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문제 정의
- nomurai에서는 아직까지 보고된 바가 없다. 따라서 본 연구는 N. nomurai의 선천면역에 관계할 것으로 예측되는 물질을 추출 하여 여러 균주에 대해 항균활성을 측정하고, 항균활성 물질을 정제하여 기능성식의약소재로서의 이용가능성을 살펴보고자 수행하였다.
제안 방법
- JAP-14 µL 에 trypsin(1 mg/mL) 1 µL를 첨가하고 무처리군으로는 증류수1 µL를 첨가하여 37℃에서 1시간 반응시킨 후 URDA방법으로 활성의 변화를 측정하였다.
- N. nomurai 추출물 및 JAP-14 µL에 trypsin(1 mg/ mL) 1 µL를 첨가하여 37℃에서 1시간 반응시킨 뒤, URDA방법으로 활성 변화를 측정하였으며, 대조군으로 추출물 및 JAP-14 µL에 증류수 1 µL를 첨가한 것을 사용하였다.
- N. nomurai 추출물 및 정제된 물질(JAP-1)이 단백질성 물질인지를 확인하기 위해서 trypsin 처리 전, 후의 항균활성 변화를 확인 하였다. N.
- N. nomurai 추출물의 항균활성을 확인하기 위해서 URDA 방법을 이용하여 그람 양성균 3종, 그람 음성균 3종 및 yeast 1종에 대한 항균활성을 측정하였다(Table 2). 그 결과 추출물은 B.
- 위에서 열거한 균주들에 대해 항균활성을 나타낸 추출물은 역상 HPLC column, 이온교환 column을 사용한 4단계의 정제 과정을 거쳐 하나의 순수한 항균활성물질 JAP-1을 정제하였다. 첫 번째 정제 과정으로 Capcell-Pak C18 column(4.
- 인간의 적혈구를 이용하여 용혈활성을 측정하였다. 사람의 혈액에 동량의 50 mM phosphate buffered saline(PBS)을 넣고 혼합한 후 800 rpm에서 15분간 원심분리하여 상징액은 버리고 침전물을 얻었다.
- 동결된 whole body에 4배량의 1% acetic acid(v/v)를 첨가하여 100℃에서 5분 동안 끊여 해파리 유래 자가효소를 불활성화 시키고, 곧바로 얼음에 보관하여 충분히 냉각을 시킨 후에 homogenizer(T10 basic ULTRA-TURRAX, IKA, USA)를 사용하여 조직을 파쇄 시켰다. 조직 파쇄액은 4℃에서 30분 동안 13,000 x g로 원심분리(VS-21SMT, Vision Scientific, Buchon, Korea)를 행한 후에 상층액을 취해서 항균활성 측정 및 물질의 정제에 사용하였다.
- 즉, 95% A 용매(0.1% TFA in HPLC grade water)와 5% B 용매(0.1% TFA in HPLC CH3CN)로 평형화시킨 Capcell-Pak C18 column(4.6 mm×250 mm, Shiseido, Japan)에 시료를 주입한 후, 60분간 용매 B(5-65%)의 농도구배로 용출시켰다.
- 위에서 열거한 균주들에 대해 항균활성을 나타낸 추출물은 역상 HPLC column, 이온교환 column을 사용한 4단계의 정제 과정을 거쳐 하나의 순수한 항균활성물질 JAP-1을 정제하였다. 첫 번째 정제 과정으로 Capcell-Pak C18 column(4.6 mm X 250 mm, Shiseido, Japan)을 이용하여 분리된 각각의 획분들을 URDA방법으로 활성을 측정한 결과, 항균활성은 21분에서 31분 사이에 용출된 획분에서 항균활성이 나타났으며, 그중 가장 항균 활성이 좋은 28분대의 획분을 받아서 이후 정제과정을 수행하였다(Fig. 1). 다음 단계로 anion exchange column인 TSKgel SP-5PW column(7.
- 최종 정제된 JAP-1의 분자량은 MALDI-TOF MS spectrometer (Voyager-DETM PRO spectrometer, Perseptive Biosystems, USA)를 사용하여 측정하였다. Matrix는 α-cyano-4-hydroxycinamic acid를 사용하였으며, standard는 Calmix 2를 사용하였다.
- 최종 정제된 JAP-1이 단백질성 물질인지를 확인하기 위하여 protease 처리 전,후의 활성 존재 유무를 확인하였다. JAP-14 µL 에 trypsin(1 mg/mL) 1 µL를 첨가하고 무처리군으로는 증류수1 µL를 첨가하여 37℃에서 1시간 반응시킨 후 URDA방법으로 활성의 변화를 측정하였다.
- 5 mm×75 mm, Tosoh, Japan)에 주입한 후, 100분간 NaCl(0-1 M) 농도구배로 분리하였다. 항균활성이 확인된 획분은 첫 번째 정제과정과 동일한 컬럼 및 용매 조건으로 35분간 용매 B(5-40%)를 이용한 농도구배로 용출하고, 최종적으로 23% B를 이용한 isocratic 조건에서 단일 peak로 정제하였다.
- 해파리 추출물은 HPLC(Agilent 1100, California, USA)를 이용하여 활성물질을 분리 정제하였다. 즉, 95% A 용매(0.
대상 데이터
- 실험에 사용된 균주는 그람 양성균 3종(Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Streptococcus iniae) 그람 음성균 3종(Escherichia coli D31, Vibrio parahaemolyticus, Aeromonas hydrophila) 및 yeast 1종(Candida albicans)을 사용하였으며, 각 균주의 배양 배지 및 온도는 Table 1과 같다. 항균활성 측정 방법으로는 서로 다른 농도를 포함한 두 층의 배지를 사용하는 ultrasensitive radial diffusion assay(URDA)법을 이용하였다(Lehrer at al, 1991).
- 실험에 사용한 N. nomurai는 국립수산과학원 어장환경과에서 제공받아, 해파리 whole body를 실험에 사용하였으며, 모든 시료는 사용하기 전까지 -23℃에 보관하였다.
- 얻어진 적혈구 100 µL를 96-well microplate에 도입시키고 해파리 정제물질, JAP-1 100 µL를 가한 다음 37℃에서 30분간 반응시켰으며, 이후 반응액을 10분간 1,500 rpm에서 원심분리 하여 얻어진 상등액 100 µL를 새로운 microtiter plate로 옮긴 후 헤모글로빈 유출 정도를 490 nm에서 측정하였다. 적혈구의 100% 용혈을 위한 실험 대조구로는 triton X-100(0.1%)을 사용 하였다.
- Louis, MO, USA)에서 각각 구입하여 사용하였다. 정제 과정에서 사용된 HPLC용 water와 acetonitrile(CH3CN)은 Tedia사(Ohio, USA) 로부터 구입하였고, 그 이외의 모든 시약은 특급을 사용하였다.
- 항균활성 측정을 위한 tryptic soy broth(TSB)는 Merck 사(Merck, Darmstadt, Germany), agarose Type I(Low EEO Agar)와 trifluoroacetic acid(TFA)는 Sigma사(St. Louis, MO, USA)에서 각각 구입하여 사용하였다. 정제 과정에서 사용된 HPLC용 water와 acetonitrile(CH3CN)은 Tedia사(Ohio, USA) 로부터 구입하였고, 그 이외의 모든 시약은 특급을 사용하였다.
이론/모형
- 또한 JAP-1의 분자량을 측정하기 위하여 MALDI-TOF MS spectrometer(Voyager-DETM PRO spectrometer, Perseptive Biosystems, USA)를 이용하였다. Matrix는 α-cyano-4- hydroxycinamic acid를 사용하였으며, Standard는 calmix 2를 사용하였다.
- 6 mm×250 mm, Shiseido, Japan)에 시료를 주입한 후, 60분간 용매 B(5-65%)의 농도구배로 용출시켰다. 이때, 유속은 1.0 mL/min 로 유지하였으며, 각각의 분리된 획분은 URDA방법으로 B. subtilis KCTC1021에 대한 항균 활성을 측정하였다. 얻어진 획분은 10 mM phosphate buffer(PB, pH 6.
- 실험에 사용된 균주는 그람 양성균 3종(Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Streptococcus iniae) 그람 음성균 3종(Escherichia coli D31, Vibrio parahaemolyticus, Aeromonas hydrophila) 및 yeast 1종(Candida albicans)을 사용하였으며, 각 균주의 배양 배지 및 온도는 Table 1과 같다. 항균활성 측정 방법으로는 서로 다른 농도를 포함한 두 층의 배지를 사용하는 ultrasensitive radial diffusion assay(URDA)법을 이용하였다(Lehrer at al, 1991). URDA에 사용된 균주는 우선 각각의 배지 및 배양온도에서 18시간 동안 pre-culture 후 BioMerieux Vitek, Inc.
성능/효과
- 이들은 그람 양성균, 그람 음성균 및 fungi에도 항균활성을 나타냈다. JAP-1 또한 trypsin의 기질특이성을 바탕으로 lysine 또는 argnine을 분자내에 함유하는 분자량이 680.1 Da인 penta- 또는 hexapeptide로 예상되어 지며, EP와 같이 부분적으로 modification이 된 상태로 존재할 가능성도 충분할 것으로 사료된다. 현재 Peptide의 1차구조는 peptide sequencer를 이용하여 분석중에 있으며, 길이가 짧은 peptide의 경우에는 인공적으로 합성이 용이하며 그에 따른 경제적인 비용의 측면에서 새로운 기능성 식의약소재로서의 개발 가능성이 충분할 것으로 사료된다.
- (2005)은 Pseudoplectania nigrella로 부터 plectasin을 정제하였다. Plectasin은 95개의 아미노산으로 이루어진 defensin 계열의 항균활성 peptide로 동물세포에 독성을 보이지 않으며 그람 음성균에 대해서는 항균활성이 거의 없지만 그람 양성 세균에 대해서는 강력한 활성을 나타냈다. 이와 유사하게 해파리 추출물 또한 그람 음성균주 보다는 그람 양성균주에 대해 높은 감수성을 나타냈으며, 특히 방어, 넙치, 조피볼락등에서 β용혈 구균 증을 일으키는 어병세균인 S.
- JAP-14 µL 에 trypsin(1 mg/mL) 1 µL를 첨가하고 무처리군으로는 증류수1 µL를 첨가하여 37℃에서 1시간 반응시킨 후 URDA방법으로 활성의 변화를 측정하였다. 그 결과 trypsin을 처리한 JAP-1은 항균활성이 완전히 소실된 반면 trypsin을 처리하지 않은 JAP-1에서는 항균활성이 유지 되었다(Fig. 4). 이러한 결과로 JAP-1은 trypsin에 의해 분해가 되는 단백질성 물질일 것으로 판단된다.
- nomurai 추출물의 항균활성을 확인하기 위해서 URDA 방법을 이용하여 그람 양성균 3종, 그람 음성균 3종 및 yeast 1종에 대한 항균활성을 측정하였다(Table 2). 그 결과 추출물은 B. subtilis에 대해서 clear zone이 7.0 mm로 가장 강한 항균활성을 나타내었으며 S. iniae에서는 3.9 mm의 활성을 나타내었다. 반면 S.
- 모든 sample은 0.01% acetic acid(pH 4.0)에 녹여 활성을 측정하였으며, negative control로 0.01% acetic acid(pH 4.0) 5 µL 를 사용하여 용매에 의한 영향이 없음을 확인하였다.
- 이와 유사하게 해파리 추출물 또한 그람 음성균주 보다는 그람 양성균주에 대해 높은 감수성을 나타냈으며, 특히 방어, 넙치, 조피볼락등에서 β용혈 구균 증을 일으키는 어병세균인 S. iniae에 대해 활성을 가지는 것으로 보아서 넙치등의 양식장에서 해파리 추출물을 천연 항생제로서 이용 가능할 수도 있을 것으로 판단된다.
- 이후 활성이 확인된 음이온 column에 흡착하지 않는 획분을 모아 Capcell-Pak C18 column(4.6 mm×250 mm)에 적용시켜 분리한 결과 2개의 major peak가 나타났다(Fig. 2).
- Matrix는 α-cyano-4- hydroxycinamic acid를 사용하였으며, Standard는 calmix 2를 사용하였다. 측정결과 681.10 [M+H]+ mass data가 얻어졌으며, 이를 바탕으로 JAP-1의 분자량은 680.10 Da 으로 판단된다 (Fig. 5). 따라서 JAP-1은 아미노산이 5-6개정도로 이루어진 짧은 peptide일 것으로 예측된다.
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