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문제 정의
- Weissella 속 유산균 검출의 차이를 이용한 한국산 및 중국산 김치 판별의 가능성 검토를 위하여 Weissella 속 9종 균주의 PCR 검출법을 개발하였다. 종(species) 수준에서의 Weissella 속 균주의 특이적 PCR 검출을 위한 primer는 recN 유전자의 염기서열을 이용하여 선정하였으며, 김치로부터 W.
- 본 연구에서는 특정 미생물의 특이적 검출을 이용한 중국산 김치 판별법 개발을 최종 목표로 W. confusa 및 W. soli 를 포함하는 Weissella 속 9종 균주의 PCR 검출법을 개발하였고, 중국산 김치 판별의 가능성을 검토하였다. Weissella 속 균주의 빠른 동정 및 검출을 위한 PCR 검출법에 사용된 종 수준의 특이적 PCR primer (Species-specific PCR primer) 의 개발에는 recN 유전자를 지표유전자로 사용하였다.
제안 방법
- Table 2에는 Weissella 속 균주들의 PCR 검출을 위한 primer의 염기서열과 annealing 온도를 나타내었다. PCR 산물은 2% agarose gel을 사용하여 전기영동한 후, ethidium bromide 용액으로 염색하여 band를 확인하였다.
- PCR은 50 µL 반응계에서 10 ng template DNA, 0.1 mM dNTP, 1.25 U Taq polymerase (RBC Bioscience, Taipei, Taiwan) 및 각 primer를 10 pmol 농도로 첨가하여 T3000 thermal cycler (Biometra, Germany)를 사용하여 수행하였다.
- Weissella 속 균주의 특이적 검출을 위한 PCR primer는 Leuconostocaceae과(family)에 속해 있어 Weissella 속과 근연 관계에 있는 Oenococcus 및 Leuconostoc 속 유산균들과 김치에서 많이 검출되는 Lactobacillus 속 균주들 중에서 GenBank에 등록된 recN 유전자 염기서열을 PHYDIT program (http://plaza.snu.ac.kr/~jchun/phydit/)을 이용하여 정렬한 후, 종 수준에서 각 균주에 특이적인 부분을 선정하여 제작하였다. Table 1에는 primer 제작에 사용한 recN 유전자의 accession number를 균주 별로 정리하였다.
- 한국산 및 중국산 김치에 특이적으로 존재하는 Weissella 속 균주의 검출을 위해 사용된 김치시료는 본 연구자들이 발효 초기 한국산 및 중국산 김치의 bacteria 다양성 평가를 위해 선행연구에서 수집한 한국산 및 중국산 김치시료의 여과액을 냉동보존하였다가 해동하여 사용하였다[8]. 김치국물 여과액 4 mL을 원심분리하여 균체를 회수한 다음, Genome DNA extraction kit (Axygen)을 사용하여 DNA를 추출하였고, 추출한 DNA는 spectrophotometer를 이용하여 정량하였다.
- 김치시료로부터 추출한 DNA를 이용한 PCR 검출 결과에 따라 한국산 및 중국산 김치시료 각각 15종을 대상으로 20 ng의 template DNA 농도를 적용하여 특이적 PCR (Speciesspecific PCR)을 수행, 4종 Weissella 속 균주의 존재를 확인하였다. 한국산 김치의 경우, W.
- soli로 한정하였다. 김치시료에 존재하는 4종 Weissella 속 균주의 특이적 PCR 검출에 앞서 recN 유전자의 특이적 증폭에 필요한 김치시료 유래 DNA의 농도를 결정하였다. 이들 4종의 검출을 위해 사용한 template DNA는 각 균주들이 검출된 선행연구에 근거하여 각 균주들이 가장 많이 검출된 시료로부터 추출하였다.
- 선정된 primer pair가 종 수준에서의 Weissella 속 균주 검출 및 동정에 유용한 것으로 확인됨에 따라 한국산 및 중국산 김치를 대상으로 Weissella 속 균주들의 PCR 검출을 시도하였다. 검출 대상은 Weissella 속 균주 중에서 김치에서 빈번하게 검출되는 W.
- 실험에 사용한 균주의 total DNA는 MRS 배지에서 30℃, 24시간 배양한 균체로부터 Genome DNA extraction kit (Axygen, CA, USA)을 사용하여 추출하였다. PCR은 50 µL 반응계에서 10 ng template DNA, 0.
- koreensis KK0101 균주를 사용하였다. 유산균주들은 MRS broth (Difco, USA)를 사용하여 30℃ 미호기적 조건에서 배양하였으며, 고체배지의 제조에는 한천을 1.5% (w/v) 첨가하였다.
- 김치시료에 존재하는 4종 Weissella 속 균주의 특이적 PCR 검출에 앞서 recN 유전자의 특이적 증폭에 필요한 김치시료 유래 DNA의 농도를 결정하였다. 이들 4종의 검출을 위해 사용한 template DNA는 각 균주들이 검출된 선행연구에 근거하여 각 균주들이 가장 많이 검출된 시료로부터 추출하였다. PCR법을 통해 검출 가능한 DNA의 최소농도 결정을 위해 김치로부터 추출한 DNA를 단계적으로 희석하여 PCR을 수행한 결과, W.
대상 데이터
- 선정된 primer pair가 종 수준에서의 Weissella 속 균주 검출 및 동정에 유용한 것으로 확인됨에 따라 한국산 및 중국산 김치를 대상으로 Weissella 속 균주들의 PCR 검출을 시도하였다. 검출 대상은 Weissella 속 균주 중에서 김치에서 빈번하게 검출되는 W. cibaria와 W. koreensis 그리고, 본 연구자들의 선행연구에서 한국산 김치 및 중국산 김치로부터 각각 특이적으로 검출된 W. confusa 및 W. soli로 한정하였다. 김치시료에 존재하는 4종 Weissella 속 균주의 특이적 PCR 검출에 앞서 recN 유전자의 특이적 증폭에 필요한 김치시료 유래 DNA의 농도를 결정하였다.
- 본 실험에 사용한 표준균주(type strain)는 Korean Collection for Type Cultures (KCTC), Korean Culture Center for Microorganisms (KCCM), ATCC the global bioresource center로부터 구입하였다(Table 1). 그러나 W. koreensis 표준 균주는 특허균주로 등록되어 분양이 불가한 관계로 본 연구자들이 한국산 김치로부터 직접 분리 동정한 W. koreensis KK0101 균주를 사용하였다. 유산균주들은 MRS broth (Difco, USA)를 사용하여 30℃ 미호기적 조건에서 배양하였으며, 고체배지의 제조에는 한천을 1.
- 본 실험에 사용한 표준균주(type strain)는 Korean Collection for Type Cultures (KCTC), Korean Culture Center for Microorganisms (KCCM), ATCC the global bioresource center로부터 구입하였다(Table 1). 그러나 W.
- 한국산 및 중국산 김치에 특이적으로 존재하는 Weissella 속 균주의 검출을 위해 사용된 김치시료는 본 연구자들이 발효 초기 한국산 및 중국산 김치의 bacteria 다양성 평가를 위해 선행연구에서 수집한 한국산 및 중국산 김치시료의 여과액을 냉동보존하였다가 해동하여 사용하였다[8]. 김치국물 여과액 4 mL을 원심분리하여 균체를 회수한 다음, Genome DNA extraction kit (Axygen)을 사용하여 DNA를 추출하였고, 추출한 DNA는 spectrophotometer를 이용하여 정량하였다.
성능/효과
- 이들 4종의 검출을 위해 사용한 template DNA는 각 균주들이 검출된 선행연구에 근거하여 각 균주들이 가장 많이 검출된 시료로부터 추출하였다. PCR법을 통해 검출 가능한 DNA의 최소농도 결정을 위해 김치로부터 추출한 DNA를 단계적으로 희석하여 PCR을 수행한 결과, W. cibaria는 10 ng, W. koreensis는 20 ng 농도에서 그리고 W. confusa와 W. soli는 1 ng 농도에서 검출이 가능하였다(Fig. 2). 따라서 김치시료에 존재하는 Weissella 속 균주의 종 수준에서의 검출을 위한 template DNA는 20 ng을 적용하였다.
- Table 2에는 Weissella 속 9종 균주의 빠른 동정 및 검출을 위해 최종적으로 결정된 recN 유전자 특이적 PCR primer, PCR 산물의 크기, annealing 온도를 정리하였다. Table 1에나타낸 8종의 Weissella 속 표준균주 및 W. koreensis KK0101, 그리고 김치에서 자주 검출되는 Lactobacillus 속 균주 6종, Weissella 속과 근연 관계에 있는 Oenococcus 및 Leuconostoc 속의 5종 표준균주를 대상으로 PCR을 수행한 결과, 각각의 primer pair에 의해 W. cibaria, W. confusa, W. hellenica, W. kandleri, W. koreensis, W. minor, W. soli, W. thailandensis, W. viridescens 특이적인 PCR 산물이 증폭되었으며, 증폭된 PCR 산물의 크기도 예상과 일치하였다(Fig. 1). 또한 증폭산물의 염기서열 결정을 통하여 각 균주에 해당하는 증폭산물이 생성된 것을 확인하였다.
- 3). W. cibaria와 W. confusa 는 7종 이상의 한국산 및 중국산 김치로부터 검출되었고, W. koreensis와 W. soli는 중국산 김치에서 빈번하게 검출되었다. 한국산 김치보다 다수의 중국산 김치에서 검출된 W.
- 또한 증폭산물의 염기서열 결정을 통하여 각 균주에 해당하는 증폭산물이 생성된 것을 확인하였다. 그러나 증폭 대상 균주를 제외한 다른 균주들로부터는 각 primer pair에 의한 증폭산물이 형성되지 않아 recN 유전자 특이적 PCR이 Weissella 속 균주들의 종 수준에서의 특이적 검출 및 동정에 이용될 수 있음을 확인하였다.
- soli가 11개 시료로부터 검출되어 73% 확률로 검출빈도가 높아졌다. 따라서 PCR 검출법의 적용으로 W. confusa는 김치의 원산지 판별을 위한 검출 대상이 되지 못하는 것으로 나타났지만, W. soli의 검출에 대한 신뢰도는 높아진 것으로 사료된다. W.
- 그러나 원료에서 유래하는 다양한 미생물이 발효 초기에 존재할 것이고, 이들 미생물은 원재료가 재배된 원산지의 환경을 반영한다. 따라서 한국산 및 중국산 김치에 존재하는 bacteria 다양성의 차이가 예상되며 그 차이는 발효가 진행되어 유산균이 증가하기 전단계에서 현저하게 나타날 것으로 추정된다. 본 연구자들은 bacteria의 16S ribosomal RNA 유전자(16S rDNA) 상동성을 이용한 계통발생학적 동정을 통하여 pH 5 이상의 발효 초기 한국산 및 중국산 김치에서 분리한 bacteria의 다양성을 평가한 선행연구를 통하여 한국산 김치에서는 Weissella confusa, 중국산 김치에서는 Weissella soli가 특이적으로 검출되는 결과를 얻게 되었다[8].
- 1). 또한 증폭산물의 염기서열 결정을 통하여 각 균주에 해당하는 증폭산물이 생성된 것을 확인하였다. 그러나 증폭 대상 균주를 제외한 다른 균주들로부터는 각 primer pair에 의한 증폭산물이 형성되지 않아 recN 유전자 특이적 PCR이 Weissella 속 균주들의 종 수준에서의 특이적 검출 및 동정에 이용될 수 있음을 확인하였다.
- confusa가 한국산 김치에서만 검출되었지만, 추출한 DNA를 이용하는 PCR 검출법을 적용한 경우 중국산 김치에서도 검출되었고, 김치시료 별 Weissella 속 4종 균주의 PCR 검출 결과가 배양법을 적용한 결과와 다소 차이가 있는 것으로 나타났다. 배양법과 배양 비의존적 방법의 결과가 일치하는 확률은 한국산 김치의 경우 W. cibaria 60%, W. confusa 80%, W. koreensis 67%, W. soli 100%로 나타났고, 중국산 김치의 경우 W. cibaria 80%, W. confusa 53%, W. koreensis 47%, W. soli 33%의 일치를 보였다. 중국산 김치보다는 한국산 김치의 분석 결과가 높은 일치를 보인 점은 선행연구에서 중국산 김치의 미생물상이 한국산에 비해 다양한 것으로 분석된 결과와 관련이 있는 것으로 한국산 김치의 미생물상이 중국산에 비해 안정적인 것으로 추정된다[8].
- Table 3에는 배양법을 이용하여 미생물을 검출한 선행연구의 결과와 시료로부터 추출한 DNA에 존재하는 특정 미생물의 DNA를 PCR로 검출하는 배양 비의존적 방법의 적용 결과를 정리하였다[8]. 배양법을 통하여 발효 초기 한국산 및 중국산 김치의 bacteria 다양성을 평가한 선행연구에서는 W. confusa가 한국산 김치에서만 검출되었지만, 추출한 DNA를 이용하는 PCR 검출법을 적용한 경우 중국산 김치에서도 검출되었고, 김치시료 별 Weissella 속 4종 균주의 PCR 검출 결과가 배양법을 적용한 결과와 다소 차이가 있는 것으로 나타났다. 배양법과 배양 비의존적 방법의 결과가 일치하는 확률은 한국산 김치의 경우 W.
- 본 연구에서 수행한 특정 미생물의 특이적 검출을 이용한 중국산 김치의 판별은 지표미생물의 선정 과정에서 중국으로부터 수입된 배추와 부재료를 사용한 경우 및 소금에 절여 수입된 절임배추로 한국에서 제조한 김치에 대한 고려가 없었다는 점과 W. soli가 모든 중국산 김치시료로부터 검출되지 않는다는 점에서 한계점을 가지고 있지만, 미생물 군집의 차이를 이용한 새로운 과학적 검증법이 제시되어 그 가능성이 검토되었다는 점에서 의의를 가지고 있다.
- 따라서 한국산 및 중국산 김치에 존재하는 bacteria 다양성의 차이가 예상되며 그 차이는 발효가 진행되어 유산균이 증가하기 전단계에서 현저하게 나타날 것으로 추정된다. 본 연구자들은 bacteria의 16S ribosomal RNA 유전자(16S rDNA) 상동성을 이용한 계통발생학적 동정을 통하여 pH 5 이상의 발효 초기 한국산 및 중국산 김치에서 분리한 bacteria의 다양성을 평가한 선행연구를 통하여 한국산 김치에서는 Weissella confusa, 중국산 김치에서는 Weissella soli가 특이적으로 검출되는 결과를 얻게 되었다[8]. 이러한 결과는 W.
- 실험법에 관계 없이 한국산 김치로부터는 W. cibaria, W. confusa, W. koreensis가 검출되었지만, W. soli는 검출되지 않았다. 한편 중국산 김치로부터는 PCR 검출법의 적용에 의해 배양법에 의하여 검출되지 않았던 W.
- Weissella 속 유산균 검출의 차이를 이용한 한국산 및 중국산 김치 판별의 가능성 검토를 위하여 Weissella 속 9종 균주의 PCR 검출법을 개발하였다. 종(species) 수준에서의 Weissella 속 균주의 특이적 PCR 검출을 위한 primer는 recN 유전자의 염기서열을 이용하여 선정하였으며, 김치로부터 W. cibaria, W. confusa, W. koreensis, W. soli를 모두 검출하기 위해서는 20 ng template DNA가 필요한 것으로 나타났다. 한국산 김치시료로부터는 W.
- koreensis는 4종의 김치에서 검출되었지만, W soli는 검출되지 않았다. 중국산 김치에서는 W. cibaria가 8종, W. confusa는 7종, W. koreensis는 11종, W. soli는 11종의 김치로부터 검출되었다(Fig. 3). W.
- soli는 중국산 김치에서 빈번하게 검출되었다. 한국산 김치보다 다수의 중국산 김치에서 검출된 W. koreensis와 W. soli는 발효 초기의 한국산 김치에서는 상대적으로 적은 양이 존재하거나 존재하지 않는 것으로 나타났다.
- 김치시료로부터 추출한 DNA를 이용한 PCR 검출 결과에 따라 한국산 및 중국산 김치시료 각각 15종을 대상으로 20 ng의 template DNA 농도를 적용하여 특이적 PCR (Speciesspecific PCR)을 수행, 4종 Weissella 속 균주의 존재를 확인하였다. 한국산 김치의 경우, W. cibaria는 8종, W. confusa 는 9종, W. koreensis는 4종의 김치에서 검출되었지만, W soli는 검출되지 않았다. 중국산 김치에서는 W.
- soli는 검출되지 않았다. 한편 중국산 김치로부터는 PCR 검출법의 적용에 의해 배양법에 의하여 검출되지 않았던 W. confusa가 검출되었을 뿐만 아니라, 배양법을 적용하였을 경우 15개 시료 중 3개 시료에서 검출되었던 W. soli가 11개 시료로부터 검출되어 73% 확률로 검출빈도가 높아졌다. 따라서 PCR 검출법의 적용으로 W.
후속연구
- 본 연구자들은 bacteria의 16S ribosomal RNA 유전자(16S rDNA) 상동성을 이용한 계통발생학적 동정을 통하여 pH 5 이상의 발효 초기 한국산 및 중국산 김치에서 분리한 bacteria의 다양성을 평가한 선행연구를 통하여 한국산 김치에서는 Weissella confusa, 중국산 김치에서는 Weissella soli가 특이적으로 검출되는 결과를 얻게 되었다[8]. 이러한 결과는 W. confusa 또는 W. soli의 빠른 검출을 이용하여 김치 원산지 판별을 위한 과학적 검증법이 개발될 수 있음을 시사한다.
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