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문제 정의
- 본 연구에서는 다양한 생리활성 물질, 미네랄, 수용성 탄수화물인 펙틴을 함유하고 있는 사과박, 당근박, 포도박 및 감귤박을 이용하는 미생물을 동정하였고, 이들 균주들을 접종하여 주스박을 고체발효 시키면서 말의 영양적 사료가치를 알아보고자 하였다.
- 본 연구에서는 주스박에 토착하고 있는 미생물을 분리하고 이를 발효에 이용하여 사료적 가치를 평가하고자 하였다. 주스박과 대두박을 원료로 하여 바실러스, 효모 그리고 유산균을 혼합 접종하여 수분 60%에서 고체발효 후의 pH변화, 총 균수의 변화와 같은 발효특성과 원료의 시간대별 일반성분의 변화를 확인하고자 하였다.
제안 방법
- 감귤박의 경우에는 Lactobacillus plantarum SK1305를 이용하였다 (Niu, 2015). 고체발효를 진행하기 위해서 121℃에서 15분간 멸균한 주스박과 대두박을 4:6으로 혼합하였으며 발효 0시간에 바실러스, 12시간에 효모 그리고 24시간째에 유산균을 각각 단계적으로 접종하여 발효를 진행하였다 (Fig. 1). 발효 조건은 수분 60%로 하여 35℃에서 48시간 동안 진행하였다.
- 5를 고려하여 2단계로 접종하였다. 마지막으로 pH 4.0 이하에서도 생존할 수 있는 유산균을 3단계로 접종하였다. Fig.
- 이들 균주 중에서 발효에 유용하게 사용할 수 있는 바실러스와 유산균을 선별하였다. 바실러스, 효모 그리고 유산균을 3단계로 12시간 간격으로 각각 순서에 따라 접종하였다. 각 균주의 접종이후 12시간부터는 총 균수가 각각 108 이상으로 유지하였다.
- 발효초기인 1단계에는 다양한 환경에서 잘 성장하는 바실러스균을 접종하였으며, 효모의 적정 pH 범위인 5.0∼5.5를 고려하여 2단계로 접종하였다.
- 주스박과 대두박을 원료로 하여 바실러스, 효모 그리고 유산균을 혼합 접종하여 수분 60%에서 고체발효 후의 pH변화, 총 균수의 변화와 같은 발효특성과 원료의 시간대별 일반성분의 변화를 확인하고자 하였다. 사과박, 당근박, 포도박, 감귤박에서 발효에 이용하기 위한 토착균주들을 분리, 동정하였으며 분리균 중 Lactobacillus plantarum, Weissella cibaria 및 Bacillus subtilis를 선택하여 농산부산물 고체발효에 이용하였다. 발효 주스박의 원료로는 사과박, 당근박, 포도박, 감귤박과 각 박을 동일비율로 혼합한 혼합박을 이용하여 5개의 시험구를 구성하였다.
- 주스박을 말 사료 용으로 이용하고자 이에 적합한 유용한 균주를 동정하였다. 사과박, 포도박, 당근박에 더러브렛 말의 분을 접종한 후 여기에서 자라는 우점균 그리고 말분변에서 직접 균을 분리하였다. 결과적으로 각각 6종, 5종, 1종 및 4종의 세균들을 분리하였다 (Table 2).
- 시간대별로 샘플링한 각 샘플을 15 mL conical tube에 옮긴 후, 증류수와 샘플을 9:1로 희석한 후 pH/ISE meter 735P (Istek, Republic of Korea)로 측정하였다. 생균수의 변화는 MRS, LB, YM (Difco, USA) 평판배지에서 측정하였다. 각 시간대별 시료 1g을 멸균 증류수 9 ㎖에 넣은 후 균질화 과정을 거쳐 순차적으로 희석하였다.
- 형성된 콜로니들을 육안으로 관찰하여 형태학적으로 서로 상이한 콜로니들을 분리하여 실험에 사용하였다. 선발된 균주는 16S rDNA 유전자 서열 분석을 분석하여, BLAST 검색을 통해 상동성을 조사하였다.
- 시간대별로 샘플링한 각 샘플을 15 mL conical tube에 옮긴 후, 증류수와 샘플을 9:1로 희석한 후 pH/ISE meter 735P (Istek, Republic of Korea)로 측정하였다. 생균수의 변화는 MRS, LB, YM (Difco, USA) 평판배지에서 측정하였다.
- 발효 주스박의 원료로는 사과박, 당근박, 포도박, 감귤박과 각 박을 동일비율로 혼합한 혼합박을 이용하여 5개의 시험구를 구성하였다. 위의 박들을 대두박과 2:3의 비율로 혼합하였으며 수분은 60%로 하여 발효 출발점에 바실러스, 12시간대에 효모 그리고 24시간에 유산균을 단계적으로 접종하여 35℃에서 총 48시간 동안 발효하였다.
- 젖산의 함량은 Amplite™ Colorimetric L-Lactate Assay Kit (AAT Bioquest®, CA, USA)를 이용하여 분석하였으며, 건물량 (Dry matter: DM)은 60℃ dry oven (WFO-600SD, EYELA, Japan) 에서 하루 동안 건조하여 건조 전과 후의 무게를 통해 계산하였으며, 중성세제 불용성 섬유소 (Neutral detergent fiber: NDF)와 산성세제 불용성 섬유소 (Acid detergent fiber: ADF)는 ANKOM 200 fiber analyzer (ANKOM Technology, USA)를 이용하여 매뉴얼에 따라 분석하였다.
- 본 연구에서는 주스박에 토착하고 있는 미생물을 분리하고 이를 발효에 이용하여 사료적 가치를 평가하고자 하였다. 주스박과 대두박을 원료로 하여 바실러스, 효모 그리고 유산균을 혼합 접종하여 수분 60%에서 고체발효 후의 pH변화, 총 균수의 변화와 같은 발효특성과 원료의 시간대별 일반성분의 변화를 확인하고자 하였다. 사과박, 당근박, 포도박, 감귤박에서 발효에 이용하기 위한 토착균주들을 분리, 동정하였으며 분리균 중 Lactobacillus plantarum, Weissella cibaria 및 Bacillus subtilis를 선택하여 농산부산물 고체발효에 이용하였다.
- 주스박을 말 사료 용으로 이용하고자 이에 적합한 유용한 균주를 동정하였다. 사과박, 포도박, 당근박에 더러브렛 말의 분을 접종한 후 여기에서 자라는 우점균 그리고 말분변에서 직접 균을 분리하였다.
- 주스박을 영양분으로 이용하는 말 장내에 서식하는 유용한 균을 분리하기 위해 상기의 사과박, 포도박, 당근박의 각 1 g을 미네랄 용액 (KH2PO4 0.07 g, MgSO4 0.07 g, NaCH3CO2 0.07 g, NaCl 0.07 g, Distilled water 0.7 L) 9 ㎖로 희석하여 여기에 더러브렛 말의 분을 멸균증류수로 10배 희석한 것을 1 ㎖ 접종하였다. 그 후 30℃ 진탕배양기 (BF-60SIRL, Biofree, Korea)에서 3일간 배양하였다.
- 주스박의 효과적인 발효를 위해서 바실러스, 효모 그리고 유산균의 순으로 각각 접종하였다 (Fig. 1). 발효초기인 1단계에는 다양한 환경에서 잘 성장하는 바실러스균을 접종하였으며, 효모의 적정 pH 범위인 5.
- 각 시간대별 시료 1g을 멸균 증류수 9 ㎖에 넣은 후 균질화 과정을 거쳐 순차적으로 희석하였다. 희석한 상등액 100 ㎕를 MRS, LB, YM plate에 각각 분주하여 MRS, LB는 35℃, YM은 30℃ 항온 배양기에서 24시간동안 배양한 후 colony 수를 log10 CFU/g로 계산하였다.
대상 데이터
- 본 연구에서는 분리한 유용균주 중에 Lactobacillus plantarum SK3873, Lactobacillus plantarum SK3893, Weissella cibaria SK3880 및 Bacillus subtilis SK3889를 선택하여 주스박의 고체 발효에 이용하였다. 감귤박의 경우에는 Lactobacillus plantarum SK1305를 이용하였다 (Niu, 2015). 고체발효를 진행하기 위해서 121℃에서 15분간 멸균한 주스박과 대두박을 4:6으로 혼합하였으며 발효 0시간에 바실러스, 12시간에 효모 그리고 24시간째에 유산균을 각각 단계적으로 접종하여 발효를 진행하였다 (Fig.
- 시험재료로 이용한 주스박은 사과박, 당근박, 포도박 그리고 감귤박을 이용하였다. 모든 원료들은 일반 시장 (서울시 광진구)에서 구입하였으며 세척한 후 착즙기 (Ang-7700, Angeljuicer, Busan, Korea)를 이용하여 착즙하고 나오는 잔류 부산물을 이용하였다.
- 사과박, 당근박, 포도박, 감귤박에서 발효에 이용하기 위한 토착균주들을 분리, 동정하였으며 분리균 중 Lactobacillus plantarum, Weissella cibaria 및 Bacillus subtilis를 선택하여 농산부산물 고체발효에 이용하였다. 발효 주스박의 원료로는 사과박, 당근박, 포도박, 감귤박과 각 박을 동일비율로 혼합한 혼합박을 이용하여 5개의 시험구를 구성하였다. 위의 박들을 대두박과 2:3의 비율로 혼합하였으며 수분은 60%로 하여 발효 출발점에 바실러스, 12시간대에 효모 그리고 24시간에 유산균을 단계적으로 접종하여 35℃에서 총 48시간 동안 발효하였다.
- 본 연구에서는 분리한 유용균주 중에 Lactobacillus plantarum SK3873, Lactobacillus plantarum SK3893, Weissella cibaria SK3880 및 Bacillus subtilis SK3889를 선택하여 주스박의 고체 발효에 이용하였다. 감귤박의 경우에는 Lactobacillus plantarum SK1305를 이용하였다 (Niu, 2015).
- 시험재료로 이용한 주스박은 사과박, 당근박, 포도박 그리고 감귤박을 이용하였다. 모든 원료들은 일반 시장 (서울시 광진구)에서 구입하였으며 세척한 후 착즙기 (Ang-7700, Angeljuicer, Busan, Korea)를 이용하여 착즙하고 나오는 잔류 부산물을 이용하였다.
- 주스박을 이용한 말용 사료를 개발하기 위해 사과박, 당근박, 포도박 그리고 말분변을 접종하였을 때 이들을 이용하는 우점 균주를 분리할 수 있었다. 이들 균주 중에서 발효에 유용하게 사용할 수 있는 바실러스와 유산균을 선별하였다. 바실러스, 효모 그리고 유산균을 3단계로 12시간 간격으로 각각 순서에 따라 접종하였다.
- 도말된 plate는 MRS plate와 LB plate는 35℃에서 배양하였고 YM plate는 30℃에서 배양하였다. 형성된 콜로니들을 육안으로 관찰하여 형태학적으로 서로 상이한 콜로니들을 분리하여 실험에 사용하였다. 선발된 균주는 16S rDNA 유전자 서열 분석을 분석하여, BLAST 검색을 통해 상동성을 조사하였다.
데이터처리
- 통계분석은 SAS (Statistical Analysis System, Version 9.1, USA) program package를 이용하여 각 처리구간의 평균값을 Duncan's multiple range test를 실시하면서 시간대별 각 부산물의 영양성분 변화를 비교 검정하였다 (Steel and Torrie, 1980).
성능/효과
- 45였다. 12시간에서 4.79, 4.72, 5.01, 4.72 및 4.52로 감소하였고, 48시간대의 최종 pH는 사과박이 4.47, 당근박이 4.41, 포도박이 4.66, 감귤박이 4.56 그리고 혼합한 박은 4.40의 값을 보였다. 48시간에 당근박이 발효전과 비교하였을 때 1.
- 2B). 24시간 이후부터 사과박과 당근박은 109 CFU/g를 유지하였고, 포도박은 36시간까지 109을 유지하다 48시간부터 108 CFU/g으로 감소하였다. 또한 감귤박은 36시간까지 108 CFU/g을 유지하다 48시간부터 109으로 증가하였다.
- 40의 값을 보였다. 48시간에 당근박이 발효전과 비교하였을 때 1.82차로 가장 많이 감소하였으며, 혼합한 박은 0.89로 가장 작은 변화를 보였다. 대두박을 Bacillus amyloliquefaciens, Lavtobacillus acidophilus, Lavtobacillus plantarum과 Saccharomyces cerevisiae을 이용하여 각각 접종하여 고체발효한 연구에서 발효 전 대두박의 pH인 6.
- ADF는 전반적으로 발효 시간에 따라 큰 변화를 보이지 않았으나, 사과박은 발효초기에 비해 12시간 때부터 급격히 감소하는 경향을 보였다 (p<0.10).
- NDF와 ADF 측정결과 NDF는 모든 쥬스박에서 발효 후 12시간에서 많은 감소를 보였으며, 24시간부터 서서히 감소 또는 같은 수준으로 유지를 하였다 (Fig. 6). ADF는 발효 시간에 따라 변화를 거의 보이지 않았다.
- 사과박, 포도박, 당근박에 더러브렛 말의 분을 접종한 후 여기에서 자라는 우점균 그리고 말분변에서 직접 균을 분리하였다. 결과적으로 각각 6종, 5종, 1종 및 4종의 세균들을 분리하였다 (Table 2). 사과박에서는 Lactobacillus plantarum, Enterococcus casseliflavus, Lactococcus lactis, Meyerozyma sp.
- 고체발효 동안 젖산함량을 측정한 결과 (Fig. 4), 발효 전 부산물중 감귤박과 혼합박의 젖산의 함량은 214.95 mMol/g 와 219.06 mMol/g으로 다른 처리구에 비해 높았다 (p<0.05).
- 따라서 본 연구에서도 발효 12시간에 pH가 4.5∼5.0의 범위는 hemicellulose 분해 효소의 적정 pH로 사료된다.
- 모든 주스박 부산물이 36시간 이후 109을 유지하였으며, 전반적으로 발효 시간에 따른 총 균수는 108 ∼109 CFU/g을 유지하여 분리한 유용균에 의한 발효가 우수하다고 판단되었다.
- 바실러스는 발효 초기에 비해 12시간 후까지 증가하였고, 포도박에서는 균수가 일정하게 증가하는 경향을 보였다.
- 발효 시간대별 NDF는 발효 12시간째 모든 주스박에서 많은 감소를 보였으며 24시간부터 서서히 감소 또는 유지를 하였으며, 24시간대에는 포도박과 사과박이 가장 높은 경향을 보였다(p<0.10).
- 발효 시간에 따른 건물함량은 초기 건물함량인 60%에서 12, 24시간 발효 후 당근박의 건물함량이 각각 54.84%, 56.66%로 다른 처리구들보다 유의적으로 높은 값을 보였으며(p<0.05), 포도박은 45.3%, 44.15%로 낮은 건물량을 보였다(p<0.05).
- 발효 시간에 따른 건물함량을 측정한 결과 (Fig. 5), 초기 건물함량인 60%에서 12, 24시간 발효 후 당근박의 건물함량 이 각각 54.84%, 56.66%로 다른 처리구와 비교하여 유의적으로 높은 값을 보였으며, 포도박은 다른 처리구에 비해 43.26%, 45.3%, 44.15% 그리고 45.1%로 낮은 건물량을 보였다 (p<0.05).
- 발효 시간에 따른 생균수를 조사한 결과 발효 최초 접종시 초기 균수인 107에 비해 12, 24 그리고 48시간 발효 후에 모든 처리구에서 108∼109로 증식되면서 발효가 지속적으로 진행되어 선별한 균주와 단계별 균주의 접종조건이 주스박을 발효함에 있어 적합한 것으로 판단되었다.
- 발효 시간에 따른 조회분은 쥬스박 별로 차이를 보이지 않았으나 (p<0.05), 전체적으로 감소되는 경향을 보였다.
- 발효에 의한 pH변화는 발효 전후에서 사과박, 당근박, 포도박, 감귤박 그리고 혼합박에서 각각 6.25→4.47, 6.23→4.41, 6.12→4.66, 5.49→4.56 그리고 5.45→4.40로 낮아지는 변화를 보였다.
- , 2009). 본 연구에서 바실러스, 효모 그리고 유산균의 단계적 접종 이후 주스박 고체발효 내 생균수가 발효 이전 보다 모두 증가하였다. 발효 48시간까지 생균수를 높게 유지하였으므로 사용한 균주들은 주스박의 섬유소 이용성이 우수한 생균제로로 판단된다.
- , 2012). 본 연구에서 전반적으로 건물량은 원물의 20%정도 감소되었으며, 발효 시간에 따라서는 큰 영향을 보이지 않았다.
- 또한 말의 분에서는 Bacillus subtilis, Bacillus aerius, Bacillus cereus와 Weissella confusa를 분리하였다. 유산균은 Lactobacillus, Lactococcus, Enterococcus, Pediococcus, Weissella 등이 동정되었고, 효모는 Meyerozyma과 Hanseniaspora, 고초균은 Bacillus subtilis와 Bacillus aerius를 분리하였다. Lactobacillus plantarum, Bacillus subtilis, Weissella 등은 생균제로 활용한 보고가 많으며 (Nguyen et al.
- 05). 전체적으로는 발효 시간에 따라 조회분은 감소되는 경향을 보였다. 대두박을 Bacillus amyloliquefaciens, Lactobacillus.
후속연구
- 각 균주의 접종이후 12시간부터는 총 균수가 각각 108 이상으로 유지하였다. 48시간 배양 후는 바실러스, 효모 그리고 유산균이 거의 균등하게 성장하였으며 이러한 주스박 발효물을 이용하여 말 사료로 이용하면 식품부산물을 사료자원으로 이용할 수 있을 뿐만 아니라 말을 위한 생균제의 급여로 말의 장내에서 유익한 균총의 유지에 도움이 될 수 있을 것으로 기대된다.
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