 채취 및 방혈 후, 주요 내부 장기의 병변을 육안적으로 관찰하였고, 간, 심장, 신장, 폐, 비장을 적출하여 생리식염수로 3회 이상 헹군 후 수분을 제거하고 무게를 측정하였다.
- A, France)과 Xylazine hydrochloride(바이엘 코리아 주식회사, 경기도)을 복강 내 주사하여 마취시킨 후 개복하여 혈액을 채취하였다. 혈액 채취 및 방혈 후, 주요 내부 장기의 병변을 육안적으로 관찰하였고, 간, 심장, 신장, 폐, 비장을 적출하여 생리식염수로 3회 이상 헹군 후 수분을 제거하고 무게를 측정하였다.
- 혈액학적 검사는 WBC(white blood cell), RBC(red blood cell), HGB(hemoglobin), HCT(hematocrit), MCHC(Mean Corpuscular Hemoglobin Concentration), MCH(Mean Corpuscular Hemoglobin), MCV(Mean Corpuscular Volume), PLT(platelet)를 혈구분석기 Coulter counter(Coulter Co., Miami, FL, U.S.A)를 이용하여 측정하였다.
- 21)”에 의거하여 ICR 마우스에 대한단회투여 급성독성실험을 실시하였다. 투여경로는 귀비탕의 임상적용 경로를 고려하여 경구로 단회 투여를 실시하였으며, 투여용량은 단회 경구투여 최고용량인 5000 ㎎/㎏을 고농도로 설정하였고, 공비 0.5로 2500, 1250 ㎎/㎏의 용량을 추가로 설정하였다. 즉, 귀비탕 열수추출물은 암·수 ICR 마우스에 0(control), 1250, 2500, 5000 ㎎/㎏ 용량으로 각각 단회 경구투여 하였고, 이후 14일 간 사망율, 체중, 임상증상을 관찰하였으며, 실험 종료 시 혈액채취 후 부검하여 내부 장기의 이상 병변 유무에 대한 육안적 소견을 관찰하였다.
- 즉, 귀비탕 열수추출물은 암·수 ICR 마우스에 0(control), 1250, 2500, 5000 ㎎/㎏ 용량으로 각각 단회 경구투여 하였고, 이후 14일 간 사망율, 체중, 임상증상을 관찰하였으며, 실험 종료 시 혈액채취 후 부검하여 내부 장기의 이상 병변 유무에 대한 육안적 소견을 관찰하였다.
대상 데이터
- 본 실험에서 사용한 귀비탕의 처방구성과 원산지 및 구입처는 Table 1, 2와 같다. 처방구성에 따른 각 한약재들은 중량의 10배에 달하는 생수(화이트, 경남 산청군 삼장면 덕교리 800)에 1시간 동안 침적시킨 다음 180분 동안 전탕추출법(한국, 경서추출기 cosmos-660)에 의한 시험물질 추출을 실시하였으며, 추출한 시험물질은 동결건조기(한국, 일신 FD5512)를 사용하여 분말 형태로 조제하여 실험에 이용하였다(수율 : 22.35%).
- 실험구역은 한국한의학연구원 동물실험실에서 실시하였으며, 암·수 ICR 마우스(나라바이오텍, 서울특별시 강남구 청담동 71-22 나라B/D) 5주령을 실험에 사용하였다.
- 순화 기간 중, 일반 임상증상을 관찰하여 건강한 동물을 암⋅수 20 마리씩 선정하여 체중범위에 따른 무작위법에 의하여 군 분리를 실시한 후, 본 실험에 사용하였다.
- 실험구역은 한국한의학연구원 동물실험실에서 실시하였으며, 암·수 ICR 마우스(나라바이오텍, 서울특별시 강남구 청담동 71-22 나라B/D) 5주령을 실험에 사용하였다. 동물입수 시, 외관을 육안으로 검사한 후, 동물실에서 순화시키고 그 중 건강한 동물을 골라 실험에 사용하였다. 순화 기간 중, 일반 임상증상을 관찰하여 건강한 동물을 암⋅수 20 마리씩 선정하여 체중범위에 따른 무작위법에 의하여 군 분리를 실시한 후, 본 실험에 사용하였다.
데이터처리
- 실험결과는 SPSS package program (version 12.0)을 이용하여 평균과 표준편차를 구하였으며 실험군간의 차이의 유의성은 one-way ANOVA(analysis of variance)와 Dunnet test에 의하여 p <0.05 수준에서 검증하였다.
성능/효과
- 본 실험은 실험동물윤리위원회의 심의를 거쳤으며, 순화 및 실험기간 동안의 사육환경은 온도 23±3℃, 상대습도 50±10%, 환기횟수는 시간당 12～16회, 조명은 12시간 명암주기(점등 7:00, 소등 19:00), 조도는 150～300 Lx로 조정하여 일정한 사육환경 조건을 유지하였다.
- 1250, 2500, 5000 ㎎/㎏ 용량의 귀비탕 추출물을 경구로 단회 투여한 시험물질 투여군과 멸균생리식염수를 단회 경구투여한 대조군의 암·수 ICR 마우스를 14일 동안 관찰한 결과 사망동물은 관찰 되지 않았다.
- 따라서 본 실험의 경우 한계용량(5000 ㎎/㎏/day)까지 경구 투여하여도 사망을 관찰할 수 없어 LD50 값은 산출되지 않았다.
- 1과 같다. 실험 물질 투여 후 1250, 2500, 5000 ㎎/㎏ 용량의 귀비탕 투여군과 대조군 모두 개시체중에 비하여 체중이 증가하였으며, 체중 증가량은 통계적으로 유의한 차이가 나지 않았다. 또한 투여 전(0day), 투여 후 1, 3, 7, 14일 모두 시험물질에 의한 유의한 체중 감소 및 증가는 관찰할 수 없었다.
- 실험 물질 투여 후 1250, 2500, 5000 ㎎/㎏ 용량의 귀비탕 투여군과 대조군 모두 개시체중에 비하여 체중이 증가하였으며, 체중 증가량은 통계적으로 유의한 차이가 나지 않았다. 또한 투여 전(0day), 투여 후 1, 3, 7, 14일 모두 시험물질에 의한 유의한 체중 감소 및 증가는 관찰할 수 없었다.
- 실험 종료 시, 모든 실험동물을 부검하여 주요 내부 장기의 육안적 소견을 관찰한 결과 1250, 2500, 5000 ㎎/㎏ 용량의 귀비탕 추출물 투여군과 대조군 모두에서 심장, 폐, 흉선, 간, 신장, 부신, 비장, 위, 대장 맹장 등의 주요 내부 장기에 대한 외관상의 어떠한 이상 병변도 발견되지 않았다.
- 1250㎎/㎏ 농도의 귀비탕을 투여한 수컷의 비장, 암컷의 간에서 정상대조군과 비교하여 감소가 관찰되었으나, 이것은 암수 모두에게 공통으로 나타난 것이 아니며, 고용량에서 감소가 관찰되지 않아 용량 의존성이 인정되지 않아, 귀비탕의 독성으로 인한 결과로 보기 어렵다. 또한 그외의의 간, 신장, 심장, 폐 모두에서 정상대조군과 비교하여 유의한 차이가 나타나지 않았다.
- 시험물질 단회 투여 14일 후, 혈액학적 검사를 실시한 결과는 Table 6과 같다. WBC, RBC, HGB, HCT, MCHC, MCH, MCV, PLT을 검사한 결과 정상대조군과 비교하여 1250 ㎎/㎏ 용량의 귀비탕을 투여한 수컷의 PLT, 암컷의 WBC 수치가 감소됨을 관찰하였다. 하지만 이는 암수 공통으로 나타난 것이 아니며, 고용량에서 감소가 관찰되지 않아 용량 의존성이 인정되지 않으며, 이외 다른 수치들은 정상대조군과 비교하여 유의한 차이가 나타나지 않았다.
- 그 결과 0, 1250, 2500, 5000 ㎎/㎏ 용량으로 투여한 모든 암·수 ICR 마우스에 대하여 사망이 관찰되지 않았고, 이로 인하여 LD50은 산출 할 수 없었다.
- 그 결과 0, 1250, 2500, 5000 ㎎/㎏ 용량으로 투여한 모든 암·수 ICR 마우스에 대하여 사망이 관찰되지 않았고, 이로 인하여 LD50은 산출 할 수 없었다. 또한 시험기간 동안 각 농도의 귀비탕 추출물을 투여한 시험물질 투여군과 대조군에서 경구 투여 후 1, 3, 7, 14일의 체중에서 유의한 차이가 나타나지 않았고, 전 시험기간 동안 특이한 임상증상이 나타나지 않았으며, 부검소견에서도 내부 장기에 대한 어떠한 육안적 이상병변도 관찰되지 않았다. 주요 혈액학적 검사 및 장기 무게 측정 결과, 1250㎎/㎏ 용량의 귀비탕을 투여한 수컷에서 비장 무게와 PLT 수치의 감소가 관찰되 었고, 암컷의 간 무게와 WBC 수치의 감소가 관찰되었으나, 고용량에서 감소가 관찰되지 않는 등, 용량 의존적으로 유의한 차이가 나지 않았을 뿐 아니라 육안적병변소견 또한 발견되지 않아, 독성 증상으로 간주하기 어렵다.
- 또한 시험기간 동안 각 농도의 귀비탕 추출물을 투여한 시험물질 투여군과 대조군에서 경구 투여 후 1, 3, 7, 14일의 체중에서 유의한 차이가 나타나지 않았고, 전 시험기간 동안 특이한 임상증상이 나타나지 않았으며, 부검소견에서도 내부 장기에 대한 어떠한 육안적 이상병변도 관찰되지 않았다. 주요 혈액학적 검사 및 장기 무게 측정 결과, 1250㎎/㎏ 용량의 귀비탕을 투여한 수컷에서 비장 무게와 PLT 수치의 감소가 관찰되 었고, 암컷의 간 무게와 WBC 수치의 감소가 관찰되었으나, 고용량에서 감소가 관찰되지 않는 등, 용량 의존적으로 유의한 차이가 나지 않았을 뿐 아니라 육안적병변소견 또한 발견되지 않아, 독성 증상으로 간주하기 어렵다. US Environmental Protection Agency OPPTS 870.
- 1. 시험기간 중 모든 실험동물에서 사망 동물이 관찰되지 않아, LD50 값은 산출되지 않았다.
- 2. 시험물질 투여로 인한 체중변화 및 독성증상은 관찰되지 않았다.
- 3. 실험 종료 시, 모든 동물의 장기에 대하여 육안적 병변을 관찰하였으나 이상 병변은 관찰되지 않았다.
- 4. 실험 종료 시 채취한 혈액으로 혈액학적 검사를 실시한 결과 용량 의존적으로 유의한 차이가 관찰되지 않았다.
후속연구
- 이상의 결과로 귀비탕은 실험동물에 대하여 급성 독성이 없는 한의약물로서그 효능규명을 통한 활용이 기대된다.
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