본 연구에서는 노무라입깃해파리(Nemopilema nomurai) 가수분해 추출물의 미백활성에 대하여 검색하였다. 가수분해 시료(NHE, N. nomurai Hydrolized Extract)는 노무라입깃해파리를 상업용 단백질분해효소(Protamex, Alcalase, Flavourzyme, Neutrase)를 이용하여 $55^{\circ}C$에서 pH 5-8 조건으로 처리하는 과정을 거쳐 얻었다. 미백활성은 B16-F1 멜라노마 세포에서 멜라닌 색소 합성 저해능 평가를 통하여 확인하였다. 실험결과, Neutrase로 처리된 시료(N-NHE)에서 $100{\mu}g/mL$의 농도에서 멜라닌 생성이 가장 효율적으로 89.9% 감소되는 것을 관찰하였다. 이 시료는 또한 tyrosinase와 TRP-1 (tyrosinase related protein-1) 단백질의 발현을 억제하였다. 이상의 연구 결과는 노무라입깃해파리 가수분해 추출물의 화장품 미백 소재로의 개발 가능성을 보여주고 있다.
본 연구에서는 노무라입깃해파리(Nemopilema nomurai) 가수분해 추출물의 미백활성에 대하여 검색하였다. 가수분해 시료(NHE, N. nomurai Hydrolized Extract)는 노무라입깃해파리를 상업용 단백질분해효소(Protamex, Alcalase, Flavourzyme, Neutrase)를 이용하여 $55^{\circ}C$에서 pH 5-8 조건으로 처리하는 과정을 거쳐 얻었다. 미백활성은 B16-F1 멜라노마 세포에서 멜라닌 색소 합성 저해능 평가를 통하여 확인하였다. 실험결과, Neutrase로 처리된 시료(N-NHE)에서 $100{\mu}g/mL$의 농도에서 멜라닌 생성이 가장 효율적으로 89.9% 감소되는 것을 관찰하였다. 이 시료는 또한 tyrosinase와 TRP-1 (tyrosinase related protein-1) 단백질의 발현을 억제하였다. 이상의 연구 결과는 노무라입깃해파리 가수분해 추출물의 화장품 미백 소재로의 개발 가능성을 보여주고 있다.
This study was aimed to investigate skin whitening effects of Nomura's jellyfish (Nemopilema nomurai) hydrolyzed extracts (NHE). The extracts were prepared through the hydrolysis of N. nomurai using commercial proteolytic enzymes such as Protamex, Alcalase, Flavourzyme and Neutrase with optimum pHs ...
This study was aimed to investigate skin whitening effects of Nomura's jellyfish (Nemopilema nomurai) hydrolyzed extracts (NHE). The extracts were prepared through the hydrolysis of N. nomurai using commercial proteolytic enzymes such as Protamex, Alcalase, Flavourzyme and Neutrase with optimum pHs (pH 5-8) at $55^{\circ}C$. Their whitening activities were examined from the inhibition of melanin synthesis using B16-F1 cell lines. Among the examined samples, Neutrase-treated extract (N-NHE) showed the most significant inhibition effect on melanin synthesis by 89.9% at a concentration of $100{\mu}g/mL$. This sample decreased the expression of tyrosinase and TRP-1 (tyrosinase related protein-1) proteins as well. These results suggested the potential application of NHE as whitening ingredients in cosmetic preparation.
This study was aimed to investigate skin whitening effects of Nomura's jellyfish (Nemopilema nomurai) hydrolyzed extracts (NHE). The extracts were prepared through the hydrolysis of N. nomurai using commercial proteolytic enzymes such as Protamex, Alcalase, Flavourzyme and Neutrase with optimum pHs (pH 5-8) at $55^{\circ}C$. Their whitening activities were examined from the inhibition of melanin synthesis using B16-F1 cell lines. Among the examined samples, Neutrase-treated extract (N-NHE) showed the most significant inhibition effect on melanin synthesis by 89.9% at a concentration of $100{\mu}g/mL$. This sample decreased the expression of tyrosinase and TRP-1 (tyrosinase related protein-1) proteins as well. These results suggested the potential application of NHE as whitening ingredients in cosmetic preparation.
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문제 정의
N-NHE의 효능은 대조군인 arbutin 보다 우수하였다. 멜라닌 저해 작용기전을 확인하기 위하여 멜라닌 합성 관련 단백질의 발현 양상을 분석하였다. 그 결과 멜라닌 합성에 관여하는 효소인 tyrosinase, TRP-1의 단백질 발현을 억제하였다.
본 연구는 노무라입깃해파리 유래 추출물의 미백 기능성화장품 원료로서의 유효성을 규명하고 산업소 재화의 가능성을 확인하기 위하여 수행되었다. 본 연구에서는 고형성분의 해파리를 단백질 분해효소로 가수분해한 후 얻은 수용성 분해물(NHE, N.
본 연구에서는 노무라입깃해파리해파리(N. nomurai) 가수분해물을 화장품의 새로운 미백소재로 이용하고자 해파리 추출물을 효소처리한 후 미백활성을 측정하고, 그 작용기전에 대해 확인하였다. 해파리 가수 분해물(NHE, N.
MITF는 멜라닌 합성 과정에서 중요한 전사 조절 인자로 tyrosinase, TRP-1, TRP-2의 전사를 촉진한다[23-25]. 본 연구에서는 해파리가수분해물(N-NHE)의 미백효과 검증을 위해 멜라닌 합성 관련 단백질인 tyrosinase, TRP-1, TRP-2의 발현 정도를 측정하였다. 10, 50, 100 µg/mL 농도의 N-NHE를 B16-F1 melanoma cell에 처리한 후 72 h 배양한 뒤 단백질을 모아 Western blot assay를 수행하였다.
제안 방법
10, 50, 100 µg/mL 농도의 N-NHE를 B16-F1 melanoma cell에 처리한 후 72 h 배양한 뒤 단백질을 모아 Western blot assay를 수행하였다.
Membrane을 5% skim milk solution으로 1 h 동안 blocking한 뒤 primary antibody로 상온에서 3 ∼ 4 h 동안 반응시키고, horseradish peroxidase가 결합된 secondary antibody로 처리하였다. Chemiluminescence kit을 이용하여 발색된 밴드의 강도를 확인하였다. 각각의 시료에 동량의 단백질이 들어있는지 확인하기 위한 대조군으로 β-actin을 사용하였다.
Neutrase 가수분해물인 N-NHE를 멜라닌 생합성 자극제인 α-MSH (melanin stimulating hormone)와 함께 처리한 실험을 진행하였다.
흡광도 측정은 Molecular Devices (USA)의 SpectraMax M5 microplate reader를 사용하였다. Western blot을 위해 Invitogrn (USA)의 western blot kit 및 transfer system을 사용하였고 LAS-3000 imaging system (Japan)을 이용하여 결과를 확인하였다. 실험에 이용된 항체는 Santa Cruz Biotech (USA), Cell Signaling Technology (USA)에서 구입하였다.
각각의 NHE를 10, 50, 100 µg/mL의 농도로 처리하고 72 h이 지난 후 490 nm에서 멜라닌 생성량을 측정하였다 (Figure 2).
즉, NHE는 금속 구리(Cu)가 자리잡고 있는 티로시나제 활성자리에 접근하여 활성을 억제하는 효과 는 없는 것으로 판단된다. 다음으로 가수분해물(NHE)이 멜라닌 합성에 미치는 영향을 확인하기 위해 B16-F1 melanoma cell을 실험에 이용하였다. MTT assay에서와 마찬가지로 4가지 종류의 단백질분해효소 (Protamex, Alcalase, Flavourzyme, Neutrase) 및 산 (tartaric acid)으로 처리한 해파리 가수분해물(P-NHE, A-NHE, F-NHE, N-NHE)을 시료로 사용하였다.
대조군은 시료를 처리하지 않은 배양액으로 설정한 후 흡광도를 측정하였다. 세포의 생존능력은 다음의 식에 따라 계산하였다.
배양액을 제거하고 시료를 농도별로 배지에 희석하여 교체한 후, 50 nM α -MSH가 되도록 첨가하여 72 h 동안 더 배양하였다. 대조군은 용매만 첨가한 것으로 하였으며 양성 대조군으로는 알부틴을 사용하였다. 배양 후 배양액을 제거하고 PBS로 세척한 후, 10% DMSO가 함유된 1 N NaOH를 첨가한 후 50 ℃ 항온조에서 세포 내 멜라닌을 용해시켰다.
동결된 해파리에서 중량의 10배수에 해당하는 100% 에탄올을 첨가하여 불순물을 제거하였다. 해파리 중량의 2배수 물을 첨가한 후 Protamex, Flavourzyme, Neutrase, Alcalase 단백질분해효소 2%(해파리 중량 대비)를 첨가하여 55 ℃에서 3 h 가수분해하여 각각의 효소 가수분해물을 얻었다.
따라서, 본 실험에서는 세포 독성이 나타나지 않는 100 µg/mL 이하의 농도에서 멜라닌 합성 저해 및 단백질 발현 실험을 진행하였다.
멜라닌 함량 측정은 Oka의 방법[22]을 변형하여 사용하였다. B16-F1 melanoma cell을 24-well plate에 2×105 cells/well이 되게 준비한 한 후, 24 h 동안 37 ℃, CO2 항온기에서 배양하였다.
배양 후 배양액을 제거하고 시료를 농도 별로 배지에 희석하여 교체한 후, 최종 200 nM α -MSH가 되도록 첨가하여 48 h 동안 더 배양하였다. 배양 후 MTT assay를 통하여 세포 생존율을 확인하였다.
본 실험에서 B16-F1 melanoma cell에 대한 시료의 처리농도를 결정하기 위하여 MTT [3-(4,5-dimethythiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide] 시약을 이용하여 세포독성을 조사하였다[21]. 이 분석법은 살아있는 세포의 mitochondria dehydrogenase의 능력을 측정하는 방법으로서, dehydrogenase에 의하여 노란색의 수용성 기질인 MTT가 진청색의 비수용성 formazan으로 변환된다.
이때 세포의 여러 조건에서도 그 발현 정도의 차이가 거의 없는 housekeeping gene인 β-actin을 대조군으로 사용하였다.
nomurai Hydrolized Extract)을 얻었다. 최종 가수분해물을 동결건조하여 실험 시료 얻었다. Protamex, Flavourzyme, Neutrase, Alcalase로 처리된 최종 가수분해물(P-NHE, F-NHE, N-NHE, A-NHE)시료는 각각 동결 해파리 대비 1.
멜라닌은 멜라노좀에서 티로신으로부터 티로시나제 효소에 의한 산화반응을 거쳐 생합성된다. 해파리 가수분해물(NHE, N. nomurai Hydrolized Extract)이 in vitro 상에서 티로시나제 활성에 미치는 영향을 mushroom tyrosinase를 이용하여 측정하였다. 그 결과, 티로 시나제에 대한 저해 활성은 나타나지 않았다(data 미첨부).
동결된 해파리에서 중량의 10배수에 해당하는 100% 에탄올을 첨가하여 불순물을 제거하였다. 해파리 중량의 2배수 물을 첨가한 후 Protamex, Flavourzyme, Neutrase, Alcalase 단백질분해효소 2%(해파리 중량 대비)를 첨가하여 55 ℃에서 3 h 가수분해하여 각각의 효소 가수분해물을 얻었다. 각각의 효소 가수분해물에 1%(해파리 중량 대비)의 tartaric acid를 첨가하여 4 ℃에서 24 h 교반하여 산가수분해물을 얻었다.
대상 데이터
다음으로 가수분해물(NHE)이 멜라닌 합성에 미치는 영향을 확인하기 위해 B16-F1 melanoma cell을 실험에 이용하였다. MTT assay에서와 마찬가지로 4가지 종류의 단백질분해효소 (Protamex, Alcalase, Flavourzyme, Neutrase) 및 산 (tartaric acid)으로 처리한 해파리 가수분해물(P-NHE, A-NHE, F-NHE, N-NHE)을 시료로 사용하였다. 각각의 NHE를 10, 50, 100 µg/mL의 농도로 처리하고 72 h이 지난 후 490 nm에서 멜라닌 생성량을 측정하였다 (Figure 2).
각각의 시료에 동량의 단백질이 들어있는지 확인하기 위한 대조군으로 β-actin을 사용하였다.
각각의 NHE를 10, 50, 100 µg/mL의 농도로 처리하고 72 h이 지난 후 490 nm에서 멜라닌 생성량을 측정하였다 (Figure 2). 미백제로 기능성화장품 원료로 사용되고 있는 arbutin을 양성 대조군으로 사용하였다. Figure 2 에서 보이는 것처럼 Neutrase로 처리한 NHE (N-NHE) 에서 가장 우수한 멜라닌 생합성 저해효과를 관찰하 였다.
본 연구는 노무라입깃해파리 유래 추출물의 미백 기능성화장품 원료로서의 유효성을 규명하고 산업소 재화의 가능성을 확인하기 위하여 수행되었다. 본 연구에서는 고형성분의 해파리를 단백질 분해효소로 가수분해한 후 얻은 수용성 분해물(NHE, N. nomurai Hydrolized Extract)을 시료로 사용하였다.
해파리 가수 분해에 사용된 효소 Protamex, Flavourzyme, Neutrase, Alcalase는 대종상사(한국)에서 구입하였으며, tartaric acid와 CaCO3는 Sigma (USA)에서 구입하여 사용하였다. 세포배양에 필요한 배지 및 시약은 Gibco (USA), Sigma (USA)로부터 구입하여 사용하였다. 흡광도 측정은 Molecular Devices (USA)의 SpectraMax M5 microplate reader를 사용하였다.
세포주는 마우스 흑색종 세포주인 B16-F1 melanoma cell을 American Type Culture Collection (ATCC)에서 분양받아 사용하였으며, 세포배양에 사용된 배지 (Dulbecco’s modified Eagle’s medium; DMEM)는 10% fetal bovine serum (HyClone Lab., USA), 1% antibiotic antimycotic (100 U/mL penicillin, 50 µg/mL streptomycin, Life Tech Inc., USA)을 혼합한 배지를 사용하여 37 ℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다.
세포 수준의 연구에 많이 이용되고 있는 MTT assay는 cell proliferation과 viability의 in vitro 분석에 매우 유용하게 사용되고 있다 [21]. 실험 시료로 단백질분해효소(Protamex, Alcalase, Flavourzyme, Neutrase) 및 산(tartaric acid)으로 처리한 해파리 가수분해물(NHE, N. nomurai Hydrolized Extract) 을 사용하였다. Protamex, Alcalase, Flavourzyme 및 Neutrase로 처리한 NHE를 각각 P-NHE, A-NHE, F-NHE 및 N-NHE로 표기하였다.
실험에 사용한 노무라입깃해파리(N. nomurai)는 한국국립수산과학원에서 제공받아 사용하였으며, 모든 시료는 사용전까지 -78 ℃에 보관하였다. 해파리 가수 분해에 사용된 효소 Protamex, Flavourzyme, Neutrase, Alcalase는 대종상사(한국)에서 구입하였으며, tartaric acid와 CaCO3는 Sigma (USA)에서 구입하여 사용하였다.
Western blot을 위해 Invitogrn (USA)의 western blot kit 및 transfer system을 사용하였고 LAS-3000 imaging system (Japan)을 이용하여 결과를 확인하였다. 실험에 이용된 항체는 Santa Cruz Biotech (USA), Cell Signaling Technology (USA)에서 구입하였다.
nomurai)는 한국국립수산과학원에서 제공받아 사용하였으며, 모든 시료는 사용전까지 -78 ℃에 보관하였다. 해파리 가수 분해에 사용된 효소 Protamex, Flavourzyme, Neutrase, Alcalase는 대종상사(한국)에서 구입하였으며, tartaric acid와 CaCO3는 Sigma (USA)에서 구입하여 사용하였다. 세포배양에 필요한 배지 및 시약은 Gibco (USA), Sigma (USA)로부터 구입하여 사용하였다.
데이터처리
모든 실험 결과는 평균 ± 표준편차로 표기하였고 통계적 유의성은 SPSS를 이용한 Student’s t-test를 시행하여 p-value를 구하였으며, p < 0.05인 경우 *, p < 0.01인 경우 **로 유의성이 있다고 표시하였다.
이론/모형
2; 1% TritonX-100, 200 mM NaCl, protease inhibitor cocktail) 을 첨가하여 세포를 파괴한 후 4 ℃에서 15,000 rpm 으로 20 min 동안 원심분리하고 상층액을 취하여 단백질을 분리하였다. 분리한 단백질은 Bradford assay 방법에 따라 정량한 후 10% Bis-Tris gel을 사용하여 전기영동한 다음, PVDF membrane에 transfer시켰다. Membrane을 5% skim milk solution으로 1 h 동안 blocking한 뒤 primary antibody로 상온에서 3 ∼ 4 h 동안 반응시키고, horseradish peroxidase가 결합된 secondary antibody로 처리하였다.
해파리의 실험에 사용할 농도범위를 결정하기 위해 MTT assay를 시행하였다. 세포 수준의 연구에 많이 이용되고 있는 MTT assay는 cell proliferation과 viability의 in vitro 분석에 매우 유용하게 사용되고 있다 [21].
성능/효과
그 결과 Figure 4에서와 같이 100 µg/mL의 농도에서 tyrosinase와 TRP-1의 발현을 억제하는 것을 확인하였으며 TRP-2의 발현에는 영향 을 미치지 않는 것으로 확인되었다.
멜라닌 저해 작용기전을 확인하기 위하여 멜라닌 합성 관련 단백질의 발현 양상을 분석하였다. 그 결과 멜라닌 합성에 관여하는 효소인 tyrosinase, TRP-1의 단백질 발현을 억제하였다. 즉, N-NHE는 멜라닌 합성의 신호전달 경로 중 멜라닌 합성에 관여하는 효소 중 중요인자인 tyrosinase의 발현을 현저하게 감소시키며, TRP-1의 발현도 감소시킴으로써 멜라닌 합성을 저해 하는 것으로 사료된다.
그 결과, N-NHE에 의한 멜라닌 생성 억제가 농도 의존적 경향을 나타내었으며, N-NHE 100 µg/mL 농도에서 60% 감소하고 있음을 확인하였다.
마우스 melanoma 세포(B16F1)를 이용하여 세포 생존율을 확인한 결과, 4 가지 종류의 단백질분해효소 처리 시료(NHE) 모두가 100 µg/mL 이하의 농도에서 세포생존율이 90% 이상이 됨을 알 수 있었다.
그 결과 Figure 4에서와 같이 100 µg/mL의 농도에서 tyrosinase와 TRP-1의 발현을 억제하는 것을 확인하였으며 TRP-2의 발현에는 영향 을 미치지 않는 것으로 확인되었다. 이를 통해 해파리 가수분해물이 tyrosinase와 TRP-1의 단백질 발현 과정에서 영향을 받아 억제됨으로써 미백의 효능을 보임을 확인하였다.
그 결과 멜라닌 합성에 관여하는 효소인 tyrosinase, TRP-1의 단백질 발현을 억제하였다. 즉, N-NHE는 멜라닌 합성의 신호전달 경로 중 멜라닌 합성에 관여하는 효소 중 중요인자인 tyrosinase의 발현을 현저하게 감소시키며, TRP-1의 발현도 감소시킴으로써 멜라닌 합성을 저해 하는 것으로 사료된다.
즉, 멜라닌 저해활성이 농도 의존적 경향을 나타내었으며, N-NHE 100 µg/mL 농도에서 멜라닌 합성 이 89.9% 저해됨을 알 수 있었다.
nomurai) 가수분해물을 화장품의 새로운 미백소재로 이용하고자 해파리 추출물을 효소처리한 후 미백활성을 측정하고, 그 작용기전에 대해 확인하였다. 해파리 가수 분해물(NHE, N. nomurai Hydrolized Extract)의 B16-F1 melanoma cell을 이용한 멜라닌 합성 억제효과 측정 결과, Nutrase를 처리해 준 해파리가수분해물(N-NHE)이 가장 강력한 멜라닌 형성 억제효능을 보였다. N-NHE의 효능은 대조군인 arbutin 보다 우수하였다.
후속연구
이상의 결과로 보아 단백질분해효소 및 산(tartaric acid)으로 처리된 해파리 추출물(N-NHE)은 새로운 화장품 미백 소재로서의 활용가치가 있는 것으로 판단된다. 향후 N-NHE를 이용하여 활성 물질에 대한 분석 과 아울러 임상 수준에서 안정성 및 효능 연구를 진행 할 예정이다.
이상의 결과로 보아 단백질분해효소 및 산(tartaric acid)으로 처리된 해파리 추출물(N-NHE)은 새로운 화장품 미백 소재로서의 활용가치가 있는 것으로 판단된다. 향후 N-NHE를 이용하여 활성 물질에 대한 분석 과 아울러 임상 수준에서 안정성 및 효능 연구를 진행 할 예정이다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
멜라닌의 주 역할은 무엇인가?
피부의 멜라닌(melanin)은 사람의 피부색을 결정하는 색소(pigement)로서 과도하게 노출된 자외선(UV)으로부터 UV를 흡수하여 피부를 보호하는 역할을 하고 있다. 그러나, 오늘날 사람들의 야외활동 증가 등으로 인한 멜라닌의 과도한 형성은 기미(melasma), 검버섯(lentigo), 주근깨(freckles) 등 균일하지 못한 피부색을 형성하여 미용적인 불편함을 야기하며 의학적으로는 피부암과 같은 질병과 노화의 원인이 되기도 한다[1].
체내에서 멜라닌은 어떻게 합성되는가?
멜라닌은 표피층 내부에 자리잡은 멜라닌형성세포 (melanocyte)내 소기관인 멜라노좀(melanosome)에서 아미노산인 tyrosine을 출발물질로 하여 생합성된다. 멜라닌 색소는 노란색에서 붉은색을 보이는 pheome-lanin과 검은색에서 갈색을 띠는 eumelanin으로 구별된다[2].
노무라입깃해파리의 개체 수 급증은 어떤 악영향을 끼치고 있는가?
nomurai)는 한반도 주변 해역에서 자주 관찰되는 몸집이 큰 해파리이다. 최근 해수 온도의 상승 등으로 개체수가 급격히 증가하여 우리나라 연안에서 수산어구의 파귀와 어획물의 작업지연 등을 유발하여 정상적인 조업을 불가능하게 하고 있다. 해파리의 촉수는 독성을 띠고 있으며 해수욕객 등의 해파리 접촉에 의한 통증 유발 등은 사회적인 문제가 되고 있다. 따라서 수산업 분야 및 일상생활에 피해를 입히고 있는 해파 리의 방제뿐만 아니라, 수산자원의 산업적인 활용 방안에 대한 연구가 필요한 실정이다.
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