Tannase를 이용한 녹차의 생물학적 전환의 최적 조건 마련 및 라디칼 소거능 Optimal Reaction Conditions and Radical Scavenging Activities for the Bioconversion of Green Tea Using Tannase원문보기
본 연구는 tannase를 이용하여 녹차의 생물학적 전환에 대한 최적 추출 조건을 확립하고 최적 추출 조건으로 마련된 녹차 추출물에 대해 라디칼 소거능 검증을 통해 항산화력의 향상 정도를 평가하고자 하였다. 그 결과 tannase의 반응은 0.5시간 내에 대부분 이루어지며 처리 1시간까지도 일부 작용이 이루어져 최적 추출물을 획득하기 위한 tannase의 반응 시간을 1시간으로 결정하였다. 기질 농도 1% 이상의 경우에서는 EC 및 EGC 전환율이 오히려 낮아져 tannase 작용을 위한 기질 농도는 1%가 적당한 것으로 판단되었다. 또한 tannase 농도가 증가함에 따라 EC, EGC 및 gallic acid는 증가되었으며 일정 농도(30 U/mL)에서 급격한 증가를 나타내었고, 이 농도부터는 통계적으로 EC와 EGC 전환율이 증가하지 않는 것으로 보아 tannase의 적정 반응 농도는 30 U/mL으로 판단되었다. 위의 조건으로 마련된 최적의 tannase 처리 녹차 추출물의 라디칼 소거능은 tannase 처리 전 녹차 추출물에 비해 ABTS와 DPPH 라디칼에 있어 모두 유의하게 소거능이 증가되는 것으로 나타나 tannase 처리 최적 추출 조건에 의해 녹차의 항산화력이 향상됨을 알 수 있었다.
본 연구는 tannase를 이용하여 녹차의 생물학적 전환에 대한 최적 추출 조건을 확립하고 최적 추출 조건으로 마련된 녹차 추출물에 대해 라디칼 소거능 검증을 통해 항산화력의 향상 정도를 평가하고자 하였다. 그 결과 tannase의 반응은 0.5시간 내에 대부분 이루어지며 처리 1시간까지도 일부 작용이 이루어져 최적 추출물을 획득하기 위한 tannase의 반응 시간을 1시간으로 결정하였다. 기질 농도 1% 이상의 경우에서는 EC 및 EGC 전환율이 오히려 낮아져 tannase 작용을 위한 기질 농도는 1%가 적당한 것으로 판단되었다. 또한 tannase 농도가 증가함에 따라 EC, EGC 및 gallic acid는 증가되었으며 일정 농도(30 U/mL)에서 급격한 증가를 나타내었고, 이 농도부터는 통계적으로 EC와 EGC 전환율이 증가하지 않는 것으로 보아 tannase의 적정 반응 농도는 30 U/mL으로 판단되었다. 위의 조건으로 마련된 최적의 tannase 처리 녹차 추출물의 라디칼 소거능은 tannase 처리 전 녹차 추출물에 비해 ABTS와 DPPH 라디칼에 있어 모두 유의하게 소거능이 증가되는 것으로 나타나 tannase 처리 최적 추출 조건에 의해 녹차의 항산화력이 향상됨을 알 수 있었다.
In this study, we optimized the reaction conditions for the bioconversion of green tea using tannase, and to evaluate its radical scavenging activities. Tea catechins such as (-)-epigallocatechin gallate (EGCG) or (-)-epicatechin gallate (ECG) were hydrolyzed by tannase to produce (-)-epigallocatech...
In this study, we optimized the reaction conditions for the bioconversion of green tea using tannase, and to evaluate its radical scavenging activities. Tea catechins such as (-)-epigallocatechin gallate (EGCG) or (-)-epicatechin gallate (ECG) were hydrolyzed by tannase to produce (-)-epigallocatechin (EGC) or (-)-epicatechin (EC), respectively, and a common product, gallic acid. The bioconversion of tea catechins by tannase was increased as enzyme concentration, substrate concentration and incubation time for enzyme dose. The results indicated the optimum reaction conditions for tannase were tannase 30 U/mL (enzyme concentration) on 1% green tea (substrate concentration) for 1 hr (incubation time for enzyme). Tannase enhanced the radical-scavenging properties of green tea; the 2,2-azinobis (3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS) and 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radicals scavenging abilities were significantly (p<0.001) greater for the tannase-treated green tea extract compared to the untreated green tea extract. It is reported that ECG has the greatest antioxidant activity among the catechins in green tea, and the release of gallic acid is considered to be beneficial because of its significant antioxidant potency. The results of this study suggest that the tannase-treated green tea increases antioxidant activities under optimum reaction conditions.
In this study, we optimized the reaction conditions for the bioconversion of green tea using tannase, and to evaluate its radical scavenging activities. Tea catechins such as (-)-epigallocatechin gallate (EGCG) or (-)-epicatechin gallate (ECG) were hydrolyzed by tannase to produce (-)-epigallocatechin (EGC) or (-)-epicatechin (EC), respectively, and a common product, gallic acid. The bioconversion of tea catechins by tannase was increased as enzyme concentration, substrate concentration and incubation time for enzyme dose. The results indicated the optimum reaction conditions for tannase were tannase 30 U/mL (enzyme concentration) on 1% green tea (substrate concentration) for 1 hr (incubation time for enzyme). Tannase enhanced the radical-scavenging properties of green tea; the 2,2-azinobis (3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS) and 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radicals scavenging abilities were significantly (p<0.001) greater for the tannase-treated green tea extract compared to the untreated green tea extract. It is reported that ECG has the greatest antioxidant activity among the catechins in green tea, and the release of gallic acid is considered to be beneficial because of its significant antioxidant potency. The results of this study suggest that the tannase-treated green tea increases antioxidant activities under optimum reaction conditions.
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문제 정의
Gallic acid는 ABTS나 DPPH 라디칼뿐 아니라 superoxide anions, hydroxyl, peroxyl 라디칼에 대한 소거능이 매우 뛰어나 유리된 gallic acid는 UV이나 이온 조사에 의해 손상된 세포에 대해 매우 효과적임이 알려져 있다(27). 따라서 본 연구에서 tannase 처리한 녹차 추출물의 라디칼 소거능 향상은 tannase의 의한 생물학적 전환에 기인한 결과로 사료된다.
하지만 녹차 catechins에 대한 대부분의 연구는 EGCG에 집중되어 있으며 tannase에 의한 catechins 전환에 관한 연구나 이에 대한 생리활성에 관련한 연구는 많이 이루어지지 않고 있다. 따라서 본 연구에서는 tannase을 이용하여 녹차의 생물학적 전환에 대한 최적 반응 조건을 확립하고 최적 반응 조건으로 마련된 녹차 추출물에 대해 라디칼 소거능 검증을 통해 항산 화력의 향상 정도를 평가하고자 하였다.
본 연구는 tannase를 이용하여 녹차의 생물학적 전환에 대한 최적 추출 조건을 확립하고 최적 추출 조건으로 마련된 녹차 추출물에 대해 라디칼 소거능 검증을 통해 항산화력의 향상 정도를 평가하고자 하였다. 그 결과 tannase의 반응은 0.
제안 방법
Tannase 기질 농도: Tannase 작용에 대한 기질이 최적농도를 알아보기 위해 녹차 분말 0.5～5.0%로 다양한 농도로 하여 제조한 녹차 추출물에서의 tannase의 작용(50 U/ mL)에 따른 catechins 및 gallic acid의 함유량과 catechins의 전환율을 분석하였다(Fig. 2). 그 결과 EC 및 EGC 전환율은 기질 농도가 높을수록 낮아졌는데 특히 기질 농도가 2% 이상의 경우는 기질 농도 0.
본 연구는 tannase를 이용하여 녹차의 생물학적 전환에 대한 최적 추출 조건을 확립하고 최적 추출 조건으로 마련된 녹차 추출물에 대해 라디칼 소거능 검증을 통해 항산화력의 향상 정도를 평가하고자 하였다. 그 결과 tannase의 반응은 0.5시간 내에 대부분 이루어지며 처리 1시간까지도 일부 작용이 이루어져 최적 추출물을 획득하기 위한 tannase의 반응 시간을 1시간으로 결정하였다. 기질 농도 1% 이상의 경우에서는 EC 및 EGC 전환율이 오히려 낮아져 tannase 작용을 위한 기질 농도는 1%가 적당한 것으로 판단되었다.
녹차 분말을 증류수 100 mL에 현탁시킨 후 0.1 N HCl을이용해 pH 5.5로 조정하고 tannase를 첨가하여 40℃의 항온 수조에서 반응 후 5분간 가열처리로 효소 활성을 제거하여 각 녹차 분말 농도별(기질 농도 0～5%), tannase 농도별(효소 농도 0～50 U/mL), tannase 반응 시간별(효소 반응 시간 0～8 hr)로 녹차 추출물을 획득하여 본 연구의 분석 시료로 사용하였다.
녹차의 catechins 분석을 위해 high-performance liquid chromatography(HPLC, Varian 230, Varian Inc., Tucson, AZ, USA)와 분석 칼럼으로 hypersil C18 column(5 μm, 250 × 4.6 mm ID)을 사용하였고 주입량은 20 μL, 유속은 0.8 mL/min, 칼럼 온도는 37℃, 자외선 검출기 흡광도는 280 nm로 설정하여 분석하였으며 이동상 용매는 1% acetic acid와 100% acetonitrile을 사용하였다.
Hong(17)은 tannase에 의한 녹차의 생물학적 전환을 시도한 연구에서 1% 녹차 추출물에 대해 tannase(50 U/mL)에 의한 생물학적 전환은 20분 안에 많은 부분이 빠르게 이루어지며 30분에는 대부분의 반응이 종결되었다고 보고하였다. 본 연구에서도 1% 녹차 추출물에 대해 tannase (50 U/mL)에 의한 반응은 0.5시간 즉, 30분 이내에 대부분 이루어지는 것으로 나타났으나 최적의 추출물 획득을 위해 일부 잔존 반응의 종결에 따른 약간의 시간이 요구되어 1시간까지 충분히 반응을 유도하는 것이 바람직한 것으로 판단하고 녹차 추출물에 대한 tannase(50 U/mL)의 반응시간을 1시간으로 결정하였다.
대상 데이터
20, 500 U/g)는 Kikkoman Co.(Tokyo, Japan)에서 구입하여 사용하였다. 녹차의 catechins 분석을 위한 EC, ECG, EGC, EGCG, catechin, gallic acid의 표준물질은 Sigma Chemical(St.
(Tokyo, Japan)에서 구입하여 사용하였다. 녹차의 catechins 분석을 위한 EC, ECG, EGC, EGCG, catechin, gallic acid의 표준물질은 Sigma Chemical(St. Louis, MO, USA) 에서, 라디칼 소거능 측정을 위한 시약으로 2,2-azinobis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid)(ABTS) 및 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH)은 각각 Fluka(Steinheim, Germany)와 Sigma Chemical로부터 구입하여 사용하였고 그밖의 모든 시약은 분석에 용이한 특급 시약을 사용하였다.
데이터처리
Different letters indicate significant differences (p<0.05) among samples by Duncan's multiple range test.
, Chicago, IL, USA)을 이용하였다. 각 항목에 대한 평균(mean) 및 표준편차(standard deviation, SD)를 산출하였고 시료내의 측정값들의 차이는 p=0.05 수준에서 one-way ANOVA와 구체적인 사후 검정은 Duncan`s multiple range test를 이용하여 유의성을 검증하였다.
이론/모형
ABTS 라디칼 소거능은 Re 등(14)의 방법을 이용하여 7 mM 2.45 mM potassium persulfate를 첨가하여 암소에서 12～16시간 방치한 후 414 nm에서 흡광도가 1.4～1.5가 되도록 증류수로 희석시킨 ABTS 라디칼 용액 250 μL에 시료 12.5 μL을 60분간 반응시킨 후 414 nm에서 흡광도를 측정하 였다.
5 μL을 60분간 반응시킨 후 414 nm에서 흡광도를 측정하 였다. DPPH 라디칼 소거능 측정은 Cheung 등(15)의 방법을 이용하여 DPPH을 ethanol에 용해시킨 0.2 mM DPPH 용액 0.4 mL와 시료 0.1 mL을 10분간 반응시킨 후 520 nm에서흡광도를 측정하였다. Half maximal inhibitory concentration (IC 50)은 라디칼을 50% 저하시키는 시료의 농도로 하였다.
8 mL/min, 칼럼 온도는 37℃, 자외선 검출기 흡광도는 280 nm로 설정하여 분석하였으며 이동상 용매는 1% acetic acid와 100% acetonitrile을 사용하였다. 분석된 catechins로 EC 및 EGC의 전환율은 Cao와 Ito(13)의 방법을 이용하여 계산하였다.
성능/효과
ABTS 라디칼에 있어 tannase 처리 전후의 녹차 추출물은 모두 높은 라디칼 소거능을 나타내어 100 μg/mL에서 50% 이상의 ABTS 라디칼 소거능을 나타내 었는데(17) 특히 최적 조건에서 형성된 tannase 처리 녹차 추출물의 IC50은 75.23 μg/mL로 tannase 처리 전 녹차 추출물 IC50 92.39 μg/mL에 비해 유의적으로 낮은 값을 나타내었다(p<0.001).
Tannase 처리 시간에 따른 EC 및 EGC 전환율은 tannase 처리 0.5시간째 이미 각각 318.20, 138.25%로 높은 수준을 나타내었고 1시간째에는 더욱 증가되어 374.56, 225.52%로 유의적으로 높아졌으며(p<0.05) 1시간 이후에는 역시 통계적으로 유의적인 변화를 나타내지 않았다(Fig. 1).
본 연구에서는 기질 농도 1% 이상의 경우에서는 EC 및 EGC 전환율이 오히려 낮아졌다. Tannase 처리에 대해 녹차 기질의 농도를 1%로 설정된 기존 연구들(10,18)과 같이 본 연구에서는 tannase 작용을 위한 기질 농도는 EC 및 EGC 전환율을 고려할 때 1%가 적당한 것으로 판단되었다.
그 결과 EC 및 EGC 전환율은 기질 농도가 높을수록 낮아졌는데 특히 기질 농도가 2% 이상의 경우는 기질 농도 0.5%나 1%에 비해 유의하게 낮아졌으며(p<0.05) tannase의 처리 1시간을 기준으로 하여 볼때 기질 농도 5%에서는 EC 및 EGC 전환율은 각각 91.70, 104.32%로 기질 농도 1%에서의 EC 및 EGC 전환율 231.00 %, 360.81%의 절반에도 못 미치는 수준이었다.
5시간 내에 대부분 이루어지며 처리 1시간까지도 일부 작용이 이루어져 최적 추출물을 획득하기 위한 tannase의 반응 시간을 1시간으로 결정하였다. 기질 농도 1% 이상의 경우에서는 EC 및 EGC 전환율이 오히려 낮아져 tannase 작용을 위한 기질 농도는 1%가 적당한 것으로 판단되었다. 또한 tannase 농도가 증가함에 따라 EC, EGC 및 gallic acid는 증가되었으며 일정 농도(30 U/mL)에서 급격한 증가를 나타내었고, 이 농도부터는 통계적으로 EC와 EGC 전환율이 증가하지 않는 것으로 보아 tannase의 적정 반응 농도는 30 U/mL으로 판단되었다.
또한 DPPH 라디칼에 있어서는 두 녹차 추출물모두 동일한 농도에서 ABTS 라디칼에 보다 높은 소거능을 나타내었으며 80 μg/mL에서 80% 이상의 DPPH 라디칼 소거능을 나타내었으며 역시 tannase를 처리한 녹차 추출물의 경우 100 μg/mL에서 90% 이상의 높은 DPPH 라디칼 소거 능을 나타내었고(17) IC50도 36.65 μg/mL로 tannase 처리전 IC50 41.54 μg/mL보다 유의적으로 낮아(p<0.001) 항산화력이 향상됨을 나타내었다.
또한 tannase 농도가 높을수록 EC와 EGC 전환율이 높아졌는데 tannase 1시간 처리에서 EC와 EGC 전환율은 tannase 10 U/mL 처리에서는 각각 142.89, 151.33%이었는데 비해 tannase 20 U/mL에서는 각각 188.45, 227.08%로 유의하게 높았다(p<0.05).
기질 농도 1% 이상의 경우에서는 EC 및 EGC 전환율이 오히려 낮아져 tannase 작용을 위한 기질 농도는 1%가 적당한 것으로 판단되었다. 또한 tannase 농도가 증가함에 따라 EC, EGC 및 gallic acid는 증가되었으며 일정 농도(30 U/mL)에서 급격한 증가를 나타내었고, 이 농도부터는 통계적으로 EC와 EGC 전환율이 증가하지 않는 것으로 보아 tannase의 적정 반응 농도는 30 U/mL으로 판단되었다. 위의 조건으로 마련된 최적의 tannase 처리 녹차 추출물의 라디칼 소거능은 tannase 처리 전 녹차 추출물에 비해 ABTS와 DPPH 라디칼에 있어 모두 유의하게 소거능이 증가되는 것으로 나타나 tannase 처리 최적 추출 조건에 의해 녹차의 항산화력이 향상됨을 알 수 있었다.
또한 tannase 처리 1시간째에는 더욱 증가되어 EC와 EGC는 각각 528.00, 1655.22 μg/mL의 높은 함량을 나타내었으나 tannase 처리 1시간 이후부터는 EC와 EGC의 함량에 큰 변화가 없었다.
또한 유리 gallic acid의 수준도 tannase 처리 전(30.63 μg/mL)에 비해 tannase 처리 0.5시간째(915.70 μg/mL)에 30배가량 높은 증가를 나타내었고 1시간째에는 950.05 μg/mL로 약간 상승되었으나 1시간 이후에는 큰 변화를 보이지 않았다.
본 연구 결과 tannase(50 U/mL)의 처리 시간은 0.5시간 내에 대부분 이루어지며 1시간까지도 일부 작용이 이루어지나 1시간 이후부터는 생성물이나 catechins의 전환율에 변화가 거의 없는 것으로 보아 모든 반응은 1시간 이전에 이루어지는 것으로 생각된다. Thomas와 Murtagh(16)는 효소 및 기질의 농도에 따라 차이가 있을 수 있으나 tannase에의한 가수분해는 일반적으로 20분 안에 대부분 이루어진다고 하였다.
또한 기질의 농도 증가 자체가 효소 활성을 감소시키는 것으로 알려져있는데 이러한 최대 효소 활성을 고려한 낮은 기질 수준의 적용은 식품산업에서 유용하게 활용되고 있다(20). 본 연구에서는 기질 농도 1% 이상의 경우에서는 EC 및 EGC 전환율이 오히려 낮아졌다. Tannase 처리에 대해 녹차 기질의 농도를 1%로 설정된 기존 연구들(10,18)과 같이 본 연구에서는 tannase 작용을 위한 기질 농도는 EC 및 EGC 전환율을 고려할 때 1%가 적당한 것으로 판단되었다.
05) tannase 30 U/mL 이상부터는 더 이상 증가를 보이지 않았다. 본 연구의 결과 tannase 농도가 증가함에 따라 EC, EGC 및 gallic acid는 증가되었으며 일정 농도(30 U/mL)에서 급격한 증가를 나타내고 이 농도부터는 EC와 EGC 전환율이 증가하지 않는 것으로 보아 기질 농도 대비 tannase의 적정 반응 농도는 30 U/mL으로 판단되었다.
또한 tannase 농도가 증가함에 따라 EC, EGC 및 gallic acid는 증가되었으며 일정 농도(30 U/mL)에서 급격한 증가를 나타내었고, 이 농도부터는 통계적으로 EC와 EGC 전환율이 증가하지 않는 것으로 보아 tannase의 적정 반응 농도는 30 U/mL으로 판단되었다. 위의 조건으로 마련된 최적의 tannase 처리 녹차 추출물의 라디칼 소거능은 tannase 처리 전 녹차 추출물에 비해 ABTS와 DPPH 라디칼에 있어 모두 유의하게 소거능이 증가되는 것으로 나타나 tannase 처리 최적 추출 조건에 의해 녹차의 항산화력이 향상됨을 알 수 있었다.
후속연구
차에 대한 tannase 반응 조건의 확립은 차 추출물의 맛 개선과 더불어 다양한 제품 개발 가능성을 확대하며 생리활성이 증가된 고품질, 고활성의 원료 생산을 가능하게 한다. 이러한 소재의 활용은 고부가가치의 기능성식품으로의 활용도를 높이고 이로 인한 기술 이전 및 산업화를 촉진할 수 있는 기반을 확보할 수 있을 것으로 생각된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
차란 무엇인가?
차는 세계에서 가장 많이 음용되고 있는 음료 중 하나이다. 차나무에서 어린잎을 채취하여 수분 함량을 5% 이하로 건조시킨 다음, 차 잎의 추출 과정에서 산화되는 색상에 따라 백차, 홍차, 녹차 등으로 구분되어 사용되고 있으며 국내에서는 매년 약 250만 톤 규모 이상의 녹차가 재배되고 있다 (1).
녹차에 함유되어 있는 catechins의 양이나 질은 어떤 요인에 영향을 받는가?
차나무에서 어린잎을 채취하여 수분 함량을 5% 이하로 건조시킨 다음, 차 잎의 추출 과정에서 산화되는 색상에 따라 백차, 홍차, 녹차 등으로 구분되어 사용되고 있으며 국내에서는 매년 약 250만 톤 규모 이상의 녹차가 재배되고 있다 (1). 녹차는 원료의 타입, 재배 방법, 기후 등에 의해 영향을 많이 받는다고 알려져 있으며 특히 녹차에 함유되어 있는 catechins의 양이나 질은 pH, 온도, 효소 처리 등의 추출 조건이나 방법에 따라서 크게 좌우된다고 보고되고 있다(1).
녹차에 함유되어 있는 catechins의 효능은 무엇인가?
녹차의 catechins는 강력한 항산화제로 녹차의 심장병 예방효과, 항암효과, 항균효과 등 녹차의 다양한 기능성을 설명하는 주된 성분이다. 녹차의 catechins에는 (-)-epicatechin(EC), (-)-epicatechin gallate(ECG), (-)-epigallocatechin(EGC), (-)-epigallocatechin gallate(EGCG)와 같은 epicatechin 유도체와 catechin이 있다(2).
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