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문제 정의
- , 1997). 본 연구에서 기능성 성분을 나타낼 수 있는 것으로 기대 되어 짐에도 불구하고 항성인병 인자로서의 검증을 시도된 바가 없는 톳의 생리기능활성을 동물실험을 통해 확인하고자 하였다.
제안 방법
- 효소 활성도는 superoxide dismutase의 U/mg protein으로 표시하였다. SOD의 1 Unit는 50% 억제되는 adrenochrome의 생성율로서 산출하였다.
- Table 1에 나타낸 고지방식이를 과량으로 4주간 흰쥐에 투여하여 고지혈증을 유발하여 톳, 톳 ethanol 추출물, 톳 ethanol 추출잔사물을 6주동안 매일 일정시간에 200 mg/kg씩을 경구투여하고, 1주일마다 체중변화를 측정하였다(Table 2). 일반식이를 한 쥐의 체중은 6주에 220.
- 실험동물의 기초식이와 고지혈증식이의 조성은 Table 1에 나타내었다. 고지혈증 식이는 기초식이에 beef tallow를 20.5%를 첨가한 양만큼 sucrose의 양에서 15.5%와 corn oil 5%에 해당하는 양만큼을 줄여 조제한 시료를 4주간 사육하여 고지혈증을 유발시켰다.
- 반응액에 시약 C(300 of sulfanilic acid / 5.0 mg N-1-naphthyl-ethylenediamine in 500 µL of 16.7% acetic acid) 2.0 mL를 넣어 실온에서 20분 동안 정치한 다음 550 nm에서 흡광도를 측정하여 표준 검량선에 준하여 혈청 중의 superoxide dismutase 활성을 측정하였다.
- 본시험의 사육환경은 온도 22±3℃, 상대습도 50±10%, 조명시간 12시간(07:00-19:00)로 설정된 경성대학교 약학대학 실험동물 사육실(TECNIPLAST, Italy)에서 실시되었다.
- 빙냉상에서 효소시약(lipoprotein lipase 10800 U, glycerol kinase 5.4 U, peroxidase 135000 U, L-α-glycero phosphooxidase 160 U 함유)을 효소시약 용해액[N,N-bis(2-hydroxyethyl) -2-aminomethane sulfonic acid 0.427 g/dL 함유]에 용해한 용액에 시료 20 µL에 조제한 효소시액 3.0 mL을 첨가한 후 37℃에서 10 분간 incubation하여 시약 blank를 대조로 파장 550 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 빙냉상에서 효소시약(phospholipase 3.9 U, choline oxidase 5.6 U, peroxidase 3.6 U, 4- aminoantipyrine 0.3252 mg 함유)을 효소시약 용해액[tris(hydroxymethyl)-aminomethane 6.057 mg 함유]에 용해한 용액에 시료 20 µL 조제한 효소시액 3.0 mL을 첨가한 후 37℃에서 20분간 incubation하여 파장 500 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.
- 시료의 투입이 끝난 실험동물을 CO2로 가볍게 마취시켜 복부 대동맥으로부터 혈액을 채취하였고, 채취한 혈액은 30분간 방치한 후 3,000 rpm에서 10분간 원심 분리하여 혈청을 분리하여 지질, lipid peroxide, hydroxyl radical 함량 및 superoxide dismutase 활성 측정에 사용하였다.
- 간조직은 세절한 다음 teflon homogenizer로 마쇄하였으며, 시료에 10배량의 용매(chloroform:methanol=2:1)를 첨가하여 지질을 반복 추출한 후 여과액을 수기에 넣고 감압 농축하여 지질을 얻었다. 이에 메탄올을 가하여 잘 용해시킨 후 효소법을 이용한 kit를 사용하여 정량하였다.
- 체중 변화는 실험 개시일로부터 1주일마다 측정하였으며, 실험동물을 처리하기 24시간 전에 측정하여 최초무게에 대한 체중변화를 산출하였다. 지방 조직의 무게는 복강 및 고환주위의 지방을 채취하여 산출하였다.
- 체중 변화는 실험 개시일로부터 1주일마다 측정하였으며, 실험동물을 처리하기 24시간 전에 측정하여 최초무게에 대한 체중변화를 산출하였다. 지방 조직의 무게는 복강 및 고환주위의 지방을 채취하여 산출하였다.
- 3 mL를 가하여 원심분리 하였다. 침전물만을 취하여 증류수 4.0 mL와 0.67% thiobarbituric acid와 acetic acid를 1:1로 혼합한 용액을 1.0 mL를 가하고 95℃에서 60분간 반응시켜 실온에서 냉각 후 n-BuOH을 5.0 mL를 첨가하여 3000 rpm에서 15분간 원심분리한 후 생성된 홍색의 n-BuOH을 취해 spectrofluorometer를 사용하여(Ex:515 nm, Em:553 nm) 흡광도를 측정하였다. 표준 용액으로 tetraethoxypropane 0.
- 동물실험검증재료로서 톳 분말, 톳 ethanol 추출물, 톳 ethanol 추출잔사물을 사용하였고, 생리식염수로 희석한 4% tween 80을 사용하여 실험동물에 투여하였다. 투여 용량과 기간은 예비실험을 행한 후, 각 시료를 본 실험에 효과가 있는 것으로 사료되는 용량인 체중 kg당 200 mg 용량으로 정하여 6주간 각각의 실험군에 경구용 needle zonde을 사용하여 1일 1회 일정한 시간에 투여하였다.
대상 데이터
- 동물실험검증재료로서 톳 분말, 톳 ethanol 추출물, 톳 ethanol 추출잔사물을 사용하였고, 생리식염수로 희석한 4% tween 80을 사용하여 실험동물에 투여하였다. 투여 용량과 기간은 예비실험을 행한 후, 각 시료를 본 실험에 효과가 있는 것으로 사료되는 용량인 체중 kg당 200 mg 용량으로 정하여 6주간 각각의 실험군에 경구용 needle zonde을 사용하여 1일 1회 일정한 시간에 투여하였다.
- 본 시험에 사용한 SPF Sprague Dawley(SD)계 흰쥐 및 20-50 g의 ICR계 쥐를 (주) BioLink(충북 음성)로부터 구입한 후 1주일 간 검역과 순화·사육을 거쳐 건강한 동물만을 실험에 이용하였다.
- 본 실험에 사용된 톳은 동해안산 톳(Hizikia fusiformis)으로 건조된 것을 주문진 수산시장에서 구입, 분말화하여 사용하였다. 톳 ethanol 추출물과 추출잔사물 제조는 분말화 된 시료(200 g as dry weight)를 1,000 mL Erlenmeyer flask에 넣은 후 95% ethanol을 시료량의 4배(w/v) 첨가한 후에 30℃에서 30분 동안 sonication한 후 감압 여과하여 추출물과 추출잔사물로 분리하였다.
- 본시험의 사육환경은 온도 22±3℃, 상대습도 50±10%, 조명시간 12시간(07:00-19:00)로 설정된 경성대학교 약학대학 실험동물 사육실(TECNIPLAST, Italy)에서 실시되었다. 사료는 실험동물용 고형사료(삼양사료, 대전)를 음수는 수도수를 자유 섭취시켰다. 실험 시간 전 24시간 동안 물만 주고 절식하였다.
데이터처리
- 본 실험에서 얻어진 결과는 평균치±표준편차로 표시하였고, 통계적 유의성 검증은 Duncan's multiple range test로 그 유의성을 나타내었다.
이론/모형
- Chen (1956)등의 효소법에 의하여 조제된 kit(Iatron Chem. Co.)를 사용하여 실험하였다. 빙냉상에서 효소시약(phospholipase 3.
- Kobatake (1987)등의 방법에 따라 혈청 34.8 µL에 0.54 M NaCl, 0.1 M potassium phosphate buffer(pH 7.4), 10 mM NaN3, 7 mM deoxyribose, 5 mM ferrous ammonium sulfate 및 증류수로서 333.3 µL가 되도록 첨가하여 vortex에서 잘 혼합하여 37℃ 에서 15 분간 정치하였다.
- Low density lipoprotein-cholesterol(LDL-C) 함량은 Fridewald(Fridewald WT et al., 1972)등의 방법에 따라 다음의 식에 의하여 산출하였다.
- McGowan (1983)등의 방법에 준하여 조제된 kit(AM 157S-K, Asan)를 사용하여 실험하였다. 빙냉상에서 효소시약(lipoprotein lipase 10800 U, glycerol kinase 5.
- Noma (1986)등의 효소법에 의하여 조제된 kit(AM 203-K, Asan)를 사용하여 실험하였다. 혈청 20 µL에 침강시약(dextran sulfate 0.
- Oyanagui (1984)의 방법에 따라 정량하였다. 혈청을 potassium phosphate buffer로써 100배 희석하여 그 중의 100 µL를 시험관에 넣고 여기에 재증류수 500 µL, 시약 A(3 mM hydroxylamine / 3 mM hypoxanthine) 200 µL 및 시약 B(7.
- Richmond (1976) 등의 효소법에 의하여 조제된 kit(AM 202-K, Asan)를 사용하여 실험하였다. 빙냉상에서 효소시약(cholesterol esterase 20.
- Sulfo-phospho-vanillin reaction의 원리를 이용한 Fringe 와 Dunn (1970)의 방법에 의하여 지질을 진한 황산과 함께 가열 한 후 vanillin 인산을 가하여 나타나는 핑크색을 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준 검량선에 준해 혈중 함량은 mg/dL로 표시하였다.
- Yagi (1987) 등의 방법에 따라 혈청 20 µL에 1/12 N H2SO4 4.0 mL를 가하여 혼합하고 10% phosphotungstic acid 0.5 mL를 가하여 실온에서 5분간 방치한 후 원심분리 하여 침전물인 혈청단백질만 취해서 다시 1/12 N H2SO4 2.0 mL와 10% phosphotungstic acid 0.3 mL를 가하여 원심분리 하였다.
- 간조직은 중량을 측정한 뒤 -70℃에 냉동 보관하였으며, 중성지방과 콜레스테롤 측정은 Folch (1957)등의 방법에 따라 추출 하였다. 간조직은 세절한 다음 teflon homogenizer로 마쇄하였으며, 시료에 10배량의 용매(chloroform:methanol=2:1)를 첨가하여 지질을 반복 추출한 후 여과액을 수기에 넣고 감압 농축하여 지질을 얻었다.
- 단백질의 함량은 Lowry (1951)등의 방법에 준하여 bovine serum albumin(Fr. V, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)을 표준 품으로 하여 측정하였다.
성능/효과
- 2%정도 무게가 증가한 비만쥐가 되는 것으로 나타났다. 2주까지 시료의 투여가 체중감소에 효과를 나타내지 않았으나 실험 3주부터는 톳 분말과 톳 ethanol 추출잔사물이 대조군에 비하여 체중이 유의적으로 감소하는 것으로 나타났으며 톳 ethanol 추출잔사물을 투여는 6주 후에 체중감소 효과를 나타냈다. 시료 투여 6주째 톳 분말과 톳 ethanol 추출잔사물이 295.
- 간 조직중 총지질 함량은 식이성 고지혈증 유도군이 34.9±2.2 mg/g로 정상식이군 16.8±2.0 mg/g에 비하여 유의적으로 증가하였다.
- 고지혈증 유도 흰쥐의 인지질 함량은 148.7±10.2 mg/dL로 정상식이군의 120.4±14.6 mg/dL에 비하여 유의하게 증가하였고, 고지혈증을 유도한 흰쥐에게 톳 분말과 톳 ethanol 추출잔사물 첨가군이 140.7±10.7 mg/dL, 133.6±10.4 mg/dL로 고지혈증 유도군에 비하여 감소하였다.
- 6 MDA nmol/mg에 비해 유의적으로 증가하였다. 고지혈증을 유도한 흰쥐에게 톳 시료를 투여 한 결과 TBARS 농도가 모든 실험군이 유의적으로 감소하였다. 이 결과 톳 분말과 톳 ethanol 추출물, 톳 ethanol 추출잔사물 투여가 지질산화억제를 나타냈는데, 톳 분말과 톳 ethanol 추출물, 톳 ethanol 추출잔사물의 항산화능이 이러한 질환을 예방하는 데 효과적일 것으로 사료된다.
- 그리고 콜레스테롤의 함량은 고지혈증 유도군이 6.3±0.4 mg/g으로 정상식이군 2.6±0.5 mg/g에 비하여 유의적으로 증가하였다.
- , 1975; Ross R, 1986). 따라서 본 연구결과 톳 분말과 톳 ethanol 추출잔사 첨가로 유의적인 차이는 보이지 않았지만 수치적으로 HDL-콜레스테롤 함량은 증가, LDL-콜레스테롤 함량이 감소되었으며, 심혈관 위험지수 및 동맥경화지수가 유의적으로 감소되어진 것으로 보아 톳 분말과 톳 ethanol 추출물이 심혈관계 질환의 억제 효과 및 고지혈증 개선 효과가 있을 것으로 사료되어 진다.
- 복강 지방조직의 무게는 식이성 고지혈증 유도군이 정상식이군에 비하여 증가되었고, 식이성 고지혈증을 유도한 쥐에게 톳 시료를 4주간 경구투여한 후 지방조직의 양을 측정한 결과 복강주위 지방 무게는 시료간에 유의적인 차이를 보이지 않았지만, 톳 분말과 톳 ethanol 추출잔사물 투여가 복강주위 지방 무게를 감소시켰는데 특히 톳 ethanol 추출잔사물 200 mg/kg을 투여하였을 경우 감소율이 가장 높았으며, 12.1±1.3 mg/g으로 대조군 14.9±2.1 mg/g보다 23.1%정도 감소하였다.
- 부고환지방조직의 무게는 실험군이 대조군과 비교하여 유의적인 차이를 보이지 않았지만, 톳 분말과 톳 ethanol 추출잔사물투여가 부고환지방조직의 무게를 감소시켰는데 특히 톳 ethanol 추출잔사물 200 mg/kg을 투여하였을 경우 감소율이 가장 높았으며 10.9±1.1 mg/g으로 대조군 14.9±2.1 mg/g보다 36.7%정도 감소하였다.
- 시료 투여 6주째 톳 분말과 톳 ethanol 추출잔사물이 295.7±17.4 g, 285.4±16.5 g으로 대조군보다 각각 12.1%, 16.2% 감소한 것으로 나타나 톳 분말과 톳 ethanol 추출잔사물이 체중감소에 효과가 있음을 알 수 있었다.
- 식이성 고지혈증을 유도한 흰쥐의 혈중 콜레스테롤의 함량이 91.6±5.2 mg/dL로 정상식이군의 56.8±6.3 mg/dL에 비하여 유의하게 감소하였다.
- 실험군 모두 고지혈증 유도군에 비해 중성지방의 함량이 감소하였고 특히 톳 ethanol 추출잔사물이 173.4±9.9 mg/dl로 15.5%정도로 유의적으로 감소하였다.
- 고지혈증을 유도한 흰쥐에게 톳 시료를 투여 한 결과 TBARS 농도가 모든 실험군이 유의적으로 감소하였다. 이 결과 톳 분말과 톳 ethanol 추출물, 톳 ethanol 추출잔사물 투여가 지질산화억제를 나타냈는데, 톳 분말과 톳 ethanol 추출물, 톳 ethanol 추출잔사물의 항산화능이 이러한 질환을 예방하는 데 효과적일 것으로 사료된다.
- , 1994), 본 동물실험 결과 톳 분말, 톳 ethanol 추출물과 그 추출잔사를 경구투여 한 후 활성산소를 제거하는 SOD효소의 양이 유의적인 차이를 보이지는 않았지만 체내 대표적인 활성radical인 hydroxyl radical양에 있어서는 톳 ethanol 추출잔사물 식이 군에서 가장 낮게 유지되고 있었다. 이는 톳 ethanol 추출잔사물이 체내 항산화효과를 톳 시료군 중에서 가장 큰 효과가 있음을 동물실험으로 확인할 수 있었다.
- 톳 시료 투여군 모두 고지혈증 유도군에 비해 간 조직중 콜레스테롤함량이 유의적 차이는 나타나지 않았지만 수치적으로 감소하였음을 알 수 있었다. 이상의 결과 톳 분말과 톳 ethanol 추출물, 톳 ethanol 추출잔사물 첨가가 고지혈증 유도로 증가된 간의 총지질, 중성지방 및 콜레스테롤 함량을 유의적이지 않지만 수치적으로 감소시키는 효과를 확인하였다.
- 7%정도 감소하였다. 이상의 연구 결과 고지혈증 식이를 급여한 흰쥐에게 톳 분말과 톳 ethanol 추출잔사물의 첨가가 체중감소효과와 복강조직의 축적억제 효과에 영향을 미치는 것으로 사료된다.
- 일반식이를 한 쥐의 체중은 6주에 220.8±28.6 g이고 고지방식이를 한 쥐는 331.7±31.7 g으로 50.2%정도 무게가 증가한 비만쥐가 되는 것으로 나타났다.
- 톳 분말, 톳 ethanol 추출물과 톳 ethanol 추출잔사물을 각각 200 mg/kg을 경구투여한 결과 1.5±0.1 mg/dL, 1.7±0.1 mg/dL와 1.3±0.1 mg/dL로 유의적으로 감소하였다.
- 6 mg/dL에 비하여 유의하게 증가하였다. 톳 분말과 톳 ethanol 추출물, 톳 ethanol 추출잔사물 200 mg/kg 투여는 고지혈증 유도군과 비교하여 LDL-콜레스테롤함량이 감소하였지만 유의적인 차이를 보이지 않았다.
- 톳 시료 투여군 모두 고지혈증 유도군에 비해 Hydroxyl radical의 생성량이 감소하였지만 톳 분말 투여군과 톳 ethanol 추출물 투여군이 유의적인 차이를 보이지 않은 반면에 톳 ethanol 추출잔사물이 5.6±0.2 nmol/mg로 유의적으로 감소하였다.
- 톳 시료 투여군 모두 고지혈증 유도군에 비해 간 조직중 중성지질 함량이 유의적인 감소를 보이지 않았지만, 톳 ethanol 추출잔사물 200 mg/kg 경구 투여가 24.8±1.0 mg/g으로 6% 감소하였다.
- 5 mg/g에 비하여 유의적으로 증가하였다. 톳 시료 투여군 모두 고지혈증 유도군에 비해 간 조직중 콜레스테롤함량이 유의적 차이는 나타나지 않았지만 수치적으로 감소하였음을 알 수 있었다. 이상의 결과 톳 분말과 톳 ethanol 추출물, 톳 ethanol 추출잔사물 첨가가 고지혈증 유도로 증가된 간의 총지질, 중성지방 및 콜레스테롤 함량을 유의적이지 않지만 수치적으로 감소시키는 효과를 확인하였다.
- 톳 시료 투여군 모두 고지혈증 유도군에 비해 총지질 함량이 감소하였는데 특히 톳 ethanol 추출잔사물 200 mg/kg을 경구 투여한 경우 29.9±1.2 mg/g으로 대조군에 비해 유의적으로 감소하였다.
- 혈청중 HDL-콜레스테롤의 함량은 식이성 고지혈증 유도군이 31.8±1.1 mg/dL로 정상식이군 41.6±2.4 mg/dL에 비하여 유의하게 감소하였다.
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