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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 국내 시판중인 녹차, 보이차, 우롱차 및 홍차에 함유되어 있는 flavonol 및 catechin류와 같은 폴리페놀화합물의 함량을 비교하고, 또한 열수 추출물을 이용하여 항산화 특성 및 acetylcholinesterase 저해활성에 관하여 조사하였다.
제안 방법
- β-carotene linoleate system을 이용한 항산화 효과의 측정은 Elzaawely 등의 방법을 변형하여 측정하였다(25).
- 각종 차에 함유되어 있는 flavonol들을 분석하기 위하여 시료 2 g에 60% ethanol 40 mL와 6N-HCl 5 mL를 첨가하여 95℃ 수욕상에서 환류 냉각 하에 2시간 동안 추출하였다. 이 추출물을 60% ethanol로 50 mL가 되도록 정용한 후 0.
- 2로 조정) 5 mL를 첨가하여 Glass-Col homogenizer로 균질화한 후 균질화 된 세포배양액을 10,000 rpm에서 30분 동안 원심 분리하였으며, 그 상징액을 효소실험을 위하여 사용하였다. 모든 추출공정은 4℃에서 수행하였으며, 추출한 효소액의 단백질함량을 측정하기 위하여 BCA kit(bicin-choninic acid; Sigma Co., St. Louis, Mo, USA)를 이용하였고, bovine serum albumin으로 작성한 검량곡선에 준하여 함량을 환산하였다. 정제효소 (단백질 함량: 2.
- 5 mL, 10%, w/v)를 첨가하여 650 × g에서 10분간 원심분리하였다. 원심분리한 상징액(5 mL)에 탈이온수 (5 mL)와 1% ferric chloride 1 mL를 첨가시킨 후 UV-spectrophotometer (Shimadzu UV- 1601, Japan)를 이용하여 700 nm에서 흡광도를 측정하였다(24).
- 이 추출물을 60% ethanol로 50 mL가 되도록 정용한 후 0.45 μm syringe filter로 여과하여 HPLC (Agilent 1100 series, USA)로 분석하였다.
- 이 추출물을 감압농축한 후 시액 {0.2 M 인산완충액 (pH 3) : 메탄올 : D.W = 2 : 3 : 15, v/v} 10 mL에 완전히 용해시킨 후 0.45 μm membrane filter로 여과하여 HPLC (Agilent 1100 series, USA)를 이용하여 측정하였다.
대상 데이터
- 검출기는 DAD로 280 nm, 컬럼은 ODS (25 mm × 4.9 mm, 5 μm), 이동상은 methanol : acetic acid : acetonitrile : ddH2O(20 : 5 : 113 : 862 = v/v/v/v) 및 유속은 1 mL/min로 분석하였다(21).
- 본 실험에 사용된 4종의 잎차는 2008년 2월에 차를 전문으로 판매하는 온라인 판매처(Interpark Co. Korea)에서 구매하였으며, 녹차는 (주)햇차원에서 생산된 우전녹차, 보이차와 우롱차는 중국에서 생산된 팔덕명차 및 홍차는 스리랑카에서 생산된 akbar제품을 각각 사용하였다.
- 45 μm syringe filter로 여과하여 HPLC (Agilent 1100 series, USA)로 분석하였다. 표준품으로는 myricetin, quercetin 및 kaempferol을 사용하였다(20).
데이터처리
- 2)Each value with different superscripts within the same row are significantly difference at p<0.05 by Duncan's multiple test.
- 6)Each value with different superscripts within the same row are significantly difference at p<0.05 by Duncan's multiple test.
- 통계처리는 Window 용 SAS 8.0 version을 이용하여 분산분석 (analysis of variance)을 실시하였으며, Duncan의 다중범위검정법 (Duncan’s multiple range test)으로 유의성을 검정하였다.
이론/모형
- Acetylcholinesterase저해 활성 측정은 acetylcholine iodide를 기질로 사용하는 Ellman법으로 측정하였다(27). 효소는 PC12 세포배양액 1 mL에 균질화를 위한 buffer (1 M NaCl, 50 mM MgCl2, 1% Triton X-100 혼합액에 10 mM Tris-HCl로 pH 7.
- 차 추출물의 총 페놀 함량을 측정하기 위하여 Folin-Ciocalteu's방법을 이용하였다(19).
성능/효과
- ABTS·+ 라디칼 소거활성 경향도 녹차, 보이차, 우롱차 및 홍차 열수추출물 순이었으며, 250 μg/mL의 농도에서 각각 92.09, 80.29, 82.67, 48.07%의 소거활성을 보였다.
- 국내 시판 차 4종의 열수추출물을 농도 1 mg/mL로 linoleic acid에 첨가하여 과산화지질의 생성억제효과를 측정한 결과 대조구에 비하여 모든 시판 차 열수추출물에서 과산화지질의 생성을 억제하는 효과를 나타내었으며, 또한 국내 시판 차 열수추출물의 종류에 따른 과산화지질 생성 억제 효과의 차이는 크게 보이지 않았다 (Fig. 5). Yen 등(33)은 녹차, 푸총차, 우롱차 및 홍차 4가지 차 열수추출물을 이용하여 linoleic acid의 산화억제활성을 측정한 결과 우롱차, 녹차, 푸총차 및 홍차 순으로 그 활성이 높게 나타났다고 보고하였으며, 이와 같은 항산화 활성은 차에 함유되어 있는 카테킨과 같은 폴리페놀 화합물의 함량과 매우 깊은 관련성을 가진다고 보고하였다.
- 국내시판 중인 4종의 차 열수추출물의 플라보놀 함량을 측정한 결과는 Table 2와 같다. 국내 시판 차 열수추출물에 가장 많이 함유되어 있는 플라보놀 성분은 차의 종류에 관계없이 quercetin이었고, 그 함량은 녹차, 보이차, 우롱차 및 홍차 추출물에서 각각 162.99, 113.97, 194.80 및 115.59 mg/100 g으로 우롱차에서 가장 높은 함량을 보였다. 총 플라보놀 함량에서는 녹차 열수추출물에 가장 많이 함유되어 있었으며, 우롱차, 보이차 및 홍차 열수 추출물 순이었다.
- 국내 시판차 열수추출물의 농도가 증가함에 따라 β-carotene 변색 방지효과도 점차적으로 증가하는 경향을 보였으며, 특히 1 mg/mL의 농도에서 positive control로 사용한 BHA와 αα-tocopherol은 88.41%와 87.55%의 활성을 보였고, 녹차, 보이차, 우롱차 및 홍차 열수추출물에서 각각 79.33, 77.20, 73.25 및 66.26% 순이었다.
- 국내시판 중인 4종의 차 열수추출물을 이용하여 ABTS·+ 라디칼 소거활성을 측정한 결과 Fig. 1과 같이 차 열수추출물의 농도가 증가함에 따라 DPPH 라디칼 소거활성과 유사하게 농도 의존적인 경향이었다.
- 국내시판 중인 4종의 차 열수추출물을 이용하여 superoxide anion 라디칼 소거활성을 측정한 결과 Fig. 2와 같이 차열수추출물의 농도가 증가함에 따라 농도 의존적인 경향이었으며, DPPH 및 ABTS·+ 라디칼 소거활성과 같은 250μg/mL의 농도에서 각각 86.70, 75.48, 73.09 및 46.50%의 소거활성을 보여 녹차, 보이차, 우롱차 및 홍차 열수추출물 순이었으나 500 μg/mL의 농도 이상에서는 큰 차이를 보이지 않았다.
- 국내시판 중인 4종의 차열수추출물의 총 페놀화합물 함량을 측정한 결과는 Table 1과 같다. 녹차에서 85.62 mg/g으로 가장 높은 함량을 보였으며, 우롱차, 보이차 및 홍차 열수추출물에서 각각 83.52, 75.95 및 72.03 mg/g순으로 나타나 발효가 진행됨에 따라 총 폴리페놀 함량이 감소하는 경향을 보였다. Shon 등(28)은 국내산 녹차와 후발효차 추출물의 총페놀 함량을 측정한 결과 녹차 열수추출물 35.
- 추출물의 농도가 점차적으로 증가함에 따라 환원력이 증가하는 경향을 보였으며, 녹차와 우롱차 열수추출물에서 가장 강한 환원력을 나타내었고, 다음으로 보이차 및 홍차 열수추출물 순이었다. 모든 농도에서 녹차, 우롱차 및 보이차 열수추출물에서는 큰 차이를 보이지 않았으나 가장 많이 발효가 된 홍차에서 낮은 환원력을 나타내었다. Yen 등(33)은 녹차, 푸총차, 우롱차 및 홍차 4가지 차 열수추출물을 이용하여 환원력을 측정한 결과 농도 1 mg/mL에서 각각 2.
- 국내시판 중인 4종의 차 열수추출물의 카테킨 및 카페인 함량을 측정한 결과는 Table 3과 같다. 비발효차와 반발효차인 녹차와 우롱차에서는 epigallocatechin gallate가 각각 1,079.49와 1,157.84 mg/100 g으로 가장 많은 함량을 보였으며, 발효차인 보이차와 홍차에서는 epigallocatechin이 각각 337.54와 545.58 mg/100 g으로 가장 높았다. 위의 결과와 같이 발효의 진행 정도에 따라 주된 카테킨의 조성이 변화되는 현상을 보였으며, 또한 그 함량도 발효가 진행되면 진행될수록 카테킨류의 함량이 감소되는 경향을 보여 녹차, 보이차, 우롱차 및 홍차 열수추출물의 총 카테킨 함량은 각각 2,920.
- 58 mg/100 g으로 가장 높았다. 위의 결과와 같이 발효의 진행 정도에 따라 주된 카테킨의 조성이 변화되는 현상을 보였으며, 또한 그 함량도 발효가 진행되면 진행될수록 카테킨류의 함량이 감소되는 경향을 보여 녹차, 보이차, 우롱차 및 홍차 열수추출물의 총 카테킨 함량은 각각 2,920.35, 1,016.23, 2,824.22 및 1,006.51 mg/100 g으로 녹차에서 가장 높은 함량을 보였다. Choi 등(30)은 국내산 야생차인 녹차, 반발효차 및 홍차의 카테킨 함량을 측정한 결과 EGCG의 함량이 가장 높았으며, ECG, EC, EGC 순으로 낮았으며, 중발효차와 강발효차의 총 카테킨 함량은 각각 9.
- 차열수출물의 농도가 증가함에 따라 AChE에 대한 저해활성도 비례적으로 증가하는 경향을 보였으며, 특히 1,000 μg/mL의 농도에서 녹차 열수추출물이 73.75%의 높은 저해 활성을 보였고, 우롱차 (56.25%), 보이차 (48.75%) 및 홍차 열수추출물 (41.25%) 순이었다.
- 59 mg/100 g으로 우롱차에서 가장 높은 함량을 보였다. 총 플라보놀 함량에서는 녹차 열수추출물에 가장 많이 함유되어 있었으며, 우롱차, 보이차 및 홍차 열수 추출물 순이었다. Wang 등(20)은 녹차와 홍차의 플라보놀 함량을 측정하기 위하여 에탄올, 메탄올 및 아세톤과 같은 추출용매의 종류에 따른 추출수율을 측정한 결과 60% 에탄올 추출물에서 가장 높은 추출수율을 보였으며, 홍차에 비하여 녹차 추출물에서 플라보놀 함량이 높게 나타났고, 또한 추출횟수는 첫 번째 추출물에서 가장 높은 함량을 나타내었다고 보고하였다.
- 환원력에서의 흡광도 수치는 그 자체가 시료의 환원력을 나타내며, 높은 항산화 활성을 가지는 물질은 흡광도의 수치가 높게 나타났다. 추출물의 농도가 점차적으로 증가함에 따라 환원력이 증가하는 경향을 보였으며, 녹차와 우롱차 열수추출물에서 가장 강한 환원력을 나타내었고, 다음으로 보이차 및 홍차 열수추출물 순이었다. 모든 농도에서 녹차, 우롱차 및 보이차 열수추출물에서는 큰 차이를 보이지 않았으나 가장 많이 발효가 된 홍차에서 낮은 환원력을 나타내었다.
- 84%로 녹차보다 현저하게 감소하였다고 보고하여 본 실험의 결과와 유사한 결과를 보였다. 카페인 함량은 녹차, 보이차, 우롱차 및 홍차에서 각각 357.72, 304.06, 333.25 및 283.46 mg/100 g으로 발효가 진행될 수록 카페인의 함량이 감소하는 경향을 보였다. Pilar Almajano 등(29)은 각종 차 추출물의 카페인 함량을 분석한 결과 홍차와 녹차 열수추출물의 카페인 함량은 각각 447±14.
- 3과 같다. 환원력에서의 흡광도 수치는 그 자체가 시료의 환원력을 나타내며, 높은 항산화 활성을 가지는 물질은 흡광도의 수치가 높게 나타났다. 추출물의 농도가 점차적으로 증가함에 따라 환원력이 증가하는 경향을 보였으며, 녹차와 우롱차 열수추출물에서 가장 강한 환원력을 나타내었고, 다음으로 보이차 및 홍차 열수추출물 순이었다.
후속연구
- 25%) 순이었다. 따라서 AChE의 저해활성도 역시 플라보놀 및 카테킨의 함량과 비례하는 결과를 보여 차에 함유되어 있는 개별 플라보놀 및 카테킨류를 이용한 AChE저해활성 평가도 필요할 것으로 생각된다.
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