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문제 정의
- 별로 보고된 바가 없다. 또한 장기적인 자일리톨 섭취에 의한 S. mutans의 모자감염 차단효과에 있어서 전이 양상 및 독성인자를 분석한 연구는 거의 없다 따라서 본 연구에서는 자일리톨을 이용한 치아우식증 유발 세균의 모자감염 예방에 대한 효과를 분자생물학적 관점에서 살펴보고자 하였다.
제안 방법
- mutans를 회수하여 통상적인 방법에 따라 전처리하고 포매하였다. 60℃에서 24시간동안 경화한 후, 70 nm 두께의 초박절편기를 사용하여 절편을 제작하고 200 mesh grid에 올려 acetate와 lead citrate로 이중염색 한 후 생물전용 투과전자현미경으로 관찰하였다.
- 실시간 PCR을 위해서 PCR product size가 200 bp 미만이 되도록 primer set을 제작하였다. DNA 증폭은 SYBR green 형광을 이용하여 측정하였으며, SYBR green의 측정값을 critical threshold cycle (Ct)로 정하여 각각의 유전자들의 발현 정도를 비교하였다.
- znutans로부터 Tri-Reagent를 사용흐卜 여 RNA를 추출하였고 ImProm-U Reverse transcription system를 사용하여 cDNA를 합성하였다. mRNA의 증폭과 분석은 ABsolute QPCR SYBR Green Mixs 과 ABI-Prism 7000 Sequence Detection System을 사용하여 수행하였다. 실시간 PCR을 위해서 PCR product size가 200 bp 미만이 되도록 primer set을 제작하였다.
- 치면세균막을 채취하였다. 각각의 타액 샘플과 치면세균막 샘플로부터 S. mutaus를 선택적으로 배양하기 위해 0.2 U/ml의 bacitracin과 15% sucrose를 포함흐]는 Mitis salivarius agars에 도말하여 수소 5%, 이산화탄소 10%, 질소 85%인 혐기성 배양 조건을 갖춘 항온기 37℃에서 48시간 동안 배양하였으며, 전형적인 S. mutans와 mutans streptococci의 colony-forming units (CFU) 수를 측정하였다. 순수 집락을 얻은 후 이를 brain heart infusion (BHI)(Difco Laboratories, MI, USA) broth에 접종하여 37℃, 10% CO2 조건에서 배양하였다.
- 배양된 S. znutans로부터 Tri-Reagent를 사용흐卜 여 RNA를 추출하였고 ImProm-U Reverse transcription system를 사용하여 cDNA를 합성하였다. mRNA의 증폭과 분석은 ABsolute QPCR SYBR Green Mixs 과 ABI-Prism 7000 Sequence Detection System을 사용하여 수행하였다.
- 배양한 S. mutans를 회수하여 통상적인 방법에 따라 전처리하고 포매하였다. 60℃에서 24시간동안 경화한 후, 70 nm 두께의 초박절편기를 사용하여 절편을 제작하고 200 mesh grid에 올려 acetate와 lead citrate로 이중염색 한 후 생물전용 투과전자현미경으로 관찰하였다.
- mRNA의 증폭과 분석은 ABsolute QPCR SYBR Green Mixs 과 ABI-Prism 7000 Sequence Detection System을 사용하여 수행하였다. 실시간 PCR을 위해서 PCR product size가 200 bp 미만이 되도록 primer set을 제작하였다. DNA 증폭은 SYBR green 형광을 이용하여 측정하였으며, SYBR green의 측정값을 critical threshold cycle (Ct)로 정하여 각각의 유전자들의 발현 정도를 비교하였다.
- 연구대상 어머니의 집락수를 비교하였을 때, 24개월째는 자일리톨군 어머니의 집락수가 대조군과 비교하여 적었다. 그러나 30개월째 대조군에서는 24개월째와 비교하였을때 큰 변화는 없었던 반면 자일리톨 군에서는 자일리톨 저작 종료 시점인 24개월에 비해 섭취 종료 6개월 후인 30개월에 오히려 집락수가 다소 증가하는 양상을 보였다.
- 연구대상자들로부터 5분 동안 paraffin wax를 씹도록 하여 자극성 타액을 채취하였고, 각 대상자의 자녀로부터 치면세균막을 채취하였다. 각각의 타액 샘플과 치면세균막 샘플로부터 S.
- 순수 집락을 얻은 후 이를 brain heart infusion (BHI)(Difco Laboratories, MI, USA) broth에 접종하여 37℃, 10% CO2 조건에서 배양하였다. 이후 TE buffer를 사용하여 DNA를 추출하고 GTFB primers를 사용한 PCR을 수행하여 S. mu tans를동정하였다.
- 한편, 자일리톨 껌을 씹지 않는 대조군 대상자들에게는 매월 성인 및 유아용 칫솔과 구강보건교육용 자료를 우송하였다. 이후 자녀가 태어난 경우, 생후 6개월 12개월, 18개월, 24개월 및 자일리톨 껌 저작 종료 6개월 후 30개월에 어머니와 자녀의 구강건강상태를 측정하고 타액 및 구강 내치 면세균막을 채취하였다.
- 자일리톨군 대상자에게는 자일리톨 껌을 1일 3~6개씩 24개월간 복용하도록 하고, 정기적으로 대상자에게 전화하여 복용에 대한 순응도를 확인하였으며, 자일리톨 복용 시작 시점은 임부 어머니가 출산한 후 만 3개월이 지난 시점으로 정하였다. 한편, 자일리톨 껌을 씹지 않는 대조군 대상자들에게는 매월 성인 및 유아용 칫솔과 구강보건교육용 자료를 우송하였다.
대상 데이터
- 또한 연구초기 구강검진 결과와 타액분비율을 비롯한 사회인구학적요인 및 구강보건관련행태의 차이가 없는 20명의 대상자들을 선별하였으며, 아를 각 10명씩 대조군과 자일리톨군으로 임의 할당하였다.
성능/효과
- 적었다. 그러나 30개월째 대조군에서는 24개월째와 비교하였을때 큰 변화는 없었던 반면 자일리톨 군에서는 자일리톨 저작 종료 시점인 24개월에 비해 섭취 종료 6개월 후인 30개월에 오히려 집락수가 다소 증가하는 양상을 보였다. 연구대상 자녀의 경우도 마찬가지로 6개월 이후 모든 시점에 S.
- 자일리톨군은 24개월에 대조군에 비해 세포외부 다당류 합성이 상당히 적었으며, 섭취 종료 6개월 이후인 30개월에도 24개월째 다당류 합성정도를 그대로 유지하였다. 또한 연구대상자의 자녀의 경우 대조군은 30개월의 점착성 물질이 24 개월에 비해 증가한 반면, 자일리톨군은 다소 감소하는 경향을 보였으며, 24개월과 30개월 모두 자일리톨군이 대조군에 비해 점착성 물질이 상당히 적은 것을 확인할 수 있었다 그림 4~5).
- 연구대상 어머니와 자녀 모두 24개월에 비해 30개월에 글루칸 합성에 관여하는 유전자 gt婀 gtfD, 프럭탄 합성에 관여하는 ftf의 발현이 상당히 감소하였다 또한 24개월과 30개월 모두 대조군에 비해 자일리톨 군의 gtfB, gtfD, ftf 유전자 발현이 현저히 낮았으며, 특히 30개월에 연구대상 자녀의 유전자 발현이 뚜렷이 낮았다 (그림 6~7).
- 그러나 30개월째 대조군에서는 24개월째와 비교하였을때 큰 변화는 없었던 반면 자일리톨 군에서는 자일리톨 저작 종료 시점인 24개월에 비해 섭취 종료 6개월 후인 30개월에 오히려 집락수가 다소 증가하는 양상을 보였다. 연구대상 자녀의 경우도 마찬가지로 6개월 이후 모든 시점에 S. mutans 출현율이 대조군에 비해 자일리톨군에서 높았다. 반면, mutans streptococci 출현율은 모든 시기에 자일리톨군이 대조군에 비해 낮았다.
- mutans 독력 또한 효괴적으로감소시켰다. 자일리톨 섭취 종로- 6개월 이후 30개월에 어머니에서 자일리톨 내성균주의 형성으로 S. mu tans 의 집락 수가 다소 증가한 것으로 사료되며, 자녀에게도 이러한 영향이 미쳐 S. mtuanse 출현율은 대조군에 비해 높은 경향을 보였다. 그럼에도 불구하고 독력관련 유전자 발현을 비교하였을 때, .
- 차이를 보이지 않았다. 자일리톨군은 24개월에 대조군에 비해 세포외부 다당류 합성이 상당히 적었으며, 섭취 종료 6개월 이후인 30개월에도 24개월째 다당류 합성정도를 그대로 유지하였다. 또한 연구대상자의 자녀의 경우 대조군은 30개월의 점착성 물질이 24 개월에 비해 증가한 반면, 자일리톨군은 다소 감소하는 경향을 보였으며, 24개월과 30개월 모두 자일리톨군이 대조군에 비해 점착성 물질이 상당히 적은 것을 확인할 수 있었다 그림 4~5).
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